Artigo de método

Um Ensaio Comportamental simples para Teste de Função Visual em

DOI:

10.3791/51726

⸱

12 de junho de 2014

 , 
1Ophthalmology Department, Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University

Neste artigo

Resumo

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Girinos de Xenopus laevis preferem nadar no lado branco de um tanque preto / branco. Este comportamento é guiado pela sua visão. Com base nesse comportamento, apresentamos um ensaio simples para testar a função visual de girinos.

Resumo

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Medição da função visual nos girinos do sapo, Xenopus laevis, permite a triagem para a cegueira de animais vivos. A resposta optocinéticos é, um comportamento reflexiva à base de visão que tem sido observada em todos os vertebrados testados. Girino olhos são pequenos para que a resposta da cauda da aleta foi usada como medida alternativa, o que requer um técnico treinado para registrar a resposta sutil. Foi desenvolvido um ensaio de comportamento alternativo, baseado no facto de que os girinos preferem nadar no lado branco do tanque, quando colocado num tanque com lados tanto a preto e branco. O ensaio aqui apresentado é uma alternativa de baixo custo, simples que cria uma resposta que pode ser facilmente medido. A instalação consiste em um tripé, webcam e tanques de teste aninhados, prontamente disponível na maioria dos laboratórios de Xenopus. Este artigo inclui um filme que mostra o comportamento de girinos, antes e depois do corte do nervo óptico. A fim de testar a função de um olho, também incluem represenresultados representativa de um girino em que cada olho sofreu axotomia da retina em dias consecutivos. Estudos futuros poderia desenvolver uma versão automatizada deste ensaio para testar a visão de muitos girinos de uma só vez.

Introdução

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Xenopus laevis foram utilizados como um organismo modelo para estudar a formação do olho. Os olhos se desenvolvem rapidamente, crescendo para a maturidade em menos de uma semana para testar genes ou vias que têm um efeito sobre o desenvolvimento visual e função. Para testar a função visual, a resposta optocinéticos optomotor e tem sido usado em peixes-zebra e girinos de Xenopus, respectivamente, de 1,2. Porque os olhos de girinos de Xenopus são relativamente menores do que peixe-zebra, este ensaio requer o uso de equipamento especializado e pessoal treinado para detectar o comportamento sutil cauda-flip e olho-movimento em Xenopus. Um comportamento mais robusto em Xenopus é a preferência para nadar em um tanque com um fundo branco, que é aqui descrito 3. Ao colocar um girino em um tanque preto / meia branca meia, o girino pré-metamórfica nada rapidamente para o lado branco do tanque. Nós anteriormente utilizado neste ensaio para determinar se o derivado de células pluripotentesolhos eram funcional 4. Aqui, apresentamos uma versão detalhada deste ensaio, que pode ser usado para testar a função visual de girinos de Xenopus premetamorphic.

Este ensaio é mais simples do que o ensaio de resposta optomotor, uma vez que requer apenas uma câmara de vídeo montada digital, câmera digital e software de equipamentos padrão encontrado na maioria dos laboratórios de Xenopus. Além disso, a resposta registrada não requer nenhum treinamento especial para resultados tally. Nossos resultados representativos mostram que o mesmo grupo de girinos, tendo sofrido axotomia retina dupla, nadam aleatoriamente em torno do tanque. Também foram incluídos os resultados do ensaio de comportamento de um girino representativo, mostrando como um olho podem ser testados para a resposta visual. A folha de cálculo foi incluída de modo que os números adquiridos durante o ensaio pode ser inserido e analisados. Esta folha pode ser utilizado para determinar se os girinos testados têm uma resposta visual.

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Protocolo

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Animal Care

A Xenopus laevis girinos utilizados neste estudo foram cultivados, criados e tratados de acordo com procedimentos aprovados pelo Upstate Medical University IACUC eo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Instalação Pré-comportamento: Os girinos

  1. Obter embriões de Xenopus fertilizados a partir de uma fonte disponível comercialmente ou fertilizar os oócitos in vitro, como descrito anteriormente 6.
  2. Coloque blastula de embriões em estágio placa neural em 18 ˚ C em 60 milímetros placas de Petri contendo 0,1 X MMR [10 Modificado estoque solução (MMR) de Ringer de X Marc (10 mM MgCl2, KCl 20 mM, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES; NaCl 1 M; ajustado para pH 7,5, autoclavado e armazenado a temperatura ambiente)] com 50 ug / ml de antibiótico gentamicina. Mude 0,1 X MMR cada dia e remover quaisquer embriões mortos.
  3. Uma vez que os embriões atingem Nieuwkoop e Faber fase ~ 27-30 julho, mude ªe embriões em 0,1 X MMR sem antibiótico para permitir o crescimento de bactérias do intestino.
  4. Crescer os girinos até que atinjam a fase de alimentação (fase 45) e movê-los em 100 milímetros placas de Petri cheias de 0,1 X MMR. Alimentá-los urtiga sobrenadante pó todos os dias durante uma semana, mudando a 0,1 X MMR no dia de intervenção.
  5. Depois de uma semana na 100 milímetros placa de Petri, mova animais para meia galão tanques cheios de água sapo [0,5 g / L oceano instantâneas e 2 mM de sódio dibásico (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Alimente-os como no passo 2.4, mas mudar a água apenas 2-3 vezes por semana, quando a água está turva. Manter os animais em um 12 horas light/12 ciclo claro-escuro com as luzes de ligar às 6 da manhã.
  6. Coloque o tanque de meio litro com os assuntos de teste em uma superfície branca, como um resguardo bancada do laboratório, pelo menos 12 horas O / N, antes do teste.
  7. Girinos de teste nas fases 45 a 50, tal como descrito no passo 3 abaixo.

. 2 Configuração Pré-comportamento: Equipment

  1. Separe uma área do laboratório para o ensaio de comportamento. Ele deve estar em uma área tranquila, de baixo tráfego, com iluminação fluorescente padrão.
  2. Prepare os tanques de teste para os animais.
    Os aninhados, tanques de teste de meio-litro são compostos de duas partes: um tanque interno que vai segurar a água e girinos; e um tanque exterior com o estímulo visual.
    1. Para o tanque interno, fazer uma pequena marca nos cantos externos com um Sharpie, a 5 cm do fundo; esta é a linha de água (Figura 1A, linha pontilhada verde).
    2. Além disso, para o tanque interno, preencha os divets no tanque (nos cantos e no centro) com um composto inerte, como Sylgard elastômero. NOTA: Os girinos permanecerá nestas áreas se não forem preenchidos
    3. Para o tanque exterior, cobrem exactamente a metade do lado de fora de um tanque com uma fita isolante preto e a outra metade com o tecido de papel branco Figura 1B.
  3. Colocar os tanques nainoculando plataforma giratória.
  4. Configuração da webcam / tripé para que ele está acima dos tanques de teste. Ajustar a câmara para permitir a visualização de área de teste, tal como mostrado na Figura 1C.
  5. Conecte a webcam ao computador com o software QuickTime Player instalado 5. Ligue a câmera. No QuickTime Player, em Arquivo, selecione 'New Gravação de filme. " A configuração do ensaio de comportamento será visível no computador imediatamente.
  6. Estenda um pano de algodão leve ao longo de toda a instalação para reduzir a estímulos externos que podem afetar o comportamento de girinos, bem como, reduzir a luz refletida na superfície da água.
  7. Certifique-se que a luminosidade no âmbito das medidas de pano entre 35-50 cd / m 2.

3. Assay Comportamento

  1. Encha o tanque de provas interior para a marca de 5 cm de água feita no passo 1.2.1 com água sapo.
  2. Usando uma pequena rede, mova suavemente o animal para dentro do tanque de teste interno.
  3. Abrir QuickTime software no computador e, usando o tanque exterior como um guia, certifique-se de que a câmera é capaz de visualizar e registrar a área de testes.
  4. Escreva o nome dos animais, data e hora em um pedaço de papel e gravar com a câmera.
  5. Coloque o tanque de teste para o tanque exterior com o lado negro do tanque para a direita Figura 2.
  6. Comece a gravar o filme imediatamente depois de organizar o tanque e ajustar o temporizador para 2 min.
  7. Quando os beeps temporizador, remova o tanque de teste interno, gire o tanque exterior de 180 ° e coloque o tanque de teste interno dentro do tanque externo. Inicie o cronômetro. Nota: o lado negro deve ser agora no outro lado.
  8. Repita o passo 3.7, mais oito vezes para um total de dez ensaios. Use a Figura 2 como um guia, riscando cada julgamento.
  9. Repetir o ensaio de comportamento em dois dias separados.

4. Retinal axotomia

  1. Coloque o animal em 0,02% tricaina até que eles não respondempara uma pitada de cauda com um # 3 fórceps.
  2. Derreta 1% de agarose em 0,1 X MMR e, em seguida, adicionar a uma 60 milímetros placa de Petri. Uma vez arrefecido, fazer uma pequena torrão rectangular na agarose e adicionar o girino para o torrão com um pouco de 0,02% tricaína, de modo que o animal está parcialmente submerso no líquido.
  3. Perfurar a pele a um ângulo de 45 graus atrás região dorsal do olho com uma agulha 25 G, enquanto que preparando o animal contra uma pinça sobre o lado oposto.
  4. Tomando cuidado para não cortar a veia, que fica próximo ao nervo óptico, cuidadosamente chegar no buraco com # 5 fórceps, cortar o nervo óptico e lançá-lo para fora do caminho. Se houver hemorragia grave devido a acidentalmente cortando a artéria, em seguida, coloque rapidamente o animal em 2% tricaina a eutanásia. CUIDADO: solução tricaina 2% pode causar dormência em seres humanos. Esta solução deve ser manuseado com luvas.
  5. Para recuperar o animal após a cirurgia, coloca animal em placa de 100 mm de Petri com 0,7 X MMR e 50 ug / ml de gentamicina, durante 20 min. Next, transferência de girino para tanque de recuperação com água sapo. Deixe descansar animais O / N.
  6. Na manhã seguinte, o teste da função visual, como descrito acima (etapas 3,1-3,9).

5. Analisar os Resultados

  1. Após os ensaios de terminado, medir a quantidade de tempo que o girino permanece sobre o lado negro do tanque.
    1. Visualizar manualmente os vídeos usando software que exibe o tempo e permite pausas frequentes. Olhe para o tempo de exibição de vídeo. Faça-se o início do ensaio de dois minutos, o qual é, quando o tanque interior aninha com sucesso dentro do tanque exterior e é elevado ao quadrado em vista da câmara.
    2. Utilizar a posição dos olhos do girino para definir qual dos lados do tanque, os animais são em natação. Definir atravessar de um lado do tanque para o outro apenas quando ambos os olhos ter atravessado a linha de preto / branco.
  2. Anote o início eo fim de cada intervalo (em segundos) que o animal passa do lado negro. Faça uma pausa e reenrole o vídeo para garantir a precisão. Total do sec dentro de cada julgamento.
  3. Entrada esses números na planilha Comportamento anexado. A planilha irá calcular a proporção de tempo que o animal passou do lado branco, subtraindo o tempo gasto com o lado negro do tanque do total de seg julgamento e dividir por 120 o tempo total em segundos [(120 - total gasto em segundos o lado negro) / 120 seg]. As médias da planilha esta relação sobre todas as 10 tentativas.
  4. Use T-teste de um aluno, emparelhado, distribuição bicaudal para determinar se as provas entre os dias são significativas (P ≤ 0,05).

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Resultados

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Relatórios anteriores demonstraram que os girinos de Xenopus premetamorphic preferir nadar no lado branco de um tanque de preto / branco e chamou este ensaio, o Fundo Preferência de cor Ensaio 3 Mudamos este ensaio, a fim de testar a função visual de ambos os olhos de girinos em menos do que uma semana. Desta forma, os olhos podem ser recolhidos para exame histológico.

Mostramos aqui como a resposta é devido a pistas visuais. No Movie 1, os girinos nos pa...

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Discussão

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Relatamos aqui um ensaio comportamental guiada pela visão simples que pode ser facilmente realizado em menos de uma semana pelo pessoal de laboratório minimamente treinados. Enquanto outros ensaios requerem equipamento especializado e experiência em comportamento animal, este ensaio permite um teste rápido para determinar a função visual. Outro ensaio comportamental, o ensaio de evitação visual, foi desenvolvida para determinar a forma como o tectum contribui para a percepção visual em Xenopus 10. Es...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde: EY015748, EY017964 (MEZ) e EY019517 (ASV). Este trabalho também foi apoiado pela Research para prevenir a cegueira irrestrito Grant ao Departamento de Oftalmologia e os Leões da Central de Nova York. Gostaríamos também de agradecer ao nosso técnico de animal, Matthew Mellini, pelo excelente cuidado dos animais e para intervindo para estrelar este vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tanque Flexível de 1/2 Galão com TampaeNascoSB19271MTamanho: 5-3/8" x 7" x 3-3/4"
Fita
Papel
Grande plataforma inoculanteVWR50809-022Tamanho: Diâmetro 114.3 x  H 76.2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb underpadVWR82004-836Tamanho: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24")
KimwipeKrackeler Scientific, Inc.1945-34155-CS
TripéVárias
câmeras iSight ou webcamAppleM8817LL/ABom para girinos maiores, mas os pequenos são difíceis de ver
Computador portátilApple/PCVáriosUsamos um MacBook de 13", Intel Core 2 Duo de 2 GHz rodando MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV filmadora handycamSONYDCR-HC42Conectado por firewire ao computador com um FireWire 400 de 6 e 4 condutores alfa
Estação HandycamSONYDCRA-C121Isso pode ser usado para conectar firewire à câmera
QuickTime Player softwareQuicktimeVersão 10.1
26 G Agulha (5/8" de comprimento)VWRBD305115
Dumont #5 Fórceps
Descartáveis
Sulfato de gentamicina [50 mg/ml]Fisher Scientific17-528ZArmazenado em RT
Sylgard 184 elastômero de siliconeFisher ScientificNC9644388
Instant oceanDoctors Foster e SmithCD-116528Solução estoque = 100 g/L armazenado em RT
Fosfato de sódio dibásicoSigma AldrichS0876Solução estoque = 0,4 M armazenado em RT
In vitro embriões fertilizadoseNascoLM00490MX100 embriões/unidade
isolante pretade seda branco padrão Ferramentas de Ciência Fina 11295-10

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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