Microescala Electroporator para entrega Sequential Molecular assistida por Vortex

Summary

Um vórtice microfluídico plataforma eletroporação assistida foi desenvolvido para entrega seqüencial de múltiplas moléculas em populações de células idênticas, com controle de dosagem precisa e independente. Tamanho com base etapa de purificação de células alvo eletroporação anterior do sistema auxiliado para aumentar a eficiência de entrega molecular e viabilidade celular processado.

Abstract

A electroporação tem recebido crescente atenção nos últimos anos, porque é uma técnica muito potente para a introdução de sondas moleculares exógenas fisicamente não permeantes em células. Este trabalho apresenta uma plataforma microfluídica eletroporação capaz de realizar múltiplas entrega molécula para células de mamíferos com controle de parâmetro preciso e molecular dependente. A capacidade do sistema para isolar células com distribuição de tamanho uniforme permite menos variação na eficiência eletroporação per dada intensidade do campo elétrico; por conseguinte, melhorada a viabilidade da amostra. Além disso, o recurso de visualização do processo permite a observação do processo molecular fluorescente captação em tempo real, que permite ajustes de parâmetros entrega moleculares rápidas in situ para aumento de eficiência. Para mostrar as vastas capacidades da plataforma relatado, macromoléculas com diferentes tamanhos e cargas elétricas (por exemplo, dextrano com MW de 3.000 e 70.000 Da) foramentregues para as células do câncer de mama metastático com alta eficiência de entrega (> 70%) para todas as moléculas testadas. A plataforma desenvolvida provou o seu potencial para uso na expansão de campos de pesquisa onde on-chip técnicas de eletroporação pode ser benéfico.

Introduction

Nos últimos anos, a utilização de impulsos eléctricos para facilitar a entrega de moléculas extracelulares citosólica tornou-se um meio atractivo de manipulação de células de mamífero. ^Uma Este processo, também conhecido como electroporação, reversivelmente, permeabiliza a membrana celular, permitindo que as moléculas de membrana inerentemente impermeáveis ​​para aceder ao meio intracelular das células. Como virtualmente qualquer molécula pode ser introduzida no citossol através de poros criados temporárias na membrana de qualquer tipo de células, utilizando a electroporação, a técnica tem sido relatada como sendo mais reprodutível, de aplicação universal,....

Protocol

1. celular Preparação

1. Placa 1 × 10 ⁵ células / ml de linha celular de cancro da mama metastático MDA-MB-231 em um volume de 10 ml por frasco de cultura T75 tecido em meio L-15 de Leibovitz suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e 1 % de penicilina-estreptomicina.
2. Incubar MDA-MB-231 numa incubadora humidificada a 37 ° C, com 0% de CO ₂ ambiente.
3. Células colheita para experiências 2 dias após a sementeira por tratamento de células com 0,25% de tripsina-EDTA durante 2 min e inactivar a actividade enzimática da tripsina por adição de 8 mL de meio de crescimento.
4. Células de pelotas por centrifugação....

Results

O electroporator microfluídica paralelo desenvolvido entregues macromoléculas com tamanhos variados e cargas elétricas em células de câncer de mama metastático vivo. Entrega bem sucedida molecular foi qualitativamente determinado monitorizando alterações na intensidade de fluorescência de células electroporadas em órbita in situ e confirmado por medidas quantitativas por meio de análise de citometria de fluxo. Figura 4A mostra que 90% das células tratadas com a absorção de 70.000 Da dextrano ne.......

Discussion

Com a nova plataforma eletroporação paralelizado, o aumento de 10 vezes na produtividade e eficiência da prestação de multi-molécula foi alcançado, além de todas as vantagens que o sistema de câmara única previamente desenvolvido proporciona. ¹⁸ méritos Anteriormente disponíveis incluem: (i) pré-purificação de as células alvo e com distribuição uniforme de tamanho de reforço viabilidade, (ii) o controlo de dosagem molecular preciso e individual, e (iii) a partir de corrente eléctrica operacional. Fluorescênci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linha celular cancerosa MDA-MB-231	Coleção de cultura de tipo americano (ATCC)	HTB-26
Leibovitz' s L-15	Medium Cellgro, Mediatech, Inc.	10-045-CV
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco, Life Technologies	16000-044
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4333
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	Cellgro, Mediatech, Inc.	21-030
Tripsina	Gibco, Life Technologies	25200-056
Citômetro de Fluxo easyCyte HT	Millipore	0500-4008
Limpador de Plasma de Oxigênio	Technics Micro-RIE
Dektak 6M perfilador de superfície	Veeco
KMPR 1050	Microchem
SYLGARD 184 ELASTÔMERO DE SILICONE KIT	Dow Corning
Gás nitrogênio comprimido	Airgas	NI 300
Regulador de alta pressão	McMaster-Carr	6162K22
Regulador a jusante	McMaster-Carr	4000K563
Coletor de válvula 3/2way-8 de alta velocidade	Festo
Idex	Health and Science	CV3320
Tubos de poliuretano de 5/32" OD x 3/32" ID	Pneumadyne	PU-156F-0
1/4" OD X 0,17" ID Tubos de poliuretano	Pneumadyne	PU-250PB-4
Tubos PEEK de 1/16"	Festo	P1533
Tubos PEEK de 1/32"	Idex Health and Science	P1569
Tubos PEEK uniões Idex	Health and Science	P881
Gerador de pulsos	HP	8110A
Fio de alumínio	Bob Martin Company	6061 ALUM
Osciloscópio	Agilent	DSO3062A
tubos de centrífuga de 50 ml	VWR	21008-178
Tubo de centrífuga de 15 ml	VWR	21008-216
T75 frasco de cultura	VWR	82050-862
Dextran, Tetrametilrodamina, 3.000 MW, Gibco Aniônico	, Life Technologies	D3307
Dextran, Tetrametilrodamina, 70.000 MW, Neutro	Gibco, Life Technologies	D1819
Dextran, Texas Red, 3.000 MW, Neutro	Gibco, Life Technologies	D3329