Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

Summary

Matriz CGH para a detecção de variantes do número de cópia genômicas substituiu análise do cariótipo G-unida. Este artigo descreve a tecnologia e sua aplicação em um laboratório de serviço de diagnóstico.

Abstract

Array CGH para a detecção de variantes do número de cópias genômicas substituiu a análise do cariótipo com banda G. Este artigo descreve a tecnologia e sua aplicação em um laboratório de serviço de diagnóstico clínico. O DNA extraído da amostra de um paciente (sangue, saliva ou outros tipos de tecido) é marcado com um fluorocromo (cianina 5 ou cianina 3). Uma amostra de DNA de referência é marcada com o fluorocromo oposto. Segue-se uma etapa de limpeza para remover nucleotídeos não incorporados antes que os DNAs marcados sejam misturados e ressuspensos em um tampão de hibridização e aplicados a uma matriz composta por ~ 60.000 sondas de oligonucleotídeos de loci em todo o genoma, com alta densidade de sonda em áreas clinicamente importantes. Após a hibridização, as matrizes são lavadas, depois digitalizadas e as imagens resultantes são analisadas para medir a fluorescência vermelha e verde para cada sonda. O software é usado para avaliar a qualidade de cada medição de sonda, calcular a proporção de fluorescência vermelha para verde e detectar possíveis variantes do número de cópias.

Introduction

Ficou conhecido por muitos anos que deleções ou cópias extras de segmentos cromossômicos causam deficiência intelectual, dismorfismo e malformações congentical e, em alguns casos, causar síndromes genéticas ^1. No entanto, a única tecnologia disponível até meados dos anos 2000 para a detecção de todo o genoma dessas mudanças foi G-unida análise cromossômica, que tem uma resolução de cerca de 5-10Mb, dependendo da região e da natureza do problema, e que não pode detectar cromossomas anormais onde o material foi substituída por uma região de um cromossoma diferente, com o mesmo padrão de bandas. Técnicas de citogenética auxiliares, tais como hibridização<....

Protocol

Reação 1. Rotulagem

1. Antes de usar, dUTPs pré-aliquota de cianina 3 e 5 nucleótidos marcados, não marcados e iniciadores aleatórios para as concentrações recomendadas pelo fabricante em placas e armazenamento de 96 poços a -20 ° C prontas para utilização. Para efeitos do presente protocolo, alíquota de 10,5 mL da dUTP marcado adequado e 10,5 ul nucleotídeos não marcados e iniciadores aleatórios a cada poço.
2. Descongelar o prato pronto-para-uso de 96 poços de nucleótidos e os iniciadores a 4 ° C durante cerca de 1 hora, protegidas da luz.
3. Uma vez descongelado, esta placa equilibrar à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos, ao a....

Results

Cada sonda numa matriz hibridado é visualizado como uma mistura de vermelho e verde fluorocromos (ver Figura 1). A relação do vermelho ao sinal verde fluorescente para cada sonda é quantificado pelo scanner e software associado traça estes como rácios log2 acordo com sua posição genômica, e identifica regiões abrangidas limites predefinidos fora. Os traços da matriz resultantes permitem a interpretação de regiões identificadas como genomicamente desequilibrado. Por exemplo, o rastreio a partir de uma cr.......

Discussion

Matriz CGH não vai detectar rearranjos equilibrados ou anormalidades ploidy como triploidy. Além disso, o baixo nível de desequilíbrios do mosaico não pode ser detectado. No entanto, array CGH tem uma resolução maior para a detecção CNV de análise cromossômica G-unida qual substituiu em muitos laboratórios de citogenética. É, por conseguinte, o padrão de ouro para detecção de corrente de CNV de todo o genoma. Ele pode ser substituído por tecnologias de sequenciamento de próxima geração no futuro, mas atualmente, seus cu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microarray CGH 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH tampões de lavagem	Agilent	5188-5226
Array CGH hibridização Buffer	Agilent	5188-5380
Minelute kit de purificação	Qiagen	28006
Array CGH kit de rotulagem	Enzo	ENZ-42672-0000