Produção de Haplóide embriões Zebrafish por<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilização

Resumo

O peixe-zebra é um poderoso sistema modelo para biologia do desenvolvimento e pesquisa de doenças humanas devido à sua semelhança genética com vertebrados superiores. Este protocolo descreve uma metodologia para criar embriões de peixe-zebra haplóides que podem ser utilizados para estratégias de triagem direta para identificar mutações recessivas em genes essenciais para a embriogênese inicial.

Resumo

O peixe-zebra tornou-se um modelo de vertebrados dominante que é relevante para muitas disciplinas de estudo científico. Zebrafish são especialmente adequadas para a análise genética para a frente dos processos de desenvolvimento, devido à sua fecundação externa, tamanho embrionário, ontogenia rápida e claridade óptica - uma constelação de traços que permitem a observação direta de eventos que vão desde a gastrulação a organogênese com uma lupa básico. Além disso, os embriões de peixe-zebra pode sobreviver durante vários dias no estado haplóide. A produção de embriões haplóides in vitro é uma ferramenta poderosa para a análise mutacional, pois permite a identificação de alelos mutantes recessivos presente na primeira geração (F1) portadoras seguintes mutagênese no pais (P) geração. Esta abordagem elimina a necessidade de elevar várias gerações (F2, F3, etc), que envolve a criação de famílias de mutantes, assim poupando o tempo de pesquisa juntamente com a reduçãoas necessidades de espaço para zebrafish colônia, o trabalho e os custos de criação. Apesar de peixe-zebra foram usados ​​para conduzir para a frente telas para as últimas décadas, tem havido uma expansão constante de transgênicos e genoma ferramentas de edição. Essas ferramentas oferecem agora uma infinidade de maneiras de criar ensaios nuances para as telas de próxima geração que podem ser usados ​​para dissecar ainda mais as redes de regulação gênicas que impulsionam vertebrados ontogenia. Aqui, descrevemos como preparar embriões de peixe-zebra haplóides. Este protocolo pode ser implementado para novas futuras telas haplóides, tais como em telas intensificadoras e supressoras, para abordar os mecanismos de desenvolvimento de um largo número de processos e de tecidos que se formam durante estágios embrionários iniciais.

Introdução

Os processos fundamentais que orquestram o desenvolvimento dos vertebrados são amplamente conservadas ^1. Uma forma poderosa para identificar genes com papel essencial no desenvolvimento é isolar mutações hereditárias que levam a defeitos fenotípicos no processo de interesse. O peixe-zebra, Danio rerio, é uma pequena espécie de teleósteos de água doce pertencente à família Cyprinidae peixe que se tornou um organismo modelo amplamente utilizado para a genética do desenvolvimento de vertebrados ao longo das últimas décadas ^2. Ovos de peixe-zebra são fertilizados externamente, permitindo o acesso ao zigoto do início da fertilização ^3. Além disso, o embrião é opticamente transparente, permitindo a visualização do desenvolvimento com uma lupa simples ^3. Ontogenia do peixe-zebra é rápida, com os processos de clivagem, a gastrulação, e a organogénese das muitas estruturas, tais como o coração e os rins, praticamente concluída ao longo do primeiro dia de desenvolvimento ^3. Tele tempo de estágios larvais de maturidade sexual leva 2-3 meses, e os adultos são pequenos vertebrados cerca de 3-4 cm de comprimento, tantos peixes podem ser mantidos em espaço mínimo ^2. Além disso, os adultos zebrafish têm alta fecundidade, com cada peixe capaz de produzir várias centenas de embriões por semana ^2. Estes atributos tornaram a rastreabilidade do peixe-zebra para frente e para trás telas genéticos. Zebrafish possuem um alto grau de conservação em sua anatomia, biologia celular e fisiologia, com mais espécies de vertebrados avançados, como os mamíferos ^2,4. De facto, a análise da sequência recente demonstrou que o genoma do peixe-zebra contém homólogos a cerca de 70% dos genes humanos ^5. Esta conservação tem possibilitado aos pesquisadores usar zebrafish como um modelo para inúmeras doenças humanas, incluindo tanto embrionárias e as condições de adultos ^2,4. Tomados em conjunto, esses fatores fizeram zebrafish um excelente sistema para as telas o objetivo de identificar genes que sãoessencial para a ontogenia dos vertebrados normal.

Um certo número de telas de grande escala foram efectuadas no peixe-zebra e foram identificados vários milhares de mutações em genes de desenvolvimento ^6-8. O macho adulto zebrafish é passível de mutagênese e alterações cromossômicas podem ser gerados com freqüência relativamente alta usando o etilnitrosoureia mutagênico químico (ENU) ^6,7 ou retroviral mutagênese insercional ^9. Até o momento, mais de 9.000 mutações hereditárias foram criadas, e incluem genes que afetam praticamente todos os aspectos da embriogênese. A comunidade zebrafish estabeleceu um banco centralizado desses mutantes no Centro Internacional de Recursos Zebrafish (ou Zirc) ^10, que reuniu cerca de 5.000 alelos mutantes e transgênicas de todo o mundo. Muitas destas mutações foram analisadas e clonado, dando a pesquisadores em todas as disciplinas biológicas informações valiosas que tem sido usado para provocar uma separação numeronos caminhos celulares e fisiológicos através dos conhecimentos provenientes de experimentos de peixe-zebra.

Apesar de telas para a frente têm identificado um número impressionante de genes importantes, ainda tem muito a ser apreciado sobre as redes de regulação genética que medeiam uma infinidade de processos. Muitas telas realizadas até o momento não atingiu a saturação e, assim, para a frente, bem como telas genéticos reversa mantiveram uma pedra angular para identificar e analisar mecanismos de embriogênese. Embora existam perspectivas enormes que pode ser adquirida a partir de uma única linhagem mutante peixe-zebra, um importante fator de limitação no campo tem sido historicamente o esforço demorado envolvidos na clonagem posicional. Por esta razão, a identidade de várias mutações induzidas quimicamente tem permanecido um mistério. Contudo, com o advento recente de abordagens de sequenciamento do genoma inteiro que facilitam a clonagem rápida ^11-14, identificação extremamente eficiente de mutações genéticas é agora feasible.

O ecrã para a frente prototípico no peixe-zebra é uma tela diplóide que pode identificar mutações recessivas dentro de três gerações ^6,7 (Figura 1, coluna da esquerda). Esta técnica envolve a geração de mutações nas células germinativas dos pais (P) do sexo masculino e, em seguida, este macho acasalar com uma fêmea tipo selvagem. Cada um dos descendentes da primeira geração (F1) a partir deste acasalamento irá abrigar uma ou mais mutações únicas devido às contribuições cromossômicos do genoma paterno mutado. A progênie F1 são levantadas e outcrossed com tipos selvagens para criar famílias F2. Na família F2, irmãos vai ser do tipo selvagem ou portadores heterozigóticos, e são incrossed aleatoriamente para gerar garras F3 que são analisadas quanto ao fenótipo (s) de interesse. As embreagens F3 de portadores heterozigotos irá conter 25% do tipo selvagem, 50% de heterozigotos e 25% peixe mutante homozigoto. Esse esquema de triagem multi-geracional é eficaz, no entanto, uma grande desvantagem para isso umstratégia inclui o tempo necessário para se preparar para a tela: pelo menos 1 ano de criação de peixe sozinho está envolvido, uma vez que cada geração requer cerca de 3 meses para atingir a maturidade sexual. Outras limitações deste tipo de tela diplóide são obra, espaço e custo da habitação essas gerações.

A tela haplóide é uma alternativa que pode ser utilizada para identificar e subsequentemente isolar mutações recessivas utilizando estratégias de mutagénese semelhante ¹⁵ (Figura 1, coluna da direita). A produção de embriões de peixes-zebra haplóides foi descrita pela primeira vez há mais de 30 anos ^16, e a capacidade de o peixe-zebra normalmente diplóide desenvolver durante vários dias com uma ploidia cromossómico haplóide foi utilizado para numerosos estudos genéticos uma vez que este tempo. A principal vantagem da tela haplóides é que este método não envolve cuidando das famílias F2, a fim de rastrear alelos mutantes recessivos. Em vez disso, as fêmeas geração F1 são avaliadas paraheterozigosidade de mutações recessivas no processo de interesse por análise da sua descendência F2 em estado haplóide (Figura 1, coluna da direita). Em geral, os passos para adquirir embriões haplóides são relativamente simples (Figura 2). Após a preparação das soluções necessárias para a manipulação de espermatozóides, os ovos são obtidos a partir de fêmeas de geração F1 por manipulação manual a fim de fazer a extrusão (ou "apertar") os ovos da barriga. Uma vez que os ovos são obtidos, eles são fertilizados in vitro por exposição à luz ultravioleta (UV) do esperma inactivado. O esperma inactivado UV são incapazes de contribuir DNA viável para o ovo, devido ao facto de o comprimento de onda UV curto reticula o DNA paterno. No entanto, o esperma ainda são capazes de desencadear a actividade de ovo e os eventos associados com o desenvolvimento zigótica. Após a ativação metabólica, o ovo vai completar a meiose II, e prosseguir para desenvolver apenas com a uma cópia de cada maternalmente depositado chromosome. Devido a esta ploidia 1N, o embrião está sujeita às consequências para o desenvolvimento de um alelo mutante recessivo, se ele estiver presente num cromossoma materno. Assim, cada embreagem haplóides F2 irá conter 50% do tipo selvagem e 50% de embriões mutantes se a mãe é portadora heterozigótica de um alelo recessivo totalmente penetrante. Esta distribuição de genótipos embrionárias permite relativa facilidade em termos de avaliação da embraiagem para a presença do fenótipo mutante (s) de interesse. Se um tal fenótipo é detectado, o fundador fêmea geração F1 é subsequentemente outcrossed de tipo selvagem de peixe-zebra macho para criar e levantar mais portadores heterozigóticos. Porque não é necessário levantar várias gerações para executar a tela, o pesquisador pode economizar tempo considerável, trabalho e espaço de aquário, mas ainda tem o poder de examinar um número significativo de genomas com base no número de fêmeas F1 examinado. Assim, as telas haplóides são especialmente viável para pequenos laboratórios ou projetos iniciados no absence de um financiamento substancial.

No entanto, existem várias limitações e desvantagens ao uso de haplóides. Primeiro, os embriões de peixe-zebra haplóides viver por apenas alguns dias, e, normalmente, morrem entre 3 e 5 dias após a fertilização (dpf) ^15. Zebrafish embriões haplóides podem ser distinguidas de diplóides com base em várias características, acima de tudo entre eles, sendo um corpo curto e atarracado que, no entanto, tem o número normal de segmentos somito ^15,17. Com o desenvolvimento, as exposições do cérebro aumentou a morte celular ea circulação é pobre, geralmente associado com o acúmulo de sangue por 2-3 dpf e edema ^15,17. Além disso, haplóides não inflar uma bexiga natatória ^15,17. Independentemente destas diferenças morfológicas, a maior parte dos principais órgãos e tecidos são formados, incluindo o coração, os olhos, e o notocórdio de ^15,17. Uma característica notável sobre garras haplóides é que eles contêm uma variedade de fenótipos em termos de variedades de embriões defeituosos & #8212; uma característica observada em todo cepas peixe-zebra. Assim, deve-se verificar se o tecido (s) e no ponto de tempo de interesse apresentam desenvolvimento razoavelmente normal na estirpe haplóide tipo selvagem e, por conseguinte, tem o potencial para ser avaliada quanto a defeitos genéticos em uma tela ou outro projecto de investigação.

Apesar destes desafios, telas haplóides têm sido implementadas com sucesso para identificar genes necessários para os processos de desenvolvimento iniciais do peixe-zebra, e os protocolos de haplóides foram recursos bem estabelecido na comunidade por muitos anos ^15-19. Mais recentemente, o processo de geração de embriões de peixes haplóides tem sido utilizado pelos investigadores para criar haplóide estaminais embrionárias (ES) a partir de culturas de células do peixe medaka ^20,21. Após a produção de embriões haplóides medaka in vitro, foram utilizados os embriões para obter culturas de células primárias que foram passadas durante cerca de 15 semanas, seguidas por mais de 5-8 semanas, para gerar clones puros de células haplóides comPropriedades das células ES ^15-19. A geração de linhagens de células haplóides peixes ES detém ampla promessa futura para analisar fenótipos recessivos em linhagens de células de vertebrados, e representa uma nova abordagem para a análise genética nos próximos anos. Assim, a geração de embriões de peixes haplóides tem aplicações crescente na comunidade de pesquisa biomédica. Este artigo de vídeo fornece uma demonstração visual dos passos envolvidos com a produção de embriões de peixes-zebra haplóides in vitro utilizando esperma inactivado por UV baseado em protocolos estabelecidos ^15-19,22.

Protocolo

NOTA: Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use na Universidade de Notre Dame. NOTA: Embora o seguinte protocolo fornece uma demonstração de isolamento esperma que envolve a eutanásia dos machos, o esperma pode ser a coleta do poro genital da anestesiados vivendo peixe-zebra macho usando pressão abdominal suave e uma microcapilar para coleta de esperma ^17,18. Espremendo do sexo masculino vivos exige diversos machos a ser utilizado, a fim de recolher a quantidade equivalente de espermatozóides que podem ser obtidos a partir de um macho sacrificados ^17,18. No entanto, os machos que tenham sido submetidos a compressão permanecem bastante saudáveis ​​e podem ser utilizados para acasalamento naturais ou subsequentes procedimentos in vitro ^17. Sempre que possível, os procedimentos escolhidos devem minimizar sacrifício peixe desnecessário.

1. Preparação de Soluções e Zebrafish acasalamento Chambers

1. Preparar soluções stock de Hank (# 1, 2, 4, 6) e da solução de pré-mistura de Hank (ver tabela Materiais) ^19, em seguida, autoclave e armazenar a 4 ° C.
2. Selecione o número desejado de fêmea de peixe-zebra adulto (s) para a coleta de embreagem haplóides. NOTA: Com base na experiência, utilizando um composto de Fórmula 1 mutagenizado consanguínea zebrafish estirpe Tubingen, aproximadamente, 50% do sexo feminino, sexualmente maduros eram "compressível" em média após a activação deles colocando-os em uma gaiola de acoplamento durante a noite com um macho - ou seja, uma embraiagem foi obtido através do processo de compressão - e que a maioria destas garras (variando entre 70-90%) produziu haplóides viáveis. Com dois pesquisadores realizando a preparação haplóides, cerca de 80 adultos F1 fêmea de peixe-zebra pode ser espremido em uma manhã. Para calcular os reagentes necessários para o experimento haplóides, factor de tanto a taxa de compressão da geração F1 e o número de investigadores disponível para executar a experiment. Tenha em mente que o número de fêmeas que produzirão garras haplóides de alta qualidade é extremamente variável, com diferenças observadas entre as fêmeas de peixe-zebra de diferentes linhagens, idades e dieta ^15.
3. Prepare gaiolas de acasalamento, colocando cada adulto fêmea de peixe-zebra com um peixe-zebra adulto masculino em uma câmara de água do sistema de modo que eles são separados por um divisor durante a noite. NOTA: As fêmeas devem ser expostos a uma noite do sexo masculino para privilegiada, ou prepará-los, para desova através de compressão.

2. Dissecção de Testes

1. Adicione da Solução # 6 fresco de Hank através da adição de 0,35 g de bicarbonato de sódio a 10 ml de água destilada. Misture bem para dissolver o pó de bicarbonato de sódio.
2. Combina-se o seguinte num tubo em gelo, a fim de fazer a solução de trabalho final do tamponada de Hank para o esperma: 9,9 ml de Hanks Premix I com 100 ml de solução de estoque # 6.
3. Misture bem, então alíquota de 500 mL da Hank7; s solução de trabalho final em um tubo de microcentrífuga e colocar no gelo. NOTA: Cada 500 ul alíquota irá ser utilizado para preparar o esperma dos testículos de peixe-zebra macho 4-5.
4. Escolha entre 4-5 peixe-zebra macho para cada colheita de esperma. NOTA: Este vai colher esperma suficiente para ser recolhidos, processados ​​e guardados em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, o qual pode ser utilizado para fertilizar aproximadamente 15 embraiagens haplóides. Selecione coortes adicionais de machos, a fim de preparar tubos adicionais dependendo da escala do experimento. Se o peixe-zebra macho selecionado são pequenos ou a dissecção testículos é incompleta, geralmente serão necessários cinco homens.
5. Eutanásia cada macho usando um líquido para transferir os peixes suavemente um prato contendo 0,2% tricaina de aproximadamente 5-6 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Tenha cuidado para assegurar que o homem tenha sido devidamente sacrificados antes do início da dissecção. Normalmente, esperar vários (2-3) minutos após as guelras do peixe parar de se mover e os peixesjá não é sensível ao toque.
6. Escolha o macho se suavemente com uma colher de plástico e cuidadosamente apagar a seco masculino de líquido. Em seguida, remover a cabeça do macho com uma tesoura afiada e depois cortar uma incisão ao longo da linha média ventral. NOTA: A remoção do excesso de líquido a partir do peixe é essencial para evitar desencadear a activação do esperma.
7. Retire o tubo digestivo e órgãos viscerais associadas da cavidade abdominal usando uma pinça fina e coloque em um recipiente para eliminação de risco biológico.
8. Use uma pinça fina para remover os testículos, que estão localizadas ao longo da parede do corpo dorsal, laterais à bexiga natatória, e têm um aspecto branco opaco, quando vistas sob o microscópio estereoscópico. NOTA: Mantendo os testículos intacto pode ajudar a evitar a exposição do esperma à base de água e fluidos corporais, assim, evitar a activação prematura.
9. Colocar os testículos na solução de esperma em gelo e manter o tubo em gelo enquanto as outras testículos são dissecados. Repita os passos 2,6-2,9 até que todo o males foram dissecados.
10. Coloque as carcaças e quaisquer tecidos animais restantes em um recipiente para eliminação de risco biológico institucional adequado.

3. UV Sperm Inativação

1. Homogeneizar os testículos por moagem suavemente o tubo de microcentrífuga com um pilão microtubo estéril.
2. Transferir o sobrenadante para uma pequena placa de petri ou de vidro de relógio em gelo. NOTA: Não transferir restos de tecido junto com a solução sobrenadante. Isto irá criar sombras e comprometer a inativação UV de esperma.
3. Lavar o tubo de espermatozóides com entre 300-400 mL de solução de trabalho final adicional de Hank (preparado na Fase 2.2 e armazenado em gelo), e adicionar esta lavagem sobrenadante para a pequena caixa de Petri ou vidro de relógio no passo 3.2.
4. Expor o prato de UV de uma lâmpada de bancada (254 nm) para um total de 2 min a uma distância da fonte de luz de cerca de 15 em (38,1 centímetros). NOTA: Tenha cuidado ao trabalhar com uma lâmpada UV e usar uma viseira ououtro equipamento de protecção individual dos olhos.
5. Devolver o prato para o balde de gelo, em seguida, transferir o esperma inactivado UV para um tubo de microcentrífuga fresco e armazenar a amostra em gelo. NOTA: Neste ponto, haverá cerca de 800 mL de esperma para a fertilização UV inativado embreagem haplóides. O esperma deve ser mantido no gelo durante toda a duração do tempo gasto em apertar as fêmeas. Esperma no frio Hank pode ser usado por até 6 horas, sem qualquer redução no resultado da fertilização. Interessantemente, outros investigadores relataram que o esperma em frio de Hank é viável a partir de várias horas a vários dias ^18.

4. Procurement Egg do Zebrafish Adulto Feminino e Fertilização In Vitro da embreagem

1. Prepare banho tricaina para anestesia através da combinação de 20 ml de 0,2% estoque tricaina com 80 ml de água sistema de peixe.
2. Selecione a fêmea para coleta de ovos, usando uma rede para colocá-la suavemente no prato de tricaine.
3. Espere por 2-3 min até que a fêmea é anestesiado e já não responde ao toque. NOTA: Se os espasmos femininos ou provoca outros movimentos, dar-lhe mais tempo para sucumbir à anestesia.
4. Use uma colher de plástico para levantar delicadamente a mulher, decantação da solução antes de colocar a fêmea em uma toalha de papel para afastar o excesso de líquido. NOTA: Tenha cuidado para não deixar solução extra no feminino, como fluido irá desencadear a activação de ovo antes da adição de esperma.
5. Coloque a fêmea em seu slide na caixa de Petri limpa e visualizar sua barriga sob o microscópio estereoscópico.
6. Curso barriga da fêmea suavemente por cerca de 10-20 segundos usando um ou dois dedos de uma mão para apertar os ovos de seu abdômen, enquanto isso apoiando as costas do sexo feminino, posicionando um ou dois dedos da outra mão atrás dela parede do corpo dorsal. NOTA: Após a acariciar o abdômen da fêmea, os ovos devem sair muito facilmente. Se os ovos não surgem sagacidadeh facilidade, não é aconselhável a "empurrar com mais força 'e ovos força do feminino. Isso indica que os ovos não estão presentes e / ou não está pronto para a fertilização, e continuou empurrando está associada a um risco considerável de prejudicar a fêmea (por exemplo, esvaziar a bexiga natatória ou causar outros danos internos letal). Se uma fêmea é espremido, mas fornece nenhum ou poucos ovos, a fêmea retornar à facilidade animal. Após 1-2 semanas de descanso, emparelhar a fêmea com um macho para um acasalamento natural para limpar os restos de ovo residual. Segregar fêmeas que acasalam-se naturalmente em um tanque por mais 1-2 semanas de descanso antes de tentar uma segunda squeeze. Alternativamente, as fêmeas podem estar descansado durante 4 semanas, durante o qual eles podem ser criados para acasalamentos naturais ^15.
7. Use uma fina sonda ou pequena espátula para colher os ovos para fora sob a fêmea e / ou sua superfície barriga.
8. Levante cuidadosamente a fêmea e devolvê-la a um tanque de isolamento devidamente rotulados contendo água sistema de peixe.
9. Adicionar 50 ul de solução de esperma inactivado por UV para a embraiagem de ovos, e incubar à temperatura ambiente durante 30 segundos durante o qual o tempo, fixar uma etiqueta correspondente ao prato para segui-lo com o número atribuído ao progenitor feminino.
10. Adicionar 1 ml de E3 para os ovos, e incubar à temperatura ambiente durante 1 min.
11. Adicionar solução E3 suficiente para encher o prato intermediário, e colocar os embriões a 28 ° C durante a incubação subsequente. NOTA: A adição de penicilina / estreptomicina (1% (v / v) de solução para canetas-strep contendo 5.000 unidades de penicilina e estreptomicina a 5 mg por ml) ^{de 19} a E3 pode ajudar na saúde geral dos embriões haplóides.

5. Observação e manipulação de embriões haplóides

1. Depois de 4-8 horas, remover embriões não fertilizados do prato e lavar os embriões restantes, substituindo a mídia embrião E3 com solução E3 fresco. NOTA: não fertilizada embriões irá exibir uma aparência branca, opaca ou pode exibir uma forma transparenteppearance com uma única célula disforme.
2. Incubar até ponto de tempo desejado de interesse, e depois utilizar no ensaio tela desejada ou outro aplicativo (s) de pesquisa.

Resultados

A produção de embriões haplóides podem ser implementados para identificar mutações recessivas na geração F2 quando os haplóides são obtidos a partir de fêmeas de peixe-zebra maduros que são a descendência de pais mutadas (Figura 1). Isso economiza tempo e espaço em comparação com a tela diplóide tradicional, em que os pesquisadores precisam criar famílias F2 cuja descendência diplóide são então avaliados para fenótipos de interesse (Figura 1).

As principais etapas do protocolo descrito nos Passos 1-5 acima para a obtenção de embriões de peixes-zebra haplóides por fertilização in vitro está esquematizado como um fluxograma (Figura 2). Essas etapas envolvem a preparação de soluções e priming de fêmeas pela exposição aos hormônios masculinos em tanques de acasalamento (dia 1), seguidos de esperma e obtenção de óvulos e fertilização in vitro (dia 2), e, finalmente, a criação dos haplóides (Dias 3-5) (Figura 2). Quando comcombinada com uma tela de genética, um procedimento comum mutagênese no peixe-zebra inclui exposição prévia dos zebrafish adultos tipo selvagem do sexo masculino para um agente mutagênico (por exemplo, a um agente mutagênico químico como ENU, embora outros procedimentos, tais como mutagênese retroviral baseado podem ser implementadas, que também facilitar a clonagem do defeito cromossómico), seguido por cruzamento com fêmeas do tipo selvagem para criar uma geração F1 mutagenizado. Tais preparações requerem vários meses de trabalho (cerca de 6 meses) com base nos tempos de geração necessários para tipos selvagens traseiros, execute mutagênese e traseira subsequente mutado F1 ^15,17,22.

Outro ponto importante a considerar na contratação haplóides para uma tela é a escolha de tensão peixe-zebra. A AB * (AB estrela) a tensão tornou-se conhecida pela produção de embriões haplóides com melhores características gerais e de saúde do que outras linhagens ^15. No entanto, na estirpe Tubingen derivado produzido no nosso laborahistória, temos observado recentemente características embriológicas que permitiram telas de sucesso para anomalias de desenvolvimento do sistema renal (G. Gerlach e R. Wingert, não publicado). Mediana de peixe-zebra machos da estirpe Tuebingen foram mutagenizados através de uma série de três tratamentos ENU, e depois cruzados com o tipo selvagem fêmeas Tuebingen para gerar uma geração F1 para o rastreio. As fêmeas F1 foram espremidas para obter ovos e esses ovos F2 foram fertilizados com o esperma UV inativado. Comparado com garras diplóides obtidos por acasalamento natural de tipo selvagem Tuebingen pais (Figura 3A), os embriões nestes garras estirpe haplóide Tuebingen exibido um mais curto, encorpado característica tronco do estado haplóide (Figuras 3B e C). Além disso, embraiagens haplóides consistem tipicamente de irmãos de embriões que apresentam uma série de defeitos, o qual observou-se assim (Figuras 3B e C), que é conhecida por variar dentro de estirpes, como será discutido mais abaixo de ^15,17.

Estudos anteriores já haviam estabelecido uma série de classificação canônica, correspondendo aos graus de A a D, para categorizar o leque de haplóides defeitos fenótipo ^15,17, e, adicionalmente, haplóides também têm sido referidos em termos dos adjetivos bom, intermediária e baixa qualidade ^22. Haplóides Grau A, correspondendo a haplóides de alta qualidade, são os mais normais na aparência, com um corpo curto e atarracado, mas mostram em geral um aspecto morfológico semelhante ao diplóides ^15,17,22 (compare irmãos diplóides (D) para haplóide grau A (rotulado A) irmãos, Figura 3B). Embriões haplóides classe A também desenvolvem edema pericárdico modesto, o que é uma característica típica do desenvolvimento do peixe-zebra haplóides ^15,17,22 (Figura 3B). Em comparação com haplóides grau A, intermediário ou o chamado grau B embriões haplóides (rotulada B, Figuras 3B, C) ​​são distinguidos pelo desenvolvimento de um / twis ainda mais reduzido ou torcidated tronco, apesar de características de uma cabeça e cauda são claramente distinguíveis ^15,17,22. Finalmente, o grau de C ou de má qualidade haplóides (também referidos em algumas referências como C / D) ^15,17,22 são extremamente deficiente e exibir uma massa desordenada de células em associação com uma bola de gema (marcado C, Figura 3C). Mesmo entre a mesma estirpe, embraiagens haplóides variar a distribuição de A, B, e C fenótipos que se irá observar. Por exemplo, a embraiagem haplóide de uma fêmea Tubingen exibida melhor desenvolvimento geral, principalmente com A e B de grau prole haplóides (Figura 3B) em comparação com haplóides obtidos a partir de uma segunda fêmea Tubingen, cuja embraiagem consistia de numerosos grau C prole haplóides, bem como um e fenótipos haplóides B (Figura 3C). Tensão variabilidade semelhante de notas de embriões haplóides foram previamente observadas em AB e AB * peixe tensão, bem ^15.

Apesar destes mordiferenças morfológicas, organogênese de muitas estruturas procede relativamente normal no embrião haplóide. Apesar de terem um corpo mais curto tronco, desenvolvimento de órgãos como o coração e os olhos é relativamente semelhante à de tipo selvagem embriões diplóides, e tipos de células, tais como células de pigmento (melanóforos e xantóforos) também pode ser avaliado ^15. Além disso, já documentada recentemente que os pronefros, ou de rim embrionário, é desenvolvido por 1 dia após a fertilização no haplóide tipo selvagem, de modo semelhante ao do tipo selvagem diplóides. Como prova disso, o tipo de célula pronefros padronização apresenta o padrão de protótipo de segmentos (Figura 4). Além disso, o fenótipo de mutações recessivas que alteram o desenvolvimento pronefros, tais como a mutação lib que reduz a produção de ácido retinóico, apresentam um padrão semelhante no estado haplóide em comparação com o estado diplóide (Figura 4) ^23,24. Esta observação está de acordo com a de outros recessãosive mutações que levam a fenótipos semelhantes, tanto na condição haplóide e diplóide, embora isso nem sempre é o caso com todas as mutações e deve ser mantido em mente se avaliar esse tipo de estratégia de tela ^{de 15.}

Um certo número de tecidos e órgãos são geralmente anormal em haplóides. Por exemplo, haplóides apresentar defeitos em circulação, geralmente exibem o acúmulo de sangue, o que pode fazer a sua capacidade de estudar alguns aspectos da vasculogênese limitado ^15. Além disso, constatou-se que pode ter haplóides irregularidades no desenvolvimento da orelha, de tal forma que eles podem ser avaliadas quanto a mutações que impedem totalmente a formação de vesícula ótica, mas não por mutações que afectam processos penetrantes envolvidos com morfogénese desta estrutura ^15. Como outro exemplo disso, a morfogênese do cérebro é anormal em haplóides, e, portanto, telas haplóides para identificar as vias de desenvolvimento do cérebro necessárias são limitados ^15. Apesar destas limitações, o nosso análise do desenvolvimento renal no estado haplóide (Figura 4) adiciona este órgão para a lista de estruturas embrionárias 'rastreï'. Esta descoberta destaca que uma metodologia tela haplóides pode ser usada para dissecar os componentes genéticos de padronização renal progenitor e adiciona ênfase ao sentimento que as abordagens de tela engenhoso pode contornar as limitações da ontogenia embrião haplóide de descobrir valiosos novos modelos mutantes para estudar o desenvolvimento dos vertebrados ^15.

Figura 1. Esquemático de estratégias de tela diplóides e haplóides no modelo de peixe-zebra. Seguir à mutagénese de geração parental, a geração F1 pode ser levantada e usada ou para gerar famílias mutante F2, que são utilizadas para pesquisar a geração F3 num estado diplóide (esquerda ) ou diretamente da telaed em uma estratégia de haplóides (direita). Em uma tela de haplóides, as fêmeas sexualmente maduros geração F1 são usados ​​para coletar garras F2 haplóides para análise genética. Portadores heterozigotos do sexo feminino são identificadas se cerca de metade dos haplóides F2 apresentam um fenótipo mutante (embriões vermelhas) em comparação com os irmãos haplóides tipo selvagem (embriões amarelo).

Figura 2. Haplóide embrião produção fluxograma. As principais etapas de fertilização in vitro para a produção de embriões haplóides são esquematizadas como tarefas realizadas no dia 1 (caixas-de-rosa) para preparar soluções de esperma e adultos principais zebrafish fêmeas, tarefas realizadas no dia 2 (caixas de laranja ) para coletar e inativar UV esperma, para coletar ovos, para fertilizar os ovos com o esperma UV inativado para gerar haplóides, e, em seguida, para reviver a mãe do sexo feminino, e finally tarefas realizadas em dias subseqüentes 3-5 (caixa amarela), quando as garras são incubados até o ponto de tempo desejado (s) de observação e análise.

Figura 3. Comparação de Tübingen embriões de peixe-zebra tensão diplóides e haplóides. A) de tipo selvagem embriões diplóides foram produzidos por desova natural e, em seguida, incubadas, até cerca de 30 hpf. B, C) ​​haplóides embriões de tipo selvagem foram produzidos por fertilização in vitro de garras obtidos a partir de fêmeas de geração F1 mutagenizadas com esperma inactivado por UV, e incubadas até aproximadamente 30 hpf. Haplóides exibiu uma gama de anormalidades no desenvolvimento em comparação com embriões diplóides tipo selvagem (setas pretas, d para indicar diplóide). Haplóides relativamente normal teve uma encurtada, mais corpo estoque análogo ao sistema de classificação deum A haplóide ¹⁵ (setas vermelha, um marcado), enquanto haplóides com anomalias exibiu um eixo do corpo severamente truncadas (setas roxas, B marcado) que corresponde a um grau de B, e por fim o grau C (setas azuis, C etiquetado) baseado descrições publicadas ^15. Todos os embriões foram fotografados ao vivo com uma ampliação 2.5X.

Figura 4. Padronização do desenvolvimento de tipos de células que compõem o pronefros embrionário órgão renal em haplóides zebrafish tensão Tübingen. Tipos selvagens haplóides exibido um padrão normal de tipos de células na estrutura renal embrionário (top de linha). O rim embrionário consiste de um par de unidades funcionais segmentados conhecidos como nefrónios. O padrão segmentado de tipos de células distintas presentes em néfrons podem ser visualizados com base em todo o monte hibridização in situ padrão de transcritos do gene que são exclusivas para os tipos de células diferenciadas de néfrons, que incluem os podócitos (P) marcados por wt1b e nephrin expressão, o túbulo contornado proximal (PCT) marcado por slc20a1a, o túbulo proximal reta (PST ) marcado por TRPM7, o distal precoce (DE) marcado por slc12a1 e túbulo distal tarde (DL) marcado por slc12a3. embriões haplóides lib mutantes (podocytes linha inferior) exibição reduzidos, PCT e um PST ausente, juntamente com uma DE expandida e segmento DL, semelhante a embriões diplóides lib ^18. Os embriões foram fotografados numa vista dorsal, com a anterior, para a esquerda, com uma ampliação de 10X.

Discussão

Triagem Haplóide é uma técnica útil para descobrir genes essenciais necessárias para os estágios iniciais de desenvolvimento. Além disso, a cultura de células haplóides do peixe medaka foi utilizado para isolar as linhas de células ES semelhantes que têm inúmeras aplicações de investigação e de potencial, o que demonstra que as células haplóides pode proporcionar um local futuro valioso para outros tipos de estudos genéticos vertebrados ^20,21. Este protocolo proporciona uma demonstração dos métodos envolvidos com a realização da produção de embriões de peixes-zebra haplóides por fertilização in vitro com esperma inactivado por UV. Esta metodologia pode ser utilizada para realizar telas frente haplóides com peixe F1 mutagenizado, o qual pode ser feito utilizando o tipo selvagem, transgénicos ou estirpes mutantes para o rastreio potenciador / supressora.

Embora o tempo de triagem usando uma estratégia haplóide é muito reduzido em comparação com o rastreio diplóide, será, no entanto, levar vários meses para ser concluído. Como nós descricama anteriormente, existem muitos benefícios que existem através da realização de uma tela usando um esquema haplóides, que pode ajudar a fazer novas contribuições para o conhecimento atual sobre qualquer número de eventos de desenvolvimento. A metodologia tela haplóides é mais eficiente para a identificação de alelos mutantes recessivos do que telas diplóides baseados em função da redução do tempo, do espaço e do número de peixes que são necessários. No entanto, existem várias armadilhas para uma tela haplóide. Uma tela haplóides só pode identificar mutantes em genes que estão ativos nos primeiros dias de desenvolvimento, como o embrião só pode sobreviver por um tempo limitado, com um genoma haplóide. Os genes que são expressos mais tarde no desenvolvimento terão de ser identificado por um método diferente, tal como uma tela de diplóide. Além disso, alguns órgãos não se desenvolvem adequadamente em um organismo haplóide. Pode haver anormalidades anatômicas, ou uma hora atrasada de desenvolvimento, que podem causar a mutação para ser desperdiçada pela técnica de triagem haplóides. Eun disso, algumas cepas de peixe não se desenvolvem bem em uma condição haplóide ^15. Haplóides podem ser categorizadas por uma série de classificação de bons, intermediários e pobres características embrionárias, com embriões sendo o mais normal, B para designar embriões com defeitos no eixo, mas a cabeça limpa e cauda, ​​e C / D para designar embriões com irreconhecível características (massas de células em cima de bolas de gema) ^15,17. As proporções de embriões dentro destas categorias varia de acordo com a tensão peixe-zebra, com aumento do número de haplóides de melhor qualidade mais prevalentes em determinadas origens genéticas ^15,17. Devido a esses fatores, é necessário encontrar uma cepa adequada de peixe-zebra para realizar a mutagênese e cruzes subseqüentes. Em nossa experiência recente, o tipo selvagem Tübingen tensão produzida haplóides viáveis ​​para triagem (como mostrado na Figura 3 e 4), embora os pesquisadores historicamente zebrafish têm utilizado a AB ou ab * cepas para experim haplóidesentação ^15.

Em adição a estes desafios acima mencionados, nem todas as fêmeas de peixe-zebra adultos com primário irá produzir uma embraiagem mediante realização da técnica de compressão. Por exemplo, no trabalho com ENU-mutadas fêmeas tensão Tübingen, cerca de metade de todas as fêmeas produziu uma embreagem após apertar, e uma fração deles (tipicamente 10-30%) eram de má qualidade ou embrião não poderia ser fertilizado. Assim, para executar uma tela haplóides deve-se planejar para levantar pelo menos duas vezes como muitos peixes como necessário para a tela o número desejado de genomas (cada fêmea representa um genoma filtrada). Independentemente desta análise, os benefícios do método haplóide de triagem para cobrir um grande número de genomas sem uma instalação para animais maciço são bastante significativa se o ensaio é favorável para o estado haplóide. No entanto, também deve notar-se que o estudo mais aprofundado da mutação (ões) identificada na embraiagem haplóide é totalmente dependente de um levantamento com sucesson outcross do fundador feminino. Como acontece com qualquer tela, 'bate' inicialmente identificados durante o processo de seleção deve ser re-identificado no estado diplóide.

Apesar das armadilhas de usar a tela haplóides, tem mostrado ser muito bem sucedido em identificar mutantes, que foram analisadas em profundidade com ganhos perspicazes para o campo científico ^15. Telas haplóides podem ser implementadas para investigar outros processos mal compreendidos do desenvolvimento dos vertebrados. Usando haplóides para telas Enhancer e supressores é uma maneira de ganhar mais conhecimento sobre as atividades e rede de regulação de um gene de interesse. A técnica de rastreio haplóide, também pode ser utilizado para identificar potenciadores e eliminadores de mutantes que já tenham sido isolados por meio de métodos tais como mutagénese química ou por inserção ou genética reversa abordagens como Tilling ou TALENS. Em suma, o mutante previamente isolado pode ser mutado com ENU e rastreados para potenciadores ou suppressors do fenótipo mutante inicial. O mutante deve ser capaz de alcançar as fases adultas, por isso, é necessário ter um animal heterozigótica ou uma fraco de peixe mutante homozigótica para executar este ecrã, no entanto os recentes avanços na transgénicos permitiram aos investigadores saia este problema. Aprender a manipular os caminhos do desenvolvimento pode levar a muitas possibilidades emocionantes, incluindo a perspectiva de caminhos perturbadores para tratar estados de doença.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução estoque de Hank # 1			8,0 g NaCl, 0,4 g KCl em 100 ml ddH < sub>2 < / sub>O
estoque de Hank # 2			0,358 g Na2< / sub>HPO4 < / sub> anidro; 0,60 g K < sub> 2< / sub> H2< / sub>PO4< / sub> em 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0,72 g CaCl2 em 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1,23 g MgSO4-7H2O em 50 ml ddH2O
Hank's Premix			Combine na seguinte ordem: (1) 10,0 ml HS # 1, (2) 1,0 ml HS # 2, (3) 1,0 ml HS # 4, (4) 86 ml ddH < sub > 2< / sub>O, (5) 1,0 ml HS # 5. Armazene todas as soluções HS e pré-misturas a 4 °C.
Hank's Stock Solution #6			0,35 g NaHCO3 em 10,0 ml ddH2O; fazer fresco no dia do uso.
Hank's Solução final de trabalho			Combine 9,9 ml de Hank's Premix com 0,1 ml HS Stock #6
XX-Series UV Lâmpada de bancada	UVP	95-0042-05	Modelo XX-15S Lâmpada de bancada
XX Suporte de bancada (ajustável)	UVP	18-0062-01	Modelo XX-15 Suporte
Prato de incubação de embriões	Falcon	35-1005
50 X E3			250 mM de NaCl, 8,5 mM de KCl, 16,5 mM de CaCl2, 16,5 mM de MgSO4 em água destilada. Suplemento com azul de metileno (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) para inibir a contaminação.
1 X E3			Diluir 50 X E3 em água destilada
Estereomicroscópio	Nikon	SMZ645;

Solução SMZ1000