Calculando a média de Viral glicoproteína do envelope Spikes de Electron Cryotomography reconstruções com Jsubtomo

Resumo

Uma abordagem é apresentada para determinar estruturas de complexos de glicoproteínas de membrana viral usando uma combinação de criotomografia eletrônica e média de subtomograma com o pacote computacional Jsubtomo.

Resumo

Vírus envelopados utilizar glicoproteínas da membrana na sua superfície para mediar a entrada nas células hospedeiras. Análise estrutural tridimensional dessas glicoproteína 'picos' é muitas vezes um desafio técnico, mas importante para a compreensão da patogênese viral e na concepção de medicamentos. Aqui, um protocolo é apresentado para a determinação da estrutura viral pico através da média computacional de dados crio-tomografia eletrônica. Crio-tomografia eletrônica é uma técnica em microscopia eletrônica utilizada para obter reconstruções tridimensionais de tomografia de volume, ou tomografias, de espécimes biológicos pleomórficos, como vírus de membrana em um estado quase original, congelados hidratado. Estas radiografias revelam estruturas de interesse em três dimensões, embora com baixa resolução. Média Computacional de sub-volumes, ou sub-tomografias, é necessário obter maior detalhe resolução de repetir motivos estruturais, tais como picos de glicoproteínas virais. A abordagem computacional detalhado para aligning média e sub-tomografias utilizando o pacote de software Jsubtomo está delineado. Esta abordagem permite a visualização da estrutura de picos de glicoproteínas virais para uma resolução da ordem de 20-40 Å e estudo de estudo de interacções de ordem superior pico-a-pico na membrana viral. Os resultados típicos são apresentados por vírus Bunyamwera, um vírus com invólucro a partir da família Bunyaviridae. Esta família é um grupo estruturalmente diverso de patógenos que representam uma ameaça para a saúde humana e animal.

Introdução

Crio-tomografia de electrões é uma técnica de imagiologia de electrões crio-microscopia permitindo o cálculo de uma (3D) a reconstrução tridimensional de amostras biológicas complexas. Amostras adequadas variam de complexos purificados macromoleculares ^1, filamentos ^2, vesículas revestidas ³ e vírus membrana pleomórficos ⁴ para células procariotas todo ⁵ e até áreas finas de células eucarióticas inteiros ^6. Após a coleta de dados de uma série de inclinação, os volumes de tomografia 3D, ou tomografias, pode ser calculado utilizando vários pacotes de software estabelecidos, incluindo bsoft ⁷ e ⁸ Imod.

Dois aspectos inerentes ao estudo de amostras biológicas por limite de electrões crio-tomografia a interpretação biológica dos volumes tomográficos correspondentes. Em primeiro lugar, devido à dose de electrões limitado que pode ser aplicado a materiais biológicos antes de introduzir os danos da radiação significativa, signal-ruído proporções em dados tomográficos são tipicamente muito baixos. Em segundo lugar, como resultado da geometria inclinação amostra limitada durante a coleta de dados, alguns pontos de vista do objeto permanecer ausente, levando a uma chamada artefato 'cunha perdido "no volume tomográfica. No entanto, ambas as limitações podem ser superadas se o volume tomográfica contém repetição de estruturas idênticas, tais como complexos macromoleculares, que pode ser com sucesso em média ^9-12.

Antes da média de estruturas de reconstruções tomogram, objetos de interesse devem ser encontrados e alinhado com a mesma orientação. A localização das referidas estruturas pode ser obtida por correlação cruzada de uma estrutura de modelo no volume de tomografia por uma abordagem muitas vezes referida como modelo correspondente ^13. O molde utilizado neste processo de harmonização pode ser derivada a partir de electrões ou microscopia crio-electrão crio-tomografia combinada com a reconstrução em 3D, ou pode ser um mapa de densidade de simuladouma estrutura atômica. Vários pacotes computacionais foram desenvolvidos para realizar estas tarefas ^11.

Calculando a média dos picos de glicoproteína do vírus de membrana, tal como o HIV-1, tem sido uma abordagem particularmente bem sucedido para o estudo da sua estrutura ^14-16. Uma compreensão da estrutura é parte integrante para revelar tanto a base molecular das interações vírus-hospedeiro e orientar o desenvolvimento do projeto antiviral e vacina. Enquanto cristalografia de macromoléculas é a técnica preferida para a alta resolução (geralmente melhor do que 4 Â) a análise estrutural de glicoproteínas virais individuais e os seus complexos, as estruturas de raios-X resultantes deste método são de proteínas isoladas a partir do ambiente natural do membranoso virião . Deste modo, detalhes importantes, tais como a arquitectura de ordem superior de glicoproteínas virais, no contexto do virião, permanecem escassos. Por outro lado, de electrões e microscopia crio-reconstrução de partícula únicade vírus envelopados inteiras se restringe a partículas virais com simetria icosaédrica ^17,18. Electron cryotomography combinado com alinhamento sub-volumes foi assim que surgiu como uma técnica complementar que permite o estudo de spikes glicoproteína de forma irregular, vírus pleomórficos in situ.

Nós desenvolvemos software chamado Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) para a detecção, alinhamento e nivelamento de sub-volumes tomográficas. Jsubtomo tem sido utilizado na determinação da estrutura de um número de estruturas virais e celulares ^19-26. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado, que permite a determinação de estruturas de pico viral de superfície. Para contornar o excesso de refinamento de estruturas em média, correlacionando ruído, o esquema de refinamento 'padrão-ouro' é adotado ^10,27. Por fim, são discutidas estratégias para a visualização e interpretação dos resultados típicos.

Protocolo

Um protocolo detalhado para o alinhamento computacional e média posterior de spikes glicoproteína viral está delineado. O protocolo segue o fluxo de trabalho ilustrada na Figura 1, e combina uma pesquisa automática para os picos utilizando estruturas iniciais do molde e um refinamento da estrutura de padrão de ouro.

Os dados de entrada para este protocolo é um conjunto de reconstruções tomográficas das partículas virais. Uma tomografia contém um ou mais viriões. Inicialmente, um pequeno subconjunto de spikes é captado e usado para calcular a média e refinar dois modelos independentes manualmente. Estes modelos são utilizados para localizar automaticamente picos em todas as partículas virais. Finalmente, dois refinamentos independentes são executados e as médias resultantes são comparados e combinados para produzir a estrutura final.

A abordagem de refinamento é demonstrada por meio de programas do pacote Jsubtomo. Programas do pacote bsoft ²⁸ são utilizados para a imagem geral ptarefas rocessing e gráficos moleculares pacote UCSF Chimera ²⁹ é utilizado para visualizar os resultados. Os nomes dos programas individuais são dados em itálico e formatos de arquivo são indicados com extensões de arquivo maiúsculas.

Figura 1:.. Estratégia geral para a determinação de estruturas de complexos de glicoproteína pico de vírus membrana pleomórficos Os números correspondem a diferentes seções do Protocolo Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Extraindo Vírus Sub-volumes de Full-size tomogramas

1. Escolha partículas de vírus manualmente nas tomografias.
   1. Abra um arquivo de tomografia em bshow. Definir coordenar o centro de uma partic vírusle usando a ferramenta de colheita de partículas. Repita este passo até que todas as partículas virais foram processadas. Coordena Salvar vírus em um arquivo STAR.
   2. Repita o passo 1.1.1 até que todas as tomografias foram processados. Anote o diâmetro virion em pixels.
      NOTA: Se os pontos são difíceis de ver nas tomografias, use bfilter a low-pass filtrar o tomograms 80-A resolução (parâmetro "-bandpass 80,10000").
2. Execute jsubtomo.py no modo extrato (parâmetro "extrato --mode") para extrair virion sub-volumes para arquivos individuais de volume. Use os arquivos ESTRELA salvos na etapa 1.1.1 como arquivos de entrada.
   1. Dê um tamanho (parâmetro "--size") ~ 25% maior que o maior virion no conjunto de dados. Eg, se o virion é ~ 200 pixels de diâmetro, o uso de tamanho 250 x 250 x 250 pixels.
   2. Arquivos de saída dos volumes virion estará em MAP-formato. Além disso, criar um arquivo de estrela de acompanhamento para cada volume virion (parâmeter "--output").
3. Normalizar volumes virião em bimg (parâmetro "0,1 -rescale").

2 Geração de dois modelos iniciais Independentes

1. Escolha um subconjunto de pontos nas sub-volumes viral.
   1. Abra um arquivo MAP virion sub-volume bshow. Definir coordenar o centro de um ponto usando a ferramenta de partícula-picking, acessível através da janela da caixa de ferramentas. Repita este passo até que todos os picos claramente distintos foram processadas. Coordena Salvar pico em um arquivo STAR.
   2. Se necessário, repita o passo 2.1.1 para outros virions até cerca de 200 picos glicoproteína foram processadas. Nota dimensões pico em pixels.
      NOTA: ~ 200 pontos são uma orientação aproximada e muito mais podem ser necessários para algumas aplicações. Se possível, o objectivo de escolher spikes em diferentes orientações. Evite escolher apenas vistas superior.
2. Atribuir um vetor vista inicial para os picos executando jviews.py. Use os arquivos ESTRELA gerados na etapa 2.1.1 como arquivos de entrada.
   NOTA: Este vector vista aproxima na direcção da ponta, com referência ao virião.
   1. Use a coordenada central para atribuir os pontos de vista para um virion esférica. Por exemplo, se o virião é centrado (após o passo 1.2) em uma caixa com um tamanho de 250 x 250 x 250 pixels, o centro de coordenadas é 125125125 pixels (opção "--Radial 125125125").
   2. Para atribuir os pontos de vista para um virion filamentosos, abrir cada virion sub-volume bshow usando o arquivo ESTRELA definido no passo 2.1.1 do arquivo de entrada. Definir os dois pontos finais do filamento utilizando a ferramenta picking filamento e salve o arquivo STAR. Repita este passo até que todos os arquivos ESTRELA foram atualizados e executar jviews.py usando os arquivos atualizados ESTRELA como arquivos de entrada (--option Segment).
3. Gerar uma máscara espaço real usando jsubtomo_create_mask.py. Assegure-se que a máscara espaço real é das mesmas dimensiões como irá ser utilizado para a estrutura média (ver 2.6.2) e é suficientemente grande para conter tanto o espigão e uma mancha da membrana subjacente.
4. Gerar uma máscara espaço recíproco usando jsubtomo_create_wedgemask.py. A máscara de espaço recíproco é usado para excluir regiões na região 'faltando cunha' resultante de eixo único de coleta de dados tomográfica. Certifique-se de que ele é da mesma dimensão como vai ser utilizado para a estrutura média (ver 2.6.2).
5. Gerar um arquivo de seleção (arquivo SEL) definir virions pertencentes a grupos "1" e "2" usando jsubtomo_evenodd.py e os arquivos ESTRELA gerados na etapa 2.2.
6. Gerar duas médias iniciais usando jsubtomo_create_averages.py.
   1. Use o arquivo SEL gerado no passo 2.5 do arquivo de entrada.
   2. Dê um tamanho (parâmetro "--size"), pelo menos, 32 elementos de imagem maior do que a maior dimensão do espigão. Por exemplo, se o ponto é ~ 40 pixels longo, tamanho uso 72 x 72 x 72 pixels.
   3. Aplicar uma simetria elevada (por exemplo, c100) nas médias (parâmetro "c100 --symmetry"), para se aproximar de uma média cilíndrica em torno do eixo longo da espiga. Use simetrização para reduzir o ruído nas médias iniciais.
   4. Forneça um nome exclusivo para os arquivos do projeto (parâmetro "--suffix") de saída.
   5. Use a máscara de espaço real gerado no passo 2.3 para mascarar longe fundo (parâmetro "--mask"). Utilizar a máscara espaço recíproco gerado no passo 2.4 para compensar a perda de sinal introduzida pela presença de uma cunha em falta (parâmetro "--Mask").

Alinhamento iterativo 3 Gold-padrão e fazendo a média dos dois modelos pico inicial

Iterativamente alinhar e calcular a média dos dois modelos iniciais geradas na seção 2 com jsubtomo_iterate_gold.py.

1. Fase I. O objetivo desta etapa é refinar odireção do vetor view. O ficheiro é o ficheiro de entrada SEL gerado no passo 2.5.
   1. Use uma amostragem angular de 8 graus (parâmetro "--angles 8,8,8").
   2. Permitir alterações 16 graus na direção do vetor vista pico (parâmetro "--thetaphilimit 16"), mas manter o ângulo ao redor do pico longo eixo fixo (parâmetro "--alphalimit 0").
   3. Permitir que pequenas mudanças de translação (por exemplo, 5 pixels) para explicar imprecisões na colheita manual das espigas (parâmetro "--shiftlimit 5").
   4. Aplicar uma simetria elevada (por exemplo, c100) nas médias (parâmetro "c100 --symmetry"), para se aproximar de uma média cilíndrica em torno do eixo longo da espiga.
      NOTA: simetrização é usado para reduzir o ruído nas médias.
   5. Use a máscara de espaço real eo espaço recíproco máscara gerado nas etapas 2.3 e 2.4 para mascarar fora picos em volta e conta para a cunha faltando (parâmetros "--Mperguntar "e" --Mask ", respectivamente).
   6. Use os dois arquivos mapa gerado em 2.6 (denotado por tags "até" e "estranho" em seu nome) como modelos (parâmetros "--Template1" e "--Template2", respectivamente).
   7. Aplicar um filtro passa-baixa a 50-A resolução (parâmetro "--resolution") para evitar viés de alinhamento.
   8. Aplicar um factor de bin de 2 a acelerar o refinamento (parâmetro "--bin 2").
   9. Correr 5 iterações de alinhamento e média (parâmetros "--firstiter 1 --lastiter 5").
2. Estágio II. O objetivo desta etapa é refinar o ângulo ao redor do vetor vista. O arquivo de entrada é o arquivo SEL saída do passo 3.1.9.
   1. Medir as dimensões exatas do pico, abrindo o arquivo MAP filtrada passa-baixa gerada na última iteração na etapa 3.1.9 (indicado pela tag "_lp" em seu nome) em bshow. Gerar uma nova verdademáscara espaço semelhante ao passo 2.3, que define a ponta, mas não inclui a maior parte das membranas e picos vizinhos.
      NOTA: O tamanho ideal da máscara depende do tamanho e características da espiga.
   2. Use amostragem angular de 8 graus (parâmetro "--angles 8,8,8") como antes.
   3. Permitir alterações de 180 graus no ângulo ao redor do vetor vista pico (parâmetro "- alphalimit 180"), mas manter a teta e ângulos phi fixa (parâmetro "--thetaphilimit 0").
   4. Não permita que qualquer mudança de translação (parâmetro "--shiftlimit 0").
   5. Não aplique qualquer simetria nas médias (omitir o parâmetro "--symmetry").
   6. Utilizar a máscara espaço recíproco gerado no passo 2.4 para explicar a falta de cunha.
   7. Use os dois arquivos mapa gerado na última iteração da etapa 3.1.9 sem simetria (denotado por tags "even_nosym" e "odd_nosym" em seu nome) como modelos (parâmetros R20; - Template1 "e" --Template2 ", respectivamente).
   8. Aplicar um filtro passa-baixa a 50-A resolução (parâmetro "--resolution") na primeira iteração para evitar viés de alinhamento. Ajuste os parâmetros de filtro nas iterações subseqüentes automaticamente (parâmetro "--adaptivefilter") com base em Shell Fourier Correlação padrão-ouro (FSC) entre as duas médias independentes. Use 0.143-critério (parâmetro "--fsccrit 0,143"). Não permitir refinamento passado o primeiro zero da função de transferência de contraste (CTF) (parâmetros "--minhires"), a menos que de correcção CTF foi aplicada às radiografias.
   9. Execute 5-10 iterações de alinhamento e média (por exemplo, parâmetros "--firstiter 6 --lastiter 15"). Monitorizar as alterações na resolução relatado. Quando não há mudanças significativas são observados, o processo pode ser interrompido.
3. Avaliar o grau de simetria na estrutura por examining o arquivo resultante passa-baixa MAP filtrada (representado pela tag "_lp" em seu nome) em quimera. Eg, se o pico é um complexo trimeric, simetria de 3 vezes deve ser evidente.
4. Estágio III. O objetivo desta etapa é refinar o ângulo ao redor do vetor vista ainda mais com simetria correta. O ficheiro é o ficheiro de entrada SEL de saída a partir do passo 3.2.9. Os parâmetros são os mesmos que na etapa 3.2, com algumas excepções:
   1. Permitir alterações apropriadas no ângulo ao redor do vetor vista espiga. Por exemplo, se a estrutura tem uma simetria de 3 vezes, permitindo que as alterações de 60 graus no ângulo alfa (parâmetros "--alphalimit 60").
   2. Aplicar a simetria correta (por exemplo, c3) nas médias (parâmetro --symmetry c3 ").
   3. Use os dois arquivos mapa gerado na última iteração na etapa 3.2.9 (denotado por tags "mesmo" e "estranho" em seu nome) como arquivos de modelo de entrada (parâmetros "--Template1" e --Template2).
   4. Execute 5-10 iterações de alinhamento e média (por exemplo, parâmetros "--firstiter 16 --lastiter 25"). Monitorizar as alterações na resolução relatado. Quando não há mudanças significativas são observados, o processo pode ser interrompido.
5. Stage IV. O objetivo desta etapa é refinar com precisão todos os três ângulos ao mesmo tempo. O ficheiro é o ficheiro de entrada SEL de saída a partir do passo 3.4.4. Os parâmetros são os mesmos que na etapa 3.4, com algumas excepções:
   1. Permitir alterações 8 graus no ângulo ao redor do vetor vista pico (parâmetro "- alphalimit 8") e alterações de 8 graus na direção do vetor vista pico (parâmetro "--thetaphilimit 8"). Limitar as orientações a precisão de 4 graus (parâmetros "--angles 8,8,8 --iterate 2").
   2. Permitir que pequenas mudanças (por exemplo, 5 pixels) para explicar imprecisões nas etapas de alinhamento anteriores (parâmetro "--shiftlimit 5").
   3. USE, o dois arquivos mapa gerado na última iteração na etapa 3.4.4 (indicado por tags "até" e "estranho" em seu nome) como arquivos de modelo de entrada (parâmetros "--Template1" e --Template2).
   4. Execute 5-10 iterações de alinhamento e média (por exemplo, parâmetros "--firstiter 26 --lastiter 35"). Monitorizar as alterações na resolução relatado. Quando não há mudanças significativas são observados, o processo pode ser interrompido.

4. Geração e Alinhamento de sementes para a superfície do vírus para Template Matching

1. Gerar sementes localizadas uniformemente sobre a superfície virion para casamento de modelos e atribuir um vetor vista inicial para as sementes, executando jviews.py. Use os arquivos ESTRELA gerados na etapa 1.2.2 como arquivos de entrada. Gerar cerca de 1,5 vezes mais sementes do que o número esperado de spikes.
   NOTA: Este vector vista aproxima da direcção do pico mais próximo de cada ponto de sementes.
   1. Para gerar sementes distribuídas uniformemente em um virion aproximadamente esférica (parâmetro "--mesmo"), dar o raio (parâmetro "--radius"), a separação angular (por exemplo, 20 graus) das sementes (parâmetro "--angle 20" ) e coordenar o centro do virião. Por exemplo, se o virião é centrado (após o passo 1.2) em uma caixa com um tamanho de 250 x 250 x 250 pixels, coordenar o centro é 125125125 pixels (opção "--origin 125125125") .
   2. Para gerar sementes distribuídas uniformemente sobre uma partícula filamentosa, use o parâmetro "--Filament" e especificar o raio e os parâmetros de simetria helicoidal (subida e torção).
      Nota: Os parâmetros de simetria helicoidais são usadas aqui apenas como uma maneira conveniente de definir posições de sementes distribuídas uniformemente e que não precisam refletir a ordem real dos picos sobre o filamento.
2. Gerar duas médias independentes de superfície do vírus como explained na seção 2.
   1. Gerar um ficheiro de definição de viriões SEL pertencentes a conjuntos de "1" e "2" usando jsubtomo_evenodd.py e os arquivos ESTRELA gerados no passo 4.1.
      NOTA: Para garantir a independência das bases de dados, qualquer atribuição anterior das partículas virais em grupos "1" e "2" deve permanecer o mesmo.
3. Limitar a posição das sementes.
   1. Siga as instruções na etapa 3.1, salvo indicação contrária. Use o arquivo SEL gerado na etapa 4.2.1 do arquivo de entrada.
   2. Permitir que as sementes para deslocar apenas ao longo da normal à membrana (parâmetro "--zshiftlimit"). Ajustar a quantidade permitida de mudança dependendo da quantidade de viriões desviar geometria esférica ideal (por exemplo, o parâmetro --zshiftlimit 25 ").
   3. Use os dois arquivos mapa gerado no passo 4.2 (indicado por tags "mesmo" e "estranho" em seu nome) como arquivos de modelo de entrada (parâmetros "--TemPLATE1 "e --Template2).
   4. Use um sufixo exclusivo para evitar a substituição dos arquivos ESTRELA entrada original (por exemplo, o parâmetro "--suffix _seeds").
   5. Use criação de faixas de 4 a acelerar o cálculo (parâmetro "--bin 4") e um filtro passa-baixo (por exemplo, o parâmetro "--resolution 50").
4. Gerar arquivos marcador Quimera (CMM) dos arquivos ESTRELA semente refinados usando jviews.py (parâmetro "--cmm"). Examine as sementes, abrindo os arquivos CMM (e os arquivos virion mapa associado) em quimera. Certifique-se de que as sementes refinados estão alinhados corretamente em relação à membrana de vírus.
   NOTA: As cores diferentes podem ser usados ​​para diferenciar conjuntos separados de marcadores (parâmetro "--color"). Alternativamente, os marcadores de refinado pode ser colorido com base no seu coeficiente de correlação cruzada (por exemplo, o parâmetro "--fomcolor 0.1,0.3").

5. Ouro standard iterativo Alinhamento e calculando a média da Estrutura de Spike

Localize automaticamente todos os picos nos sub-volumes virion usando correspondentes modelo local em torno das sementes refinados e alinhar e calcular a média dos picos localizados. Use as médias geradas a partir de um subconjunto de pontos colhida manualmente, como modelos iniciais.

1. Executar a correspondência modelo local em torno das sementes a média de todos os pontos usando jsubtomo_iterate_gold.py programa. Siga as instruções na etapa 3.5, salvo indicação contrária.
   1. O ficheiro é o ficheiro de entrada SEL para as sementes refinadas gerados no passo 4.3.
   2. Use um limite suficientemente grande para o ângulo de visão do vetor. Eg, se as sementes foram gerados a cada 20 graus (passo 4.1), use um ângulo um pouco maior que a metade desse valor (parâmetro "--thetaphilimit 12"). Permitir alterações apropriadas no ângulo ao redor do vetor vista espiga.
   3. Permitir sementes para deslocar no plano da membrana (parâmetro"--xyshiftlimit"). Por exemplo, se a distância de sementes-de-semente é de 25 pixels, use total de mudança pouco mais da metade disso (por exemplo, os parâmetros "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
      NOTA: Adicionais deslocamentos de translação pode ser necessária se os arquivos de mapa gerado no passo 3.5 são centradas em uma distância diferente do centro da virion do que as sementes.
   4. Use os dois arquivos mapa gerado no passo 3.5 (denotado por tags "até" e "estranho" em seu nome) como arquivos de modelo de entrada (parâmetros "--Template1" e --Template2).
   5. Use a resolução atual dos arquivos de mapa gerado no passo 3.5 (parâmetro --resolution).
   6. Execute 5-10 iterações de correspondência modelo, alinhamento e nivelamento (por exemplo, parâmetros "--firstiter 1 --lastiter 10"). Monitorizar as alterações na resolução relatado. Quando não há mudanças significativas são observados, o processo pode ser interrompido.
   7. Após cada iteração, Excluindo hits sobrepostas. Eg, se a largura do pico é de 30 pixels, excluindo hits que estão mais perto de 30 pixels para outros sucessos (parâmetro "--mindist 30").
   8. Excluir hits com uma correlação cruzada baixo coeficiente. Por exemplo, incluir os melhores 75% picos para cada virião (parâmetro "--topp 75").
      NOTA: hits com uma correlação cruzada baixo coeficiente é provável que representam acessos falsos positivos.

6. visualização dos resultados

1. Abra a estrutura refinada do pico de quimera para visualização e montagem de estruturas atômicas.
   1. Use o arquivo MAP filtrada passa-baixa (representado pela tag "lp") criado na iteração final na etapa 5.1.6 do arquivo de entrada.
   2. Use a resolução indicada na etapa 5.1.6 para cross-correlação baseada montagem em quimera "Fit no Mapa" ferramenta.
2. Criar um modelo composto da VIRIOn usando jsubtomo_create_model.py.
   1. Use o arquivo MAP filtrada passa-baixa (representado pela tag "lp") criado na iteração final na etapa 5.1.6 como o arquivo MAP entrada (parâmetro "--template").
   2. Use um arquivo ESTRELA gerado na iteração final na etapa 5.1.6 como o arquivo de entrada STAR.
   3. Use o arquivo de máscara gerado na etapa 3.2.1 para explicar a sobreposição densidades no modelo composto (parâmetro "--mask").
   4. Indicam o tamanho do ficheiro virião MAP para gerar um modelo compósito do mesmo tamanho (parâmetro "--size").
3. Abra o modelo compósito para a visualização em quimera.

Resultados

Nós demonstrar a aplicação do fluxo de trabalho média sub-tomograma descrito acima para a glicoproteína do envelope do vírus complexo Bunyamwera (Orthobunyavirus Bunyaviridae) utilizando dados publicados anteriormente definido ^24. Recolha de dados e refinamento parâmetros listados na Tabela 1. Uma tomografia representativo é mostrado na Figura 2.

Parâmetro (unidade)	Valor
A coleta de dados
Tensão (kV)	300
Ampliação calibrado (X)	111000
O tamanho do pixel (Å)	5.4
Dose estimada (e - / a 2)	100
Underfocus (im)	4,0-4,5
Primeiro de zero CTF (A) um	26-30
Faixa de inclinação (°)	-60-60
Amostragem Tilt (°)	3
Dados e requinte
Tomogramas	11
Virions	29
Sementes por virion	106
Número total de sementes	3074
Spikes detectado	1346
Spikes após eliminar sobreposições	1401
Spikes após seleção com base correlação cruzada	1022
Spikes incluídos na média final	1022
Simetria	C3
A amostragem angular (°)	8
Resoluçãogama utilizada no refinamento (Å)	42-334
Estimativa resolução final (a) b	35

Tabela 1: coleta de dados e estatísticas Bunyamwera refinamento.
^FTC, a função de transferência de contraste.
^b Calculado utilizando a correlação de shell Fourier entre duas estruturas de forma independente refinados em um limite de 0.143.

Figura 2:. Fatia através de uma tomografia de viriões Bunyamwera Diversas vistas laterais pico evidente na periferia de cada vírus são indicadas por pontas de seta. A tomografia tem sido baixa-pass filtrada a 60 Å. A barra de escala de 100 nm.

Primeiro, temos refinado um modelo inicial usando 205 pontos escolhidos manualmente ( A Figura 3). Simetria Trina do centro-maior pico foi evidente, sem aplicar qualquer simetria (Figura 3B) e foi imposta nas rodadas posteriores de refinamento (Figura 3C). Para a detecção de todos os picos automaticamente sobre as superfícies de virião, geramos 106 sementes para cada virião no raio de 43 nm e um espaçamento de 20 graus (Figura 4A) e iterativamente refinado suas posições em relação à membrana (Figura 4B).

Figura 3: O refinamento da estrutura do modelo inicial. (A) cilíndrica média (C100) modelo construído a partir de posições definidas manualmente de spikes. (B) densidade médio depois de cinco rodadas de refinamento sem qualquer simetria (C1) imposta exibe um pico com três dobrascaracterísticas simétricas. A resolução do modelo é de 48 Å. (C) Média do pico foi resolvido em 41 Å após cinco rodadas de refinamento com simetria tripla.

Figura 4:. Refinamento das sementes AB) Um subconjunto de sementes antes (A) e após (B) requinte são mostrados em uma densidade virion na Figura 2 Sementes em (B) foram codificados por cores com base no respectivo cruzada. coeficientes de correlação (azuis, baixa correlação; vermelho, alta correlação).

Os melhores correlacionando glicoproteína manchas Spike (75% superior após eliminar sobreposições; ~ 1.000 pontos) foram utilizados para calcular a média final. A média foi resolvido a 35 uma resolução (Figura 5). Ele revelou uma estrutura pico trimeric no meio, emAlém de alguma contribuição de seis picos vizinhos. Modelos compostos dos viriões, calculadas através da colocação da estrutura nas posições conhecidas, revelado colocação dos espigões na superfície do virião (Figura 6A). Ocasionalmente, patches de ordenados localmente de spikes eram evidentes (Figura 6B).

Figura 5: estrutura refinada de um patch da camada de glicoproteína pico após casamento de modelos. (AB) Dois mapas 'even' e 'estranho', de reconstrução de duas metades de os dados são mostrados. Os dois mapas mostram um notável grau de similaridade, verificando a válido até da abordagem. A orientação em torno do eixo longitudinal é diferente espiga como os dois mapas foram reconstruídos completamente independente um do outro. (C) Média dos dois mapas é mostrado naa resolução final de 35 Å.

Figura 6: Colocação dos picos sobre o virion Bunyamwera. (A) modelo composta de um viral. Exibir vetores (varas) indicam as orientações das espigas. As cores indicam a correlação cruzada entre cada ponto ea estrutura do modelo (azul, baixa correlação; vermelho, alta correlação). (B) Um close-up de um tapa-ordenada de spikes.

Discussão

O conhecimento da estrutura de glicoproteína pico viral no virião membrana é essencial para a replicação do vírus a compreensão e desenvolver agentes terapêuticos para tratar e prevenir a infecção. Electron crio-microscopia combinado com média única partícula surgiu como o método mais utilizado para resolver as estruturas de partículas de vírus envelopados, incluindo os picos de glicoproteínas. No entanto, este método está limitado a icosahedrally vírus simétricas. Aqui, através da aplicação da eletrônica de crio-tomografia e subtomogram médias na Jsubtomo, nós descrevemos um protocolo geral para determinar pontos de glicoproteínas em pleomorphic envolto vírus que não são passíveis de outros métodos de biologia estrutural atuais. Nossos resultados representativos demonstrar que a resolução deste método é suficiente para revelar insights sobre arquitetura de domínio, oligomerização e maior organização a fim de spikes glicoproteína em virions intactas.

jove_content "> O passo mais importante dentro deste protocolo está construindo dois modelos de partida de confiança que são estatisticamente independentes uma da outra execução. bem-sucedida desta etapa pressupõe que os picos de glicoproteínas são suficientemente grandes e não embalados uns contra os outros com muita força, de modo que os picos individuais podem ser visualmente reconhecido e manualmente pegou no tomografias, e dois modelos independentes média. Se isso não for possível, duas modificações no protocolo pode ser tentada. Primeiro, dois modelos aleatórias independentes pode ser construído definindo primeiro dois subconjuntos aleatórios de subtomograms e depois média das subtomograms dentro destes subconjuntos ^30. Em segundo lugar, se uma estrutura do pico isolado foi obtido por outros meios, por exemplo por cristalografia de raios-X, que pode ser utilizado como um modelo de partida. No entanto, deve ser tomado cuidado para baixo teor Filtro passa este modelo usando uma baixa resolução de corte (50-70 Å), como os dois modelos resultantes na próxima rodada de refinamento iráser estatisticamente independentes para além desse resolução. Devido a esta ressalva, é recomendável a abordagem anterior.

A resolução obtida a partir deste protocolo depende de quatro fatores principais: i. estratégia de recolha de dados e a qualidade dos dados de entrada, ii. número das subtomograms, iii. a precisão do alinhamento das subtomograms, e iv. heterogeneidade das estruturas. Embora a primeira e segunda limitação pode ser largamente ultrapassado usando detectores de sinal de alta-ruído directa de electrões, combinados com CTF corrigido tomografia e recolha automática de dados, a precisão do alinhamento é mais afectada pelo tamanho e forma da estrutura do próprio interesse. Ao aplicar este protocolo em pequenas pontas que faltam características proeminentes, pode ser vantajoso para ligar fragmentos Fab para o pico para melhorar a precisão do alinhamento e, portanto, resolução ^31. Finalmente, se as estruturas a serem médios exibem várias conformações, sub-Tomogrmétodos de classificação am pode ser utilizado para calcular a média conformações diferentes separadamente. Para o efeito, Jsubtomo integra com o pacote Dynamo, oferecendo classificação poderoso subtomogram ^9.

O protocolo anterior é complementar a cristalografia de raios-X de glicoproteínas virais isoladas. Estruturas cristalográficas pode ser montada em médias de sub-tomogram para obter a orientação precisa da glicoproteína com respeito à membrana viral. A aplicação desta metodologia, sem dúvida, continuar a lançar luz sobre a estrutura do vírus envelopado e pathobiology.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Jsubtomo (ver 1.3.1)	Universidade de Oxford	n/a	www.opic.ac.uk/jsubtomo
Bsoft (ver 1.8.7)	NIAMS, NIH	n/a	bsoft.ws
UCSF Chimera	UCSF	n/a	www.cgl.ucsf.edu/chimera