Marcador de superfície celular Purificação Mediada de iPS Intermediários celulares a partir de um modelo Reprogramável mouse

Summary

O fibroblasto embrionário de camundongo pode ser reprogramado em células-tronco pluripotentes induzidas com baixa eficiência pela expressão forçada dos fatores de transcrição Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Os raros intermediários da reação de reprogramação são FACS isolados por meio de marcação com anticorpos contra os fabricantes de superfície celular Thy-1.2, Ssea-1 e Epcam.

Abstract

As células maduras podem ser reprogramadas para um estado pluripotente. Essas chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) são capazes de dar origem a todos os tipos de células do corpo e, consequentemente, têm um vasto potencial para aplicações em medicina regenerativa. Tradicionalmente, as células iPS são geradas pela introdução viral dos fatores de transcrição Oct-4, Klf-4, Sox-2 e c-Myc (OKSM) em fibroblastos. No entanto, a reprogramação é um processo ineficiente, com apenas 0,1-1% das células revertendo para um estado pluripotente, dificultando o estudo do mecanismo de reprogramação. Uma metodologia comprovada que permitiu o estudo do processo de reprogramação é separar os intermediários raros da reação da população em massa refratária. No caso de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs), nós e outros mostramos anteriormente que as células reprogramadas sofrem uma série distinta de mudanças no perfil de expressão de marcadores de superfície celular que podem ser usados para a separação dessas células. Durante os estágios iniciais da expressão de OKSM, as células de reprogramação bem-sucedidas perdem o marcador de identidade de fibroblastos Thy-1.2 e regulam positivamente o marcador associado à pluripotência Ssea-1. A transição final de um subconjunto de células positivas para Ssea-1 em direção ao estado pluripotente é marcada pela expressão de Epcam durante os estágios finais da reprogramação. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada da metodologia usada para isolar intermediários de reprogramação de culturas de MEFs de reprogramação. A fim de aumentar a reprodutibilidade experimental, usamos uma cepa de camundongo reprogramável que foi projetada para expressar um transativador transcricional (m2rtTA) sob controle do locus Rosa26 e OKSM sob controle de um promotor responsivo à doxiciclina. As células isoladas desses camundongos são isogênicas e expressam OKSM homogeneamente após a adição de doxiciclina. Descrevemos em detalhes o estabelecimento dos camundongos reprogramáveis, a derivação de MEFs e o subsequente isolamento de intermediários durante a reprogramação em células iPS por meio de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Introduction

Estaminais embrionárias (ES), as células são derivadas da massa celular interna de embriões em fase de blastocisto ^1. Sob condições de cultivo adequadas que se auto-renovar e permanecer pluripotentes. Em 2006, Yamanaka e seus colegas demonstraram que as células maduras podem ser reprogramadas para chamada tronco pluripotentes induzidas (iPS) células por expressão forçada de fatores de transcrição Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) ^2. CEPi, tal como as células ES, pode dar origem a todos os tipos de células do corpo, no entanto, eles são livres das restrições éticas que cercam a geração de células ES ^3. Além disso, as células iPS realizar a promessa da medicina regenerativa personalizado e mantenha um enorme potencial para aplicações como modelagem de doenças e drogas vitro triagem ^4,5. Para reprogramar a tecnologia para cumprir esse potencial, o mecanismo básico de reprogramação nuclear precisa ser totalmente compreendido. No entanto, os esforços para dissecar o pat reprogramaçãoHWAY têm sido dificultados pelo fato de que apenas um número muito pequeno de células reprogramar (0,1-1%). Fibroblastos reprogramação êxito Tem sido relatado que passam por uma série de acontecimentos distintos incluindo um mesenquimais a transição epitelial e ^6-10, nas fases finais de reprogramação, a activação da rede de pluripotência núcleo endógeno ^11-14. Nós e outros ^12,13,15-17 recentemente identificado um conjunto de marcadores de superfície celular que permite a separação de produtos intermédios raras a partir da população de massa refractária. Reprogramação fibroblastos embrionários (MEFs) sofrem alterações na expressão de Thy-1.2, Ssea1 e EpCAM (entre outros), durante o processo de reprogramação duas semanas de duração ^15. Logo no início reprogramar um subconjunto de MEFs para baixo-regular a expressão do marcador de identidade fibroblastos (Thy-1.2) e, em seguida, começar a expressar o marcador associado à pluripotência sseA-1 ^12. Durante os estágios finais de reprogramação de células Ssea1 positivos Reactivcomeu genes de pluripotência endógenos, como Oct-4 ^10-13,15. Esta última transição é marcada sobre a superfície da célula através de expressão detectável de EpCAM (ver Figura 1) ou numa fase posterior PECAM ^15. Recentemente, O'Malley et ai. Relatado o uso de CD44 e ICAM1 como alternativas ou complementares para Thy-1.2 e SSEA-1 para a identificação de compostos intermédios de reprogramação. Nós já FACS extraído intermediários reprogramação do dia 0, Dia 3, Dia 6, culturas dia 9 e dia 12 de reprogramação, bem como a partir de linhagens de células iPS estabelecidas com base nesses marcadores de superfície celular ^15,18. Para o sistema de reprogramação abaixo descrito e as condições que demonstraram ao nível de uma única célula que, embora as populações são silenciosos homogénea, existe um determinado grau de heterogeneidade das populações intermediários identificados. Deve notar-se que apenas um subconjunto de células dentro dessas populações são capazes de passar para o respectivo lado stage do processo de reprogramação e dão origem a colônias de células iPS em diferentes eficiências, que têm sido amplamente caracterizadas previamente ^15,19. Além disso, a eficiência de reprogramação dessas populações depende, bem como sobre as condições de re-revestimento e cultura. Para aumentar a reprodutibilidade experimental usamos uma estirpe de ratinho reprogramável que foi manipulada para expressar um transactivador transcricional (m2rtTA) sob o controlo do locus Rosa26 e uma cassete policistrónica OKSM sob o controlo de um promotor responsivo a doxiciclina ^20,21. Usando esse modelo de mouse contorna os efeitos colaterais indesejados dos métodos tradicionais de produção de virais células iPS, ou seja, uma população heterogênea de partida com célula a célula variabilidade no número e localização dos locais de integração de inserções virais. Duas linhagens de camundongos transgênicos (OKSM, m2rtTA), disponíveis como animais fundadores homozigotos no Laboratório Jackson, tem que ser cruzado, a fim de estabelecer a reprogramodelo de ratinho mmable (ver Figura 2). Nesse artigo, procuramos descrever em detalhes como derivar MEFs, gerar células iPS, e isolar os intermediários de reprogramação em vários estágios do processo de conversão por FACS.

Protocol

1 Instrumento Settings / Preparação do reagente / Genotipagem

1. Preparar meio de células iPS: Suplemento 500 ml Knockout meio DMEM com soro fetal bovino 75 ml (FBS), 5 ml de L-glutamina, 5 ml de aminoácidos não-essenciais, 500 ul β-mercaptoetanol 5 x 10 ⁵ unidades de factor inibidor da leucemia ( LIF). Consulte a Lista de Materiais para o produto e informações de compra de reagentes utilizados no contexto deste manuscrito.
2. Preparar meio MEF: Suplemento 500 ml meio DMEM com FBS a 50 ml, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de aminoácidos não-essenciais, 5 mL de piruvato de sódio, 500 uL β-mercaptoetanol.
3. Preparar meio de congelamento: Para 10 mL, combinar 9 ml de FBS com 1 ml de DMSO.
4. Gelatina Prepara pratos revestidos Adicionar solução de gelatina porcina 3-5 mL de 0,1% para um frasco T75 e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min e aspirado imediatamente antes do uso.
5. Prepare FACS meio rotulagem: Para 10 mL, 9,9 mL combinar de PBS com 0,1 ml de FBS.
6. Realizeuma genotipagem de PCR para o locus Rosa26 m2rtTA: Realizar as reacções com polimerase do ADN de Taq de acordo com as instruções do fabricante. Use uma modificação _MgCl2 -concentration de 3,5 mm e os três seguintes primers: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TAT TGT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA ATG GAA GAT ATG 3 '. Condições de ciclo: 94 ° C durante 3 min; 35 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 65 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min); 72 ° C durante 2 min; manter a 12 ° C. O tamanho esperado do produto: 650 pb para o alelo de tipo selvagem e 340 pb para o alelo mutante.
7. Realize uma genotipagem PCR para o locus Collagen-StemCa / OKSM: Realizar reações com Taq DNA polimerase, conforme as instruções. Use uma modificação _MgCl2 -concentration de 2,5 mM e os três iniciadores seguintes: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Condições de ciclo: 95 ° C durante 1 minuto: 2 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 70 ° C durante 45 s), 6 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 68 ° C durante 45 seg) e 30 ciclos de (94 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 1 min); 72 ° C durante 5 min; manter a 12 ° C. O tamanho esperado do produto: 331 pb para o alelo tipo selvagem e 551 pb para o alelo mutante.
8. Realizar todos os passos de centrifugação a 400 xg durante 3 minutos a 4 ° C.

2 Geração de rato embrionárias fibroblastos

1. Realize um acasalamento cronometrado entre um animal da estirpe OKSM com um membro do sexo oposto da estirpe m2rtTA. Embriões colheita no dia embrionário 13,5 por abate a mãe e remover o corno uterino. Antes da remoção da trompa uterina, pulverizar a região abdominal com uma solução de etanol a 80%, para evitar a contaminação microbiana.
2. Transferir a trompa uterina num prato de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de Solução Salina Tamponada com Fosfato estéril (PBS). Use tesouras cirúrgicas esterilizadas de grau para cortar o corno uterino em pedaços contendo um embrião (ver Figura 3A, B).
3. Use um microscópio de dissecção (idealmente situado dentro de uma cultura capa de tecido) e uma pinça esterilizada para remover cuidadosamente o envelope uterino e as membranas extra-embrionárias que cercam cada embrião. Transferir cada embrião para uma placa de 10 cm separado com 10 ml de PBS.
4. Continuar removendo a cabeça do embrião, membros, cauda e dos órgãos internos (coração, fígado, intestino, etc), com as pinças (ver Figura 3C). Transferir a cabeça do embrião dentro de um tubo de 1,5 mL e congelar para baixo de modo que pode ser utilizado para genotipagem, se necessário.
5. Transferir o tronco do embrião em um 10 centímetros prato vazio e usar duas lâminas cirúrgicas para picar o embrião por 2 min. Adicionar 200 ul de solução de tripsina / EDTA por cima do embrião picada e incubar durante 3-5 minutos à temperatura ambiente. Continue picados por um 2 min, adicione 2 ml de meio do MEF no ativar tripsina, e depois transferir para um tubo de 15 ml.
6. Usar uma pipeta de 1000 ul de dissociar mais mecanicamente o tecido por pipetagem suave. Transferir para um gelatina revestida prato de 10 cm e adicionar um adicional de 10 ml de meio de MEF. Nota: Ambas as incubadoras normóxicas e de hipóxia pode ser usado para a cultura, referem-se a discussão para mais informações.
7. Após 24-48 h, a placa deve ser densamente coberto com MEFs.
8. Alternativamente, as células podem ser depois propagadas e congelado para baixo. Para o congelamento de células, remova o meio de cultura, lavar o prato com 10 ml de PBS para remover traços de mídia e sobreposição com 3 ml de tripsina / solução de EDTA. Incuba-se durante 3-5 minutos a 37 ° C, a digestão inactivar a tripsina por adição de 5 ml de meio de MEF e transferência para um tubo de centrifugação de 15 ml. Gire para baixo e colocar o agregado em 3 ml de mídia de congelamento. Transferir para 3 criotubos e congelar para baixo em um recipiente de congelamento de células.

3. Reprogramação de MEFs

ove_content "> NOTA: as células por centrifugação a 200 xg por 5 min a 4 ° C e usar normóxicas incubadoras de cultura de tecidos para a reprogramação Ela pode ser benéfica para derivar e expandir MEFs sob condições de hipóxia (5% de oxigênio, veja a discussão para mais informações. ).

1. Descongelar rapidamente um frasco de congelação baixa passagem (P0-P1, 2-3 células Mio) em um banho de água (37 ° C) e o seu conteúdo para um tubo com 10 ml de meio de MEF pré-aquecidas. Células de pellets, ressuspender em media MEF 12 ml fresco, transferir para uma gelatina revestido recipiente de cultura T75, e permitir que as células se recuperar para 24-48 horas antes de prosseguir. Nota: MEFs também pode ser utilizado directamente após a derivação.
2. Após a remoção do meio de cultura, lavar com PBS e MEFs cellularize por sobreposição com uma solução de tripsina / EDTA (3 ml para 3-5 min a 37 ° C). Saciar a tripsina, adicionando 5 ml de meio MEF e dissociar ainda mais células por agitação suave com uma pipeta de 10 ml. Determinar o número de células utilizando um hemocitómetro.
3. Para reprograexperimentos mming, MEFs semente em frascos T75 revestidos com gelatina a densidades de 6,7 x 10 células / ³ cm ² (~ 0,5 milhões de células por frasco) em meios de IPSC contendo 2 ug / ml de doxiciclina. Consulte a Tabela 1 em relação a recomendações de semeadura para se obter cerca de 2 intermediários reprogramação milhões para cada ponto de tempo. Nota: A reprogramação começa com a adição de doxiciclina (2 mg / mL), suplementado mídia
4. Para os primeiros 6 dias substituir mídia todos os dias com doxiciclina fresco suplementado mídia iPSC (12 ml por frasco de mídia T75). Além deste ponto renovar mídia diariamente se há o número de células de altura. Dobrar o volume de cultura se alterações na mídia só pode ser realizada em dias alternados.
5. Intermediários Colheita de reprogramação nos momentos necessários (sugestão: dias 3, 6, 9, 12), removendo a mídia, a lavagem com volume adequado de PBS (10 ml para um frasco T75) e sobreposição com solução de tripsina-EDTA (3 ml para um frasco T75). Incubardurante 3-5 min a 37 ° C e extingue-se por adição de 5 ml de meio iPSC seguido por pipetagem suave.
6. Contagem de suspensão de células com um hemocitómetro (ver acima), por centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de PBS para remover quaisquer vestígios de tripsina. Agregar as células mais uma vez, aspirar o sobrenadante e prossiga com o passo 4.1 para isolar os intermediários de reprogramação. Nota: As células submetidas a reprogramação pode ser criopreservadas e descongeladas para FACS isolamento em um estágio posterior.
7. Para estabelecer totalmente reprogramadas iPS culturas, cultivo de células em free-dox mídia iPSC por mais 4-7 dias. Nota: As culturas de reprogramação com sucesso irão conter um grande número de colónias por dia 12 (ver Figura 4). Durante este tempo, as células iPS aberrantes que ainda carecem de expressão OKSM desaparecerá.
8. Alternativamente, para propagar as restantes culturas completamente reprogramadas iPS: inicialmente, as sementes MEFs irradiados a uma densidade de 15 x 10 ³ células / cm ² em 12 ml de meio iPSC Onto uma gelatina revestida T75 balão de um dia ou de 6 horas antes das experiências.
9. Em seguida, as culturas de células iPS cellularize por meios de remoção, lavando o frasco T75 com 10 ml de PBS, sobrepondo com 3 ml de solução de tripsina-EDTA e incubando durante 3-5 min a 37 ° C. Saciar tripsina pela adição de 5 ml de mídia IPSC seguido de mistura suave, transferir para um tubo de 15 ml, girar para baixo e, em seguida, novamente suspensas em 10 ml de mídia iPS.
10. Transferir 500 ul desta suspensão de células sobre os MEFs irradiados (frasco T75) e permitir que as culturas a crescer durante 4-5 dias. Nota: iPS estabelecidas as culturas podem ser criopreservados ou utilizados para experimentos. Linhagens de células clonais podem ser obtidas escolhendo colônias IPSC individuais sob um microscópio de dissecação ^22.
11. Cryo preservar culturas IPSC confluentes, conforme descrito no 2.8 para MEFs.

4 Rotulagem de anticorpos

1. Pellets de células Ressuspender de culturas de reprogramação, elaborados na Seção 3, emFACS suplementado com meio de marcação de anticorpos (anti-Thy 1.2-pacífico azuis 1: 400, anti-biotina SSEA-1 1: 400 e anti-EpCAM Fitc 1: 400). Utilizar 200 ul de mistura de marcação suplementado por 5 milhões de células e incuba-se em gelo.
2. Após 10 min de toque suave do tubo para ressuspender as células e incuba-se durante mais 10 min em gelo. Adicionar 10 ml de PBS frio por tubo e girar para baixo.
3. Para cada um dos tubos a serem coradas preparar 200 mL de meio de marcação suplementados com 1 ul de estreptavidina-PeCy7 (1: 200) por 5 milhões de células. Quando as células foram sedimentadas, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em um volume apropriado de meio de marcação suplementados com Estreptavidina-PeCy7.
4. Manter as células em gelo por 10 min, toque para voltar a suspender, incubar por mais 10 minutos no gelo, adicione 10 ml de PBS frio por tubo, girar e aspirar o sobrenadante.
5. Os sedimentos de células em meio de marcação Ressuspender suplementado com iodeto de propídio (PI) (2 ug / ml) a cerca de 1 x 10 ⁷ células / ml. Remover aglomerados de células fazendo passar a suspensão através de um filtro de 70 ^ m. Transferir as células para um tubo de FACS apropriado e mantê-los em gelo.
6. Preparar amostras separadas com anticorpos individuais (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 e anti-EpCAM). NOTA: Estes são necessários para executar a compensação de cor nos três canais utilizados na análise. Além disso, as células não marcadas são necessários para definir as tensões e portões para a classificação. Idealmente as células iPS são utilizados para compensação: as existências de 0,5-1 x 10 ⁶ células iPS mantidos em MEFs irradiados são armazenados em criotubos em nitrogênio líquido. A presença de MEFs é essencial para obter um sinal no canal de Thy-1.2.
7. Descongele a cryovial de células iPS como descrito para MEFs (Seção 3). Após a centrifugação, Ressuspender as células em 800 mL de tampão de rotulagem e 200 mL desta amostra é deixada de lado como o controle sem rótulo.
8. Use as células restantes como controles de compensação. As células se dividem entre três tubos de 15 mL e anticorpos adicionarda seguinte forma: Pacific Blue Control compensação: adicionar 0,5 mL do anticorpo anti-Thy-1.2 Pacific Blue. Tubo de compensação Fitc: adicionar 0,5 mL de anticorpo anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 controlo de compensação: 0,5 ul do anticorpo anti SSEA-1-Biotina.
9. Manter as amostras de células-anticorpo no gelo por 10 min, misture tocando e incubar por 10 min no gelo.
10. Lavar as amostras com 10 ml PBS fria para remover o anticorpo não ligado, girar células para baixo e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em pelotas a 200 ul de meio de marcação de FACS.
11. Para os anti-sseA-1-biotina amostras marcadas, adicione um conjugado estreptavidina-PeCy7 (1 ml por 200 células ul). Etiqueta de células como descrito para o anticorpo primário (SSEA-1-Biotina).
12. Passar todas as amostras, incluindo o controlo não marcado através de um filtro de 70 ^ m e adicionar PI (2 ug / ml). Transfira as células para tubos de FACS e manter em gelo até serem necessárias.

5. FACS isolamento de intermediários

Nota:As células são classificadas usando um classificador de células activadas por fluorescência com 405 nm, 488 nm e 560 nm de excitação laser e um bocal de 100 um.

1. Configure tensões para dispersão frontal e lateral, para que a população de células é correctamente visualizado. Desenhar uma porta em torno das células, tal como indicado na Figura 5A a excluir detritos. Nota: A configuração correcta das tensões sobre a separação de células pode ser complexo e requer um operador experiente FACS.
2. Use dispersão frontal (FSC) de altura em relação área FSC para excluir agregados (Figura 5B).
3. Visualize o canal PI contra FSC para portão nas células vivas negativos PI (Figura 5C).
4. Utilize as células não marcadas para ajustar as voltagens para os canais fluorescentes de PB, Fitc / GFP, Pe-Cy7. Idealmente posicionar a população de células na extremidade inferior do respectivo canal.
5. Definir portas com as células de controlo não marcados como se mostra na Figura 6A, B a fracção sub culto reprogramaçãoUres para o dia 3, 6 e 9 populações: células + sseA-1 / Thy-1.2; SseA-1 / Thy-1.2-células; ea reprogramação intermedeia sseA-1 + / Thy-1.2-células.
6. Além disso subdividir o dia 9 sseA-1 + / Thy-1.2- fração usando o Pe-Cy7 contra Fitc blot; desenhar portas em todo o SSE-a1 + / + EPCAM células e os sseA-1 + / células Epcam-. Definir portas com as células de controlo não marcados como se mostra na Figura 6C, D.
7. Prefill tubos de coleta adequados com media de células iPS (1-2 ml) antes de classificar as subpopulações desejadas (veja a Figura 7 para perfis FACS representativos para MEFs, Dia 3 / Dia 6 / Dia 9 / Dia 12 culturas e células iPS).
8. Efectuar a triagem FACS de acordo com o protocolo de fabrica.
9. Após isolamento FACS submeter células a um perfil molecular (ARN / extracção de proteínas, a imunoprecipitação da cromatina, o DNA methylome análise etc). Alternativamente, as diferentes fracções de células podem ser cultivadas.

Results

Após o esvaziamento, a desagregação e plaqueamento de um embrião E13.5 rato, uma placa de 10 cm é esperado para a confluência em aproximadamente 1 a 2 dias. Nesta fase, é normal que a cultura de conter algumas peças aderentes de tecido que não foram celularizados corretamente. Estes irão desaparecer após passaging.

Após a indução de doxiciclina, MEFs reprogramação sofrem mudanças morfológicas distintas. Por volta do dia 6, os remendos da colônia-like primeiros devem começar a surgir (Figura 4C). Estes irão continuar a crescer em tamanho com a continuação da cultura (ver Figura 4D, E). Uma boa experiência de reprogramação deve resultar em> 500 colônias por T75, que inicialmente foi semeado com 5 x 10 ⁵ células (Figura 4E). Culturas iPS estabelecidas possuem características cúpula colônias em forma e deve ser maioritariamente desprovido de células diferenciadas (Figura 4F). Ocasionalmente, passaging adicional de iPS cultures pode ser necessária para remover as células indiferenciadas / parcialmente reprogramadas; um frasco confluente de células pode ser dividida numa proporção de 01:10 para uma camada alimentadora de MEFs irradiados.

Como mencionado acima, as alterações morfológicas e moleculares durante a reprogramação são refletidas por mudanças nos perfis FACS para Thy-1.2, sseA-1 e, finalmente, EPCAM (veja a Figura 7A-F). Como relatado anteriormente ^12,15, enquanto MEFs são predominantemente positivos para Thy-1.2 e negativo para os outros marcadores, dia 3 culturas já parece muito diferente. Uma grande proporção de células começaram a infra-regular a expressão de Thy-1.2 e um pequeno subconjunto destes Thy-1.2 células tornaram-se negativos positivo para SSEA-1, o intermediário reprogramação real para este ponto de tempo. O número de intermediários de reprogramação que pode ser extraído a partir do dia 3 culturas é muito imprevisível como a percentagem de SSEA-1 + / Thy-1.2-encontra-se geralmente num intervalo entre 1-10% de concretizacélulas e. Nos dias 6 e 9 uma maior percentagem de células SSEA-1 +, geralmente bem acima de 10%, pode ser detectada. Por volta do dia 12 de um subconjunto de SSEA-1 células positivas pode ser detectado que também rotular positivo para EpCAM. Dia 12 culturas, como culturas do Dia 3, representa um ponto de estrangulamento para a purificação dos intermediários, como a percentagem de células SSEA-1.2 + / + EpCAM é variável e geralmente está na gama de apenas 2-4% de todas as células vivas. O número esperado de reprogramação intermediários apresentados na Tabela 1 somente serve como uma aproximação grosseira. Culturas de células estabelecidas de boa fé iPS será fortemente positivo para sseA-1 e EPCAM.

Figura 1 superfície marcador muda durante o caminho reprogramação: Down-regulação do marcador identidade fibroblastos Thy-1.2 é seguido por aumento da regulação doSseA-1. A transição de um subconjunto de sseA-1 células positivas para um estado pluripotente é indicado pela aquisição de EPCAM por volta do dia 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 representação esquemática do modelo de rato reprogramável:. M2rtTA expressão está sob o controlo do locus Rosa26 ubiquamente activo na presença de doxiciclina (DOX) a proteína se liga a um m2rtTA tetraciclina promotor dependente (tetOP) ao colagénio 1a1 (COL1A1) lócus resultando na expressão da cassete de quatro factores. Duas cassetes bicistrônico estão ligados por uma entrada site ribossoma (IRES). Quadros de leitura abertos para Oct-4 / Klf-4 e Sox-2 / c-Myc são fu sed por seqüências F2A e E2A de auto-clivagem, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Embrião dissecção: trompa uterina (A) para uma placa de transferência de 10 centímetros cheio com 10 ml de PBS e (B), cortadas em pedaços contendo um embrião. (C) Utilizando uma pinça libertar os embriões de tecido embrionário extra e remover cabeça, membros, cauda e órgãos internos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Manchas Figura 4 Alterações morfológicas durante a reprogramação. Colônias de como tornar-se evidente nas culturas a partir do dia 6 em diante. IPSCs Bona fide são caracterizados por uma morfologia em forma de cúpula. (A) Dia 0 / MEFs, (B) Dia 3, (C) Dia 6, (D) Dia 9, (E) Dia 12, (F) iPS cultura celular. Barra de escala:. 200 um por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 configuração FACS Basic. (A) Excluir detritos com Side Scatter contra Forward Scatter Área blot. (B)Excluir agregados de não-detritos pela passagem sobre a população de uma única célula com Forward Scatter Área contra Forward Scatter alta blot. (C) Excluir células mortas da população de uma única célula por gating no PI baixos eventos com PI canal contra Forward Scatter Área Blot. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 gating. (A, B) Usando as células controle sem rótulos criados portões para Thy-1.2 + / sseA-1 células, Thy-1.2- / sseA-1 células e Thy-1.2- / sseA-1 + células. (C) Use as células controle não marcados para definir portas para as células positivos e negativos EPCAM EPCAM. (D) SSEA-1 + / Thy-1.2-células podem ser separadasem um EPCAM positivo e em uma população negativa EPCAM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 Thy-1.2 contra sseA-1 FACS manchas em várias fases do processo de reprogramação. (A) Dia 0 / MEFs, (B) Dia 3, (C) Dia 6, (D) Dia 9, (E) Day 12, de cultura de células (F) iPS.

Tabela 1 sugestão de densidade de semeadura, número frasco eo resultado esperado para P1 MEFs de um heterozigoto embrião para OKSM e m2rtTA. Clique here para ver uma versão maior desta figura.

Dia	Número de frascos T75 semeadas no dia 0	Número total de células Ssea1 + após FACS	Número total de Ssea1 + / + EpCAM células após FACS
3	8	2000000
6	4	2000000
9	4	2000000
12	10	10 milhões	2000000

Discussion

A fim de reprogramar com êxito MEFs em células iPS e purificar intermediários reprogramação em grande quantidade, é essencial estar ciente dos fatores que têm um impacto sobre a eficiência global. Em particular, o lote de FBS utilizada para suplementar meios iPS pode ter um efeito prejudicial. Em experiências positivas gerais foram feitas com tronco embrionárias FBS qualificados (ES) celulares, mas ensaios de lotes de soros a partir de uma variedade de fornecedores pode identificar uma alternativa mais barata.

Outro fator que impacta na eficiência reprogramação é o genótipo de MEFs ^15,20. Embora MEFs derivadas de ratinhos heterozigóticos (het), tanto para o OKSM e o locus que m2rtTA reprogramar, homozygousity em um ou em ambos os loci resultados em maiores eficiências de reprogramação. Na verdade, MEFs derivados da descendência de OKSM e m2rtTA cruzes mostram um aumento na eficiência de reprogramação na seguinte ordem (OKSM / m2rtTA): het / het Tabela 1 são para animais het / HET). Nas raras ocasiões em um macho animais homo / homo é identificado, um harém acasalar com várias fêmeas m2rtTA pode ser configurado. Todos os descendentes de cruzamentos estes serão het / homo para o OKSM / m2rtTA loci, respectivamente. Além disso, a rápida genotipagem de ninhadas é recomendado como ninhadas maiores são obtidos quando se utiliza ratos mais jovens para reprodução (6-15 semanas de idade).

Além disso, o uso de baixas MEFs passagem para a reprogramação é enfatizado ^23. Se MEFs foram derivados e ampliado em um normóxica incubadora de cultura de tecidos é altamente recomendável usar apenas essas células até passagem 2. No entanto, se o pesquisador tem acesso a uma incubadora de baixo oxigênio (5% de oxigênio) para a derivação e expansão de MEFs, números tão elevados como 3 ainda vai render bons resultados ²³ de Passagem.

No caso de o experimentador encontra problemas associados com a reprogramação, , conforme descrito, as explicações mais prováveis ​​são números elevados de passagem, no momento da adição de dox, genótipo incorrecta dos ratinhos ou a utilização de FBS que não é favorável para a geração de células iPS. No entanto, em casos raros, observou-se que MEFs não foram capazes de reprogramar mesmo em condições ideais. Nestes casos, uma supressão espontânea de novo dentro do quadro de leitura aberto do m2rtTA foi identificado como o motivo subjacente.

Esta metodologia foi adaptada com sucesso para extrair sseA-1 + intermediários através de isolamento de células magnética (MACS). Há uma clara vantagem em tempo utilizando MACS, no entanto, a pureza dos SSEA-1 + populações de células "é reduzido a 80-90%, em vez de mais do que 95%, o que, dependendo do tipo de experiência, as células são destinados a pode representar um problema. Deste modo, uma opção é usar MACS para enriquecer para SSEA-1 + células seguido de FACS para aumentar a pureza e / ou fracção de + /-las em células Epcam- SSEA-1 + / + de EpCAM e SSEA-1.

"> Enquanto as células iPS produzidos pelo protocolo descrito e modelo de rato ter demonstrado ser eficaz pluripotentes e contribuir para todos os tecidos dos animais quiméricos ^15,20, uma capacidade reduzida para produzir embriões inteiramente compostas por estas células iPS via complementação foi tetraplóide demonstrada ^24. padrões de metilação aberrante do gene cluster Dlk-DIO3 foram identificados como a causa subjacente ^24. Contudo, a adição de ácido ascórbico a uma concentração de 50 ug / ml para os meios de comunicação durante a reprogramação de complementação produzirá tetraplóide iPS células competentes ^24. Informamos que um modelo alternativo do mouse reprogramável projetado para expressar os fatores de reprogramação em uma estequiometria diferente pode produzir células iPS competentes tetraplóides, mesmo na ausência de tratamento com ácido ascórbico ^25. No entanto, em nossas células mãos deste reprogramar tensão na freqüência consideravelmente menor em comparação para o modo de rato aqui usadol.

A metodologia descrita neste manuscrito permite a separação de produtos intermédios de reprogramação a partir do volume da população refractário e deve ser visto como uma ferramenta valiosa para dissecar e compreender o processo de reprogramação, removendo as limitações anteriores de ter de utilizar uma população não fraccionada por perfis (por exemplo, alto ruído do sinal das células refratários). A combinação de anticorpo aqui descrito permite o isolamento de produtos intermédios a partir de células de ratinho em elevado grau de pureza, no entanto, é possível que os marcadores da superfície da célula adicionais serão descobertos no futuro, que irá permitir a obtenção de produtos intermédios em ainda maior pureza. Por favor, note que sseA-1 expressão não é uma característica de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem e, como tal, este protocolo não pode ser usado em reprogramação de células de origem humana. Em conclusão, uma vez isolados os intermediários de reprogramação com o método descrito pode ser usado para análises moleculares, incluindo a expressão profilinag, cromatina imunoprecipitação, methylome análise e ensaios de proteína.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue	eBiociência	48-0902-82
Biotina Anti-Humana/Mouse SSEA-1	eBiociência	13-8813
Estreptavidina PE-Cy 7	eBiociência	25-4317-82
Anti-Mouse CD326(Epcam) Fitc	eBiociência	48-5791-82
Piruvato de sódio	Tecnologias de Vida	11360-070
Aminoácidos não essenciais MEM (NEAA)	Tecnologias de Vida	11140-050
Soro Fetal Bovino Qualificado para Células-Tronco Embrionárias (FBS)	Tecnologias de Vida
Tripsina-EDTA (0,25%)	Tecnologias de Vida	25200-056
GlutaMAX	Life Technologies	35050-070
β-mercaptoetanol	Tecnologias de Vida	21985-023
DMSO (Dimetil Sulfóxido)	Sigma-Aldrich	D8418
Penicilina/estreptomicina	Tecnologias de Vida	15140
Solução de iodeto de propídio (PI)	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Gelatina de pele suína	Sigma-Aldrich	G1890
Hidrato de doxiciclina	Sigma-Aldrich	33429-100MG-R
Fator Inibidor de Leucemia (LIF)	Millipore	ESG1107
DMEM Alta Glicose	Tecnologias de Vida	11960-044
DPBS (solução salina de tampão fosfato de Dulbecco)	Tecnologias de Vida	14190-144
KnockOut DMEM	Tecnologias de Vida	10829-018
MEFs irradiados	Tecnologias de Vida	S1520-100
75-cm2 Frascos de cultura de tecidos	Corning/BD Bioscience
tubos de centrífuga de 15 ml	Corning/BD Bioscience
tubos de centrífuga de 50 ml	Corning/BD Bioscience
Lâminas cirúrgicas descartáveis	Clifford Hallam	SM0501
Frascos criogênicos	Corning/BD Bioscience
70 µ m Filtro de células	BD Biociência	352340
Taq DNA Polimerase	Tecnologias de Vida	10342-020