Artigo de método

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

DOI:

10.3791/51710

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18 de outubro de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

Neste artigo

Resumo

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Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Resumo

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Nesta técnica, as células são cultivadas em uma lâmina de vidro que é parcialmente revestida com óxido de índio-estanho (ITO), um material transparente e eletricamente condutor. Uma variedade de moléculas, como peptídeos ou oligonucleotídeos, pode ser introduzida em essencialmente 100% das células de maneira não traumática. Aqui, descrevemos como ele pode ser usado para estudar a comunicação intercelular e juncional comunicativa. O amarelo de Lúcifer penetra nas células quando um pulso elétrico, aplicado à superfície condutora em que estão crescendo, faz com que os poros se formem através da membrana celular. Isso é eletroporação. As células que crescem na superfície de vidro não condutora imediatamente adjacente à região eletroporada não absorvem o amarelo de Lúcifer por eletroporação, mas adquirem o corante fluorescente à medida que é passado para elas por meio de junções comunicantes que as ligam às células eletroporadas. Os resultados da transferência de corante de célula para célula podem ser observados microscopicamente sob iluminação de fluorescência. Esta técnica permite a quantificação precisa da comunicação da junção comunicativa. Além disso, pode ser usado para a introdução de peptídeos ou outras moléculas não permeadas, e a transferência de pequenos peptídeos eletroporados através de junções comunicantes para inibir o sinal nas células adjacentes não eletroporosas é uma demonstração poderosa de inibição de sinal.

Introdução

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A aplicação de corrente eléctrica para uma célula provoca a formação de poros na membrana da célula, por um processo denominado electroporação. Os poros permitem a passagem de uma variedade de moléculas nonpermeant através da membrana. O campo eléctrico pode ser controlada com precisão, de modo a que os poros que se formam são muito pequenas e religar-se rapidamente, com uma perturbação mínima para a fisiologia celular. Interessantemente, as células aderentes podem ser cultivadas numa lâmina de vidro revestido com óxido de índio-estanho condutora e transparente (ITO) e electroporado in situ, isto é sobre a superfície de onde elas crescem, sem ser retirado para ser electroporada em suspensão. As células podem crescer muito bem nesta superfície, e como eles estão ligados e ampliado, a observação microscópica detalhada é possível. Utilizando esta técnica, as pequenas moléculas nonpermeant pode ser introduzido imediatamente e essencialmente em 100% das células, o que faz com que esta técnica especialmente adequado para estudos sobre a activação do components de um caminho a seguir a estimulação do ligando de um receptor (revisto em 1).

A electroporação foi usado principalmente para a introdução de ADN (também chamada electrotransfection). No entanto, a electroporação in situ pode ser valiosa para a introdução de uma grande variedade de moléculas, tais como péptidos 2-4, oligonucleótidos, tais como ARN anti-sentido, oligonucleótidos de cadeia dupla de DNA de engodo para inibir a ligação do factor de transcrição, ou siRNA 3,5, 6, nucleotídeos radioativos 7-10, proteínas 11 12 ou pró-drogas 13. Após a electroporação, as células podem ser lisadas para análise bioquímica ou fixadas e coradas com anticorpos.

O revestimento condutor de ITO é muito fina, 800-1,000Å, de modo que o crescimento celular não é perturbado pela diferença em altura das duas superfícies, como as células crescem em toda a borda do revestimento condutor. Isto oferece a vantagem de que não electropAs células podem ser cultivadas orated lado a lado com os electroporadas, para servir como controlos. A mesma abordagem pode ser usada para o exame de junções de hiato, a comunicação intercelular (CIJH), como descrito no vídeo.

Junções comunicantes são canais que ligam o interior das células adjacentes 14. Das junções de hiato, a comunicação intercelular desempenha um papel importante na formação de tumores e metástases, enquanto que os oncogenes tais como Src suprimir CIJH 15,16. Para examinar a CIJH um corante fluorescente, tal como amarelo Lucifer (LY) é muitas vezes introduzido em células cultivadas através de microinjecção ou raspar-carregamento 17 e a difusão do corante para as células vizinhas é observada microscopicamente sob luz de fluorescência. Estas técnicas contudo invariavelmente causar dano celular. Descreve-se agora uma técnica em que as células são cultivadas sobre uma lâmina de vidro, que é parcialmente revestida com ITO 18. Um impulso eléctrico foi aplicada na presença de LY (ou outros corantes) cautilizando a sua penetração nas células que crescem na parte condutora da lâmina, enquanto que a migração do corante para as células adjacentes, não electroporadas foi observada microscopicamente através de iluminação de fluorescência. Para evitar as células sensíveis perturbadores que possam tender a separar da monocamada, foi concebido um conjunto que não requerem um eléctrodo a ser colocado no topo das células para aplicar a corrente eléctrica 19. Esta abordagem oferece a possibilidade de quantificar a CIJH em ​​um grande número de células, sem qualquer perturbação detectável para o metabolismo celular, como indicado pela ausência de um efeito sobre a duração da fase G1 seguindo estimulação sérica 12, em aumentar os níveis de fos proteína proto-oncogene (Raptis, não publicado) ou duas quinases associadas ao estresse celular, o porco p38 ou JNK / SAPK quinase 1. Esta abordagem possibilitou a análise da relação entre os níveis de oncogene expressão, transformação e GJIC 18, bem como o efeito da Src e Stat3 sobre CIJH em ​​uma variedade de tipos de células, incluindo as células cultivadas de fresco a partir de espécimes de tumor de pulmão de 20-23. Além disso, em electroporação in situ com a configuração descrita, a qual não tem um eléctrodo de topo tem sido empregue com sucesso para a demonstração de fecho das junções de hiato na diferenciação dos adipócitos, embora a adesão celular ao substrato é reduzido, nessa fase, 19,24.

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Protocolo

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1. plaqueamento das células do Eletroporação Chambers

  1. Numa capela de fluxo laminar, as células trypsinize usando uma técnica estéril, como de costume.
    NOTA: É muito importante para eliminar por centrifugação todos os vestígios de tripsina, porque eles podem prejudicar propagação das células no vidro, daí a formação de adherens e junções comunicantes.
  2. Pipetar 1 mL da suspensão de células nas câmaras de electroporação estéril fornecido com o electroporador em situ (Figura 1), e em lugar de um de 37 o C, incubadora de CO 2.
    NOTA: A adesão celular pode ser melhorada através de plaqueamento em fibronectina, colagénio, poli-lisina ou de células e tecido adesivo (ver Tabela Materiais).
  3. Quando as células formaram uma camada confluente eles estão prontos para análise CIJH.

2. Eletroporação Procedimento

Eletroporação para exame GJIC pode ser realizada fora de uma capela de fluxo laminar,uma vez que leva apenas alguns minutos. Se forem necessários tempos de incubação mais longos para uma experiência específica, em seguida, pode ser realizado inteiramente num exaustor de fluxo laminar. Em todos os casos, as câmaras onde são cultivadas as células têm de ser estéreis.

  1. Prepara-se uma / ml solução amarelo Lucifer 5 mg: Dissolver 10 mg de pó de LY (fornecida com o electroporador) em 2 ml de meio de crescimento isento de cálcio. Para os experimentos que requerem tempos de incubação mais longos, filtro de esterilizar a solução e armazenar a 4 ° C.
  2. Aspirar o meio de crescimento e lavar as células com meio livre de cálcio, tendo o cuidado para não arranhar a monocamada ou secar as células. Se as células são secas têm geralmente núcleos mais escuras e pegar LY sem electroporação. O efeito é mais pronunciado no meio do slide que está mais exposto a correntes de ar (Figura 4F).
  3. Com uma pipeta de Eppendorf, pipetar a solução corante para as células (400 ul para o conjunto da câmara), na extremidade da câmara, being cuidado para não tocar a camada de células.
  4. Coloque a câmara no suporte fornecido com o electroporador e aplicar um impulso de força adequada (ver discussão).
  5. Aspirar cuidadosamente um pouco da solução LY. Ele pode ser reutilizada uma segunda vez para experiências menos importantes.
  6. Adicionar DMEM livre de cálcio com 10% de soro dialisado.
  7. Incubar as células durante 3-5 minutos na incubadora para permitir a transferência de corante através de junções de hiato.
    NOTA: A inclusão de soro dialisado, neste ponto ajuda encerramento dos poros.
  8. Lavar o corante não incorporado com DMEM isento de cálcio para a observação de células vivas. Alternativamente, as células podem ser fixadas nesta fase, por meio da adição de 4% de formaldeído para o bem, em seguida, lavadas com PBS (solução salina tamponada com fosfato). Em todos os casos, a lavagem deve remover todo o fundo.
    NOTA: Em experimentos preliminares para determinar as condições ideais, se a tensão é muito baixa, então é possível para permitir que as células se recuperar no incubator durante alguns minutos e electroporate mesma lâmina uma segunda vez, para economizar no custo de lâminas.

3. exame microscópico

  1. Observar as células sob iluminação de fluorescência, utilizando um microscópio invertido equipado com o filtro apropriado para o corante a ser utilizado. Para Lúcifer amarelo, excitação é 423nm, emissão de 555nm, filtro VCI para um microscópio Nikon IX70.
  2. Eliminar efeitos de menisco, colocando uma lamela de vidro na parte superior do poço de plástico, depois do enchimento ele para o topo com o líquido, para examinar a morfologia das células sob contraste de fase. Para melhores imagens, o poço pode ser isolada a partir da lâmina, e a lamela colocada sobre a moldura. Para as células fixas, o poço pode ser preenchido com glicerol para observação microscópica, enquanto para as células vivas, deve ser preenchido com o meio de crescimento.
    NOTA: Lavagem e fotografando é mais fácil se as células são fixadas com formaldeído após a transferência do corante (passo 2.7 acima). Se as células não sãot fixo, a fluorescência é eliminada das células dentro de aproximadamente 60 min, dependendo do tipo de célula, da tensão e da quantidade de LY introduzido enquanto em células fixas fluorescência é mantida durante várias horas. No entanto, a fluorescência ou dissipa após se desvanece O / N a incubação, até mesmo em células fixadas. Por esta razão, deve ser feita fotografias logo após a electroporação (Figura 2).

4. quantificação de comunicação intercelular

  1. Fotografar as células com uma objectiva de 20x sob contraste de fase e fluorescência (Figura 3).
  2. Identificar e marcar com uma estrela as células eletroporados na fronteira com a área não-electroporados (Figura 2, seta, borda eletroporação).
  3. Identificar e marcar com um ponto de células fluorescentes no lado não-electroporado, em que o corante foi transferida através de junções de hiato (Figuras 3A e 3B).
  4. Dividir o número total decélulas fluorescentes na área de não-electroporado pelo número de células electroporadas ao longo da borda (Figuras 3A e 3B).
    NOTA: A transferência de, pelo menos, 200 células de fronteira electroporadas contíguos é calculado para cada experiência. O valor obtido é o valor CIJH.

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Resultados

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A Figura 2 mostra as células epiteliais de fígado de rato 22 T51B, electroporadas com LY e fotografadas sob fluorescência (painel A e B) ou de contraste de fase (C), na sequência de fixação de iluminação e de lavar roupa. No painel A, a borda da área de electroporação é marcado a vermelho. O gradiente de fluorescência para a direita da linha vermelha indica a transferência através de junções de hiato. Na Figura 3A e 3B, a quantificação da comunicação por junç...

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Discussão

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As etapas críticas no protocolo

Material de electroporados
A pureza do material a ser electroporada é muito importante. Se as células são muito plana, então as concentrações mais elevadas do corante de rastreio devem ser usados ​​(até 20 mg / ml para LY) e em tais casos, a pureza é mais importante do que em células com uma forma mais esférica 1. Além LY uma grande variedade de outros corantes ou moléculas nonpermeant têm sido empregues, tais como uma série de...

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Divulgações

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O autor correspondente é o inventor de uma patente detida pela Queen's University, que foi licenciada para a Cell Projects Inc. A empresa ou a Universidade não tiveram influência sobre o conteúdo do artigo.

Agradecimentos

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Agradecemos a Lowell Cochran pela assistência especializada em videografia. A assistência financeira dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), da Fundação Canadense do Câncer de Mama (CBCF, Capítulo de Ontário), do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC), da Aliança Canadense de Pesquisa do Câncer de Mama, dos Centros de Excelência de Ontário, da Breast Cancer Action Kingston e do fundo de legado Clare Nelson por meio de doações ao LR é reconhecida com gratidão. SG recebeu uma bolsa de estudos do NSERC. MG foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Programa de Câncer de Mama do Exército dos EUA, do Ministério de Pesquisa e Inovação da Província de Ontário e do Comitê Consultivo de Pesquisa da Queen's University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM sem Hiclona de Cálcio(Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Soro de Bezerro Doador PAA: http://www.paa.com/Cat.# B15-008
Soro Fetal BovinoPAA: http://www.paa.com/Cat.# A15-751
Aparelho de eletroporaçãoCell Projects Ltd Reino Unido: http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd Reino UnidoACE-04-CC4 poços
ChambersCell Projects Ltd Reino UnidoACE-08-CC8 poços
Lucifer YellowCell Projects Ltd UKACE-25-LYAlta pureza
CelTakBD Biosciences354240Adesivo celular e tecidual
FibronectinaSigmaAldrich F1141
ColágenoBD Biosciences354236
Poli-LisinaSigma AldrichP8920

Referências

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