Artigo de método

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

DOI:

10.3791/51737

⸱

15 de setembro de 2014

 ,  , 
1Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Resumo

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Os neurônios dopaminérgicos (DA) na substância negra pars compacta (também conhecidos como neurônios A9 DA) são o tipo específico de célula que é perdido na doença de Parkinson (DP). Há um grande interesse em derivar neurônios A9 DA de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para terapia de reposição celular regenerativa para DP. Durante o desenvolvimento neural, os neurônios A9 DA se originam dos precursores da placa de assoalho (FP) localizados na linha média ventral do sistema nervoso central. Aqui, otimizamos as condições de cultura para a diferenciação gradual de hPSCs em neurônios A9 DA, que imita o desenvolvimento embrionário do neurônio DA. Em nosso protocolo, primeiro descrevemos a geração eficiente de células precursoras de FP a partir de hPSCs usando um método de molécula pequena e, em seguida, convertemos as células FP em neurônios A9 DA, que podem ser mantidos in vitro por vários meses. Este protocolo eficiente, repetível e controlável funciona bem em células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) de pessoas normais e pacientes com DP, nas quais se pode derivar neurônios A9 DA para realizar modelagem de doenças in vitro e triagem de drogas e terapia de transplante de células in vivo para DP.

Introdução

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Dopaminérgico (DA) neurônios pode ser encontrada em várias regiões do cérebro, incluindo o mesencéfalo, hipotálamo, retina, e bulbos olfatórios. Os neurônios A9 DA na substância negra pars compacta (SNPC) comportamento de controle e movimento, projetando para o estriado na parte frontal do cérebro e formando o sistema motor extrapiramidal. A degeneração de neurónios DA A9 leva à doença de Parkinson (PD), que é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e humano actualmente incurável. A terapia de substituição de células é uma das mais promissoras para o tratamento da DP 1, por conseguinte, tem havido um grande interesse na determinação neurónios A9 DA a partir de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo ambas as células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e o células humanas recentes tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs).

Muitas pesquisas têm tentado obter neurônios A9 DA de hPSCs usando vários métodos. Os primeiros relatórios de todos os neurônios DA gerados através de uma neuralroseta estágio progenitor. Por co-cultura com MS5 2 ou PA6 3-5 células estromais com ou sem fatores de crescimento externo para 2-4 semanas, L. Studer e colegas e três outros grupos induzidos com sucesso hESCs para produzir rosetas neurais. Eles, então, enriquecido essas rosetas por dissecção mecânica ou digestão enzimática para uma maior diferenciação. Em outros relatos, os pesquisadores geraram rosetas neurais através do corpo embrióide (EB) flutuantes cultura diferenciação 6-9. Mais tarde, os investigadores estabeleceram um método de diferenciação de monocamada com base 10,11, onde banhado hESCs e hiPSCs na matriz extra-celular, adicionou diferentes factores de crescimento em cultura para induzir a diferenciação de hPSCs de neurónios DA, que imita o in vivo DA desenvolvimento embrionário neurónio . Apesar de todos estes estudos obtidos tirosina hidroxilase (TH) células -expressing com algumas características de neurônios DA, todo o processo de diferenciação é o tempo e trabalho consumindo,geralmente ineficiente, e mais importante ainda, a identidade A9 destes neurónios não foram demonstradas na maioria dos estudos, com excepção de um com Lmx1a expressão ectópica 12. Recentemente, uma placa de novo piso (FP) protocolo baseada foi desenvolvido 13-16, em que os precursores PF com DA potencial neurônio foram gerados primeiro pela ativação do sonic hedgehog e canônicas vias de sinalização Wnt durante a fase inicial de diferenciação, e, em seguida, essas células FP foram melhor especificados para os neurônios de DA. Apesar de este protocolo é mais eficiente, ainda existem alguns problemas; por exemplo, todo o processo de diferenciação leva muito tempo (pelo menos 35 dias) e é dependente de células alimentador 15, ou seja 16 ou EB dependente da identidade A9 não foi demonstrada 14.

Aqui, a partir do conhecimento do desenvolvimento in vivo DA neurônio embrionário e os resultados publicados por outros pesquisadores, nós otimizamos as condições de cultivo para o FEPgeração icient de neurônios DA de ambos os hESCs e hiPSCs. Nós primeiro gerado células precursoras FP pela ativação da via de sinalização Wnt canônica com pequena molécula CHIR99021 e sonic hedgehog sinalização com pequenas moléculas SAG e purmorphamine. Estas células FP expressar Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestin. Em seguida, essas células especificado PF para neurônios DA com fatores de crescimento, incluindo BDNF, GDNF, etc. Os neurônios DA gerados são do tipo de célula A9 como eles são positivos para GIRK2 enquanto negativo para calbindina 17. Este protocolo é de células de alimentação ou EB independente, altamente eficiente e reprodutível. Usando este protocolo, pode-se derivar neurônios DA em menos de 4 semanas a partir de hESCs ou hiPSCs de pessoas normais para estudo transplante de células, ou de hiPSCs de pacientes com DP para in vitro modelagem de PD ou testar agentes terapêuticos potenciais para a DP.

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Protocolo

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1 Preparação de Meios de Cultura

  1. Prepare de fibroblastos de rato embrionário (MEF) forma, combinando o seguinte: 445 ml de DMEM, 50 mL de soro bovino fetal (FBS), e solução de reserva de 5 ml de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 14 dias.
  2. Prepare HPSC meio de cultura através da combinação do seguinte contendo soro: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de soro de substituição nocaute (KSR), 5 ml de 100x não essencial solução solução de estoque de aminoácidos, 5 ml penicilina 100x / estoque ampicilina, 5 ml de 100x mercaptoetanol a solução estoque, e 10 ng / ml de bFGF. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias.
  3. Prepare a meio isento de soro mTeSR1 combinando o seguinte: 400 ml de meio basal mTeSR1, 100 ml de suplemento de 5x, e 5 ml de solução de estoque de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha meio a 4 ° C por não mais que 10 dias.
  4. Preparar a solução estoque 10x colagenase IV: pesar 0,5 g de energia colagenase IV, edissolvê-la com 50 ml de DMEM / F12 e filtro de esterilizar. Faça alíquotas e armazená-las à temperatura de -20 ° C durante meses.
  5. Preparar a solução de gelatina a 0,1%: pesam-se 0,5 g de gelatina (a partir de pele de bovino, de tipo B) de alimentação e dissolvê-lo com água desionizada. Mantenha a solução esterilizada em autoclave à temperatura ambiente durante semanas.
  6. Preparar meio de diferenciação KSR combinando o seguinte: 410 ml de DMEM, 75 mL KSR, 5 ml 100x solução não-essencial estoque de aminoácidos, 5 ml penicilina 100x / solução estoque ampicilina, 5 ml de solução de estoque 100x mercaptoetanol. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias.
    NOTA: KSR varia de lote para lote, o que pode afetar a eficiência de diferenciação. Por isso, é melhor testar vários lotes de KSR para encontrar o melhor para a diferenciação.
  7. Preparar meio de diferenciação N2 combinando o seguinte: 98 ml de DMEM, 1 ml de suplemento de N2 100x e 1 ml de solução de estoque de 100x penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4° C por não mais que 10 dias.
  8. Preparar meio de diferenciação B27, combinando o seguinte: 480 ml de meio neurobasal, 10 ml de 50x suplemento B27, 5 ml de solução de estoque de GlutaMax 100x, 100x e 5 ml de solução de reserva de penicilina / ampicilina. Mantenha o filtro meio esterilizado a 4 ° C por não mais que 10 dias.

2 Cultura de hESCs e hiPSCs em células alimentadoras MEF

Os hESCs H9 foram obtidos a partir de Instituto de Pesquisa WiCell e hiPSCs foram estabelecidas em laboratório Reijo Pera através de transdução mediada por retrovírus de Yamanaka fatores OCT3 / 4, SOX2, KLF4 e C-MYC 18.

  1. Pelo menos um dia antes da passagem de células, preparar algumas placas de gelatina adicionando 1 ml de 0,1% de gelatina a uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
  2. Após a incubação, a partir de placas de gelatina aspirado, e semente de irradiação inactivado células MEF nas placas a uma densidade de 1,6 x 10 5 células/ Poço em meio de MEF utilizando um hemocitómetro para contar as células.
    NOTA: Se necessário, preparar alimentadores MEF logo aos três dias antes da passagem da célula.
  3. Células de passagem um dia após o plaqueamento alimentadores MEF: médias aspirado de hPSCs, adicionar 1 mg / ml de colagenase IV em células em 1 ml / poço, e incuba-se as células a 37 ° C durante 1 hora.
  4. Durante esta incubação, lavam alimentadores MEF uma vez com PBS e, em seguida adicionar água morna (37 ° C) HPSC meio de cultura contendo soro a 1,5 mL / poço.
  5. Depois de 1 hora, toque na placa de cultura de um par de vezes para que a maioria das colônias indiferenciadas vai separar as placas, enquanto as colônias diferenciadas permanecem ligados. Cuidadosamente recolher as colônias flutuantes, e transferi-los para tubo de 15 ml.
  6. Lavar suavemente a placa uma vez com água morna (37 ° C) de DMEM / F12 e transferir DMEM / F12 no mesmo tubo de 15 ml.
  7. Centrifugar os tubos a 179 xg por 3 min.
  8. Aspirar médio dos tubos, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Adicionar guerram HPSC meio de cultura, Pipeta as células para cima e para baixo várias vezes para quebrá-las em pequenos aglomerados e misture bem.
  9. Transferência das células para novos alimentadores MEF em 1: 3-1: 6 ratio.
  10. Troca da mídia todos os dias e passagem das células a cada 5-6 dias.

3 Preparação de Células para Diferenciação

  1. Pelo menos um dia antes da preparação de células, preparar algumas placas de Matrigel (tipicamente três poços de uma placa de 6 poços). Dilui-se com o Matrigel frio (4 ° C) de DMEM / F12 a 1:40 e adicionar 1 mL de Matrigel por poço de placas de 6 poços. Incubar as placas de Matrigel a 4 ° C durante a noite. NOTA: É possível selar as placas de Matrigel com Parafilm e armazená-las a 4 ° C durante o tempo que uma semana.
  2. Use células (ver Passo 2) 4 dias após a passagem. Remova todas as colônias diferenciadas das placas. Aspirar o meio da placa de cultura, adicionar 1 ml de Accutase por poço e incubar as células a 37 ° C durante 5 min.
  3. Durante a incubação, preparar alguns gelatin placas por adição de 1 ml de gelatina a um poço de placas de 6 poços. Colocar estas placas e as placas de Matrigel preparadas um dia antes na incubadora.
  4. Após a 5 min de incubação ou quando as células tornaram-se semi-flutuante, as células de pipeta para cima e para baixo várias vezes para fazê-los em células individuais.
  5. Recolha de células individuais em tubos de 15 ml e centrifugar a 258 xg durante 3 min.
  6. Suspenda as células com uma quantidade apropriada de soro contendo meio de cultura, HPSC e adicionar Thiazovivin para a concentração final de 2 fiM.
  7. Transferência de células em placas revestidas com gelatina na proporção 1: 1, e incubar as células a 37 ° C durante 30 minutos para remover os alimentadores de MEF.
  8. Transferência das células para um tubo cónico de 15 ml, adicionar soro contendo meio apropriado HPSC e contagem das células com um hemocitómetro.
  9. Centrifuga-se as células a 258 xg durante 3 min.
  10. Durante centrífuga, adicionar Thiazovivin se apropriar mTeSR1 meio para fazer uma concentração de 2 uM.
  11. Depois de centrifugação, umaspirate o meio e adicionar meio mTeSR1 apropriado com Thiazovivin de modo que não são de 1,8 x 10 5 células / ml de meio.
  12. Retire das placas de Matrigel da incubadora, aspirar o Matrigel e juntar 2 ml de células mistas para um poço das placas de 6 poços.
    NOTA: A densidade celular deve ser 3,6 x 10 4 células / cm2 de área de superfície.
  13. Retorne as placas de volta para a incubadora, e deixar que as células anexar, durante 24 horas.
  14. 24 h após o plaqueamento das células, aspirar meio antigo e adicionar 2 ml de meio novo mTeSR1 por poço e deixar crescer as células durante mais 24 horas antes de iniciar a diferenciação.

Diferenciação Celular

  1. Iniciar a diferenciação de 48 horas após replating as células em placas de Matrigel.
  2. Aspirar o meio de cultura da placa, lave as células uma vez com PBS, e adicionar 2 ml do seguinte meio de diferenciação por poço: meio de diferenciação KSR suplementado com 10 pM e 100 nM SB431542 LDN-193189 Marque este dia como D0 de diferenciação.
  3. Mude meio todos os dias das D0 a D20.
    NOTA: Pode-se preparar o meio para o uso não mais do que dois dias de cada vez.
  4. Utilizar o meio seguinte para o D1 e D2: meio de diferenciação KSR suplementado com SB431542 10 mM, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, e 50 ng / ml FGF8b.
  5. Usar o seguinte meio para a D3 e D4: meio de diferenciação KSR suplementado com SB431542 10 mM, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 uM CHIR99021.
  6. Utilizar o meio seguinte para D5 e D6: 75% KSR meio de diferenciação, mais 25% de meio de diferenciação de N2 suplementado com 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 uM CHIR99021.
  7. Use o seguinte meio para D7 e D8: 50% KSR meio de diferenciação mais 50% meio de diferenciação N2 suplementado com 100 nM LDN-193189 e 3 mM CHIR99021.
  8. Use o seguinte meio para D9 e D10: 25% KSR meio de diferenciação mais 75% meio de diferenciação N2 suplementado com 100 nM LDN-193189 e 3 mM CHIR99021.
  9. Utilizar o meio seguinte para D11 e D12: diferenciação de meio B27 suplementado com 3 uM CHIR99021, 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF, a 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM e 0,1 mM de cAMP.
  10. Utilizar o meio seguinte para o resto de diferenciação: meio de diferenciação B27 suplementado com 10 ng / mL de BDNF, 10 ng / mL de GDNF, a 1 ng / ml TGF3, ácido ascórbico 0,2 mM e 0,1 mM de cAMP.
  11. A cerca de D16 de diferenciação, preparar algumas placas / laminina / Fibronectina poli-L-ornitina. Dilui-se poli-L-ornitina solução estoque com frio (4 ° C) de PBS a 15 ug / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite.
  12. Aspirar a solução de poli-L-ornitina, lavar as placas 3 vezes com água estéril e depois secar as placas.
  13. Diluir laminina estoque solbuição com frio (4 ° C) de PBS a 1 mg / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite.
  14. Aspirar a solução de laminina, lavar as placas 3 vezes com água estéril e depois secar as placas.
  15. Diluir solução-mãe de fibronectina com frio (4 ° C) de PBS a 2 ug / ml, adicionar 1 ml de uma cavidade de placas de 6 poços, e incuba-se as placas a 37 ° C durante a noite.
  16. Placas de vedação com Parafilm e colocá-los a 4 ° C por até duas semanas.
  17. Após 20 dias de diferenciação, replate células para os / as placas Laminin / fibronectina poli-L-ornitina. Aspirar o meio de diferenciação, adicionar 1 ml de água morna (37 ° C) a Accutase um poço de placas de 6 poços, e incuba-se as células a 37 ° C durante 5 min.
  18. Durante a incubação, colocar as placas / poli-L-ornitina Laminina / fibronectina na incubadora.
  19. Após a incubação de 5 min ou quando as células tornaram-se semi-flutuante, suavemente as células para cima e para baixo da pipeta várias vezes paratorná-los em células individuais.
  20. Recolher as células individuais em tubos de 15 mL cónico, e adicionar a quantidade apropriada de meio neurobasal para contagem de células, que irá variar dependendo de expansão (após 11 dias de diferenciação, as células podem expandir de 15-20 vezes). Contar as células usando um hemocitômetro.
  21. Centrifuga-se as células a 258 xg durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com meio de diferenciação B27 de modo a que a concentração de células é de 1 x 10 6 células / ml de meio.
  22. Aspirar fibronectina a partir das placas, lava-se duas vezes com PBS, e adicionar 2 ml de células para um poço de placas de 6 poços.
    NOTA: A densidade celular para replating deve ser de 2 x 10 5 células / cm2 de área de superfície.
  23. Mude médio de 24 horas mais tarde para remover as células mortas não acopladas.
  24. Mudar meio todos os outros dias até que os pontos de tempo desejado para uma dada experiência.

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Resultados

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Uma visão geral do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1. A eficiência da diferenciação protocolo aqui apresentada baseia-se no estado das células iniciadoras. Portanto, é essencial ter a certeza de que, em primeiro lugar um remove todas as colónias diferenciadas antes dissociando hPSCs em células individuais de diferenciação, e, segundo, uma esgota a maioria, se não todas, as células alimentadoras MEF por incubação das células em placas revestidas com gelatina durante 30 min, e em terceiro ...

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Discussão

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As células estaminais pluripotentes humanas (incluindo ambos os hESCs e hiPSCs) podem ser diferenciadas in vitro para gerar a maioria, se não todos, os tipos de células do nosso corpo, incluindo neurónios DA, o que foi demonstrado em estudos anteriores 19. Aqui, com base no conhecimento do desenvolvimento embrionário neurônio dopaminérgico 20 e protocolos publicados a partir de outros laboratórios 14,15, otimizamos as condições de cultura para a geração de neurônios DA de hESCs ...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores agradecem aos membros do laboratório Renee Reijo Pera pela ajuda durante o desenvolvimento deste protocolo e durante a preparação deste manuscrito. Este trabalho é apoiado pelo laboratório compartilhado do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) (CL-00518).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMLife Technologies10569-010
FBSLife Technologies26140
penicilina/ampicilinaLife Technologies15140-122
DMEM/F12Life Technologies10565-018
KSRLife Technologies10828-028
Aminoácido não essencialLife Tecnologias11140-050
b-mercaptoetanolMilliporeES-007-E
bFGFR& D Systems233-FB-025
mTesR1STEMCELL Technologies5850
Colagenase IVLife Technologies17104-019
GelatinaSigma-AldrichG9391
Suplemento N2Life Technologies17502-048
Suplemento B27Life Technologies17504-044
NeurobasalLife Technologies21103-049
GlutamaxLife Technologies35050-061
PBSLife Technologies10010-023
Fator de crescimento reduzido matrigelBD Biosciences354230
AccutaseMP Biomedicals1000449
ThiazovivinSanta Cruz Biotechnologysc-361380
SB431542Tocris Bioscience1614
LDN-193189Stemgent04-0074
SAGEMD Millipore566660-1MG
PurmorphamineSanta Cruz Biotechnologysc-202785
FGF8bR & D Systems423-F8-025
CHIR99021Cellagen TechnologyC2447-2s
BDNFR& D Systems248-BD-025
GDNFR& D Systems212-GD-010
TGF-beta3R& D Systems243-B3-002
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA4034
cAMPSigma-AldrichD0627
Camundongo anticorpo NESTIN humanoSanta Cruz Biotechnologysc-23927/1.000 diluição
Coelho anti humano OTX2 anticorpoMilliporeAB95661/2.000 diluição
Cabra anti humano FOXA2 anticorpoR& D SystemsAF24001/200 diluição
coelho anti humano LMX1a anticorpoMilliporeAB105331/1.000 diluição
Coelho anti humano TH anticorpoPel FreezP40101/500 diluição
Frango anti humano TH anticorpoMilliporeAB97021/500 diluição
Camundongo anti humano TUJ1 anticorpoCovanceMMS-435P1 /, 2000 diluição
Abcamabcam ab30738coelho anti GIRK2/300
AnticorpoAbcamabcam ab250851/400 da diluição
Eppendorf5804
1 1Anticorpo humano do humano do coelho diluição 1 humano

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
  4. Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
  5. Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
  6. Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  7. Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
  8. Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
  9. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
  10. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
  12. Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
  13. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
  14. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  15. Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
  16. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
  17. Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
  18. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  19. Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
  20. Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
  21. Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
  22. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).

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