Este artigo vídeo descreve um método de microarray baseado in vitro para determinar os genes alvos e sítios de ligação para dois reguladores de resposta do sistema de componentes.
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Artigo de método
DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os métodos in vivo, tais como Chip-chip são técnicas bem estabelecidas usados para determinar genes alvos globais para fatores de transcrição. No entanto, eles são de uso limitado na exploração de dois sistemas de regulação componente bacteriano com condições de ativação descaracterizados. Tais sistemas de regular a transcrição apenas quando activada, na presença de sinais únicos. Uma vez que estes sinais são muitas vezes desconhecidos, o método de microarray com base in vitro descritos neste artigo de vídeo podem ser utilizados para determinar alvos de genes e sítios de ligação para reguladores da resposta. Este método de ADN purificado por afinidade-chip pode ser utilizado para qualquer regulador purificada em qualquer organismo com um genoma sequenciado. O protocolo envolve permitindo que a proteína purificada marcado para se ligar ao DNA genómico cortado e, em seguida, a purificação por afinidade de ADN ligado à proteína, seguido de marcação fluorescente do ADN e hibridação com uma matriz de ladrilhos costume. Precedendo passos que podem ser utilizados para optimizar o ensaio para a especificidadereguladores c também são descritos. Os picos gerados pela análise dos dados de matriz são utilizados para prever motivos sítios de ligação, que são, em seguida, validada experimentalmente. As previsões motivo pode ser ainda utilizado para determinar genes alvos dos reguladores de resposta ortólogos em espécies estreitamente relacionadas. Nós demonstramos a aplicabilidade deste método através da determinação dos genes alvos e motivos do site vinculativo e prevendo, assim, a função de um regulador de resposta DVU3023-dependente sigma54 na bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ambiental.
Introdução
A capacidade das bactérias para sobreviver e prosperar é criticamente dependente da forma como eles são capazes de perceber e responder a perturbações em seus ambientes, e este por sua vez é dependente de seus sistemas de transdução de sinal. O número de sistemas de sinalização uma bactéria codifica tem sido chamado o seu "QI microbiana" e pode ser uma indicação de ambos variabilidade do seu ambiente e da sua capacidade de sentir múltiplos sinais e afinar a sua resposta 1. Dois sistemas de componentes de transdução de sinal (TCS) são os sistemas de sinalização mais prevalentes utilizados por bactérias, e que consistem de uma histidina-quinase (HK), que det....
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Protocolo
Nota: O protocolo a seguir é adaptado para determinação de genes alvos do DVU3023 RR da bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Ele pode ser adaptado a qualquer outro regulador transcricional de interesse.
1. Clone e Purify RR
- Clonar o gene RR, especificamente DVU3023, de D. vulgaris Hildenborough num vector de expressão de Escherichia coli de modo a que o gene é o C-terminal marcado com His e de expressão está sob o controlo de um promotor de T7.
Nota: Vários métodos de clonagem pode ser utilizado e é determinado pelo investigador. Também podem ser utilizados marcadores de afinidade alt....
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Resultados
O método acima foi aplicado para determinar os genes alvos globais dos RRS no sulfato de modelo reduzindo bactéria Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Este organismo tem um grande número de TCS representado por mais de 70 RRS, indicando a vasta variedade de possíveis sinais que detecta e responde. Análise in vivo sobre as funções destes sistemas de sinalização são difíceis de realizar uma vez que os sinais e, assim, as suas condições de activação são desconhecidos. Aqui o método DAP-chip.......
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Discussão
O método DAP-chip aqui descrito foi utilizado com sucesso para determinar os genes alvos para vários RRS em Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 dos quais um é mostrado aqui como um resultado representativo. Para RR DVU3023, escolhendo um alvo gene candidato foi simples. DVU3025 está localizado imediatamente a jusante do gene RR, e os genes-alvo e RR são conservadas em diversas espécies Desulfovibrio, e adicionalmente DVU3025 tem um promotor dependente de sigma54 previsto. O EMSA fornece u.......
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Divulgações
Os autores não têm qualquer conflito de interesse de divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Amy Chen por sua ajuda na preparação para a filmagem do vídeo e para demonstrar a técnica. Este trabalho realizado pelo ENIGMA: Ecossistemas e redes integradas com os genes e Assembléias Molecular (http://enigma.lbl.gov), um programa científico da área de foco no Lawrence Berkeley National Laboratory, foi apoiado pelo Escritório de Ciência, Instituto de Ciências Biológicas e Pesquisa Ambiental, do Departamento de Energia dos EUA sob Contrato n º DE-AC02-05CH11231.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Coluna HisTrapFF (coluna Ni-Sepharose) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
| Akta explorer (instrumento FPLC) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
| Coluna de dessalinização HiPrep 26/10 | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
| Kit de extração de gel Qiaquick | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
| Oligonucleotídeos marcados com biotina | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| 6% poliacrilamida-0,5x TBE mini gel pré-moldado de retardamento de DNA | Life Technologies, Grand Island, NY, EUA | EC63652BOX | Como alternativa, você pode derramar seu próprio gel. |
| Membrana de nylon | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD Célula de transferência eletroforética semi-seca | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
| Papel de borrão extra grosso, 8 x 13,5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
| Reticulador UV Modelo XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| Kit de detecção quimioluminescente de ácido nucleico (Pierce) | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, EUA | 89880 | |
| Resina de agarose Ni-NTA | Qiagen Inc, Valencia, CA, EUA | 30210 | |
| GenomePlex Kit de amplificação do genoma completo (tampão de fragmentação, tampão de preparação de biblioteca, solução de estabilização de biblioteca, enzima de preparação de biblioteca, master mix de amplificação 10x, polimerase WGA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA | Para quantificação de DNA | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix, com ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | Qualquer mistura de PCR Sybr Green pode ser usada |
| PlateMax Filme de selagem a quente ultra claro para qPCR | Axygen | ||
| [cabeçalho] | |||
| Microplaca de PCR de perfil baixo transparente de 96 poços | Life Technologies, Grand Island, NY, EUA | PCR-96-LP-AB-C | |
| Applied Biosystems StepOne Plus Sistema de PCR em tempo real | Life Technologies, Grand Island, NY, EUA | 4376600 | Qualquer sistema de PCR em tempo real pode ser usado |
| Kit de purificação de PCR Qiaquick | Qiagen Inc, Valencia, CA, EUA | 28104 | Qualquer kit de limpeza de PCR pode ser usado |
| Nonamers marcados com Cy3/Cy5 | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, EUA | N46-0001, N46-0002 | |
| Klenow polimerase 50.000 U/ml, 3'-5' exo- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
| Sistema de hibridização | Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA | N/A | Esta empresa não fabrica mais matrizes ou itens relacionados, portanto, fontes alternativas como Agilent ou Affymetrix precisarão ser usadas. |
| Microarrays e misturadores impressos sob encomenda | Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA | N/A | |
| Kit de hibridização (2x tampão de hibridização, componente de hibridização A, oligo de alinhamento) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA | N/A | |
| Kit de tampão de lavagem (10x tampão de lavagem I, II, III, 1 M DTT) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA | N/A | |
| GenePix 4200A scanner | de microarrayDispositivos moleculares, Sunnyvale CA, EUA | Este modelo foi substituído por superiores | |
| GenePix Pro software de microarray | Molecular Devices, Sunnyvale CA, EUA | ||
| Nimblescan v.2.4, software de análise de chip ChIP | Roche-Nimblegen, Madison, WI, EUA | N / A |
Referências
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol.
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