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Artigo de método

De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

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DOI:

10.3791/51743

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13 de novembro de 2014

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1DNA Medicine Institute, 2Harvard Medical School, 3NASA Glenn Research Center, 4ZIN Technologies

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Voo espacial diagnósticos de sangue precisa de inovação. Poucas manifestações foram publicados ilustrando em voo, tecnologia de diagnóstico de saúde de gravidade reduzida. Aqui apresentamos um método para a construção e operação de um equipamento de teste de vôo parabólico para um projeto protótipo point-of-care citometria de fluxo, com componentes e estratégias de preparação adaptáveis ​​a outras configurações.

Resumo

Até recentemente, as amostras de sangue foram coletadas de astronautas em voo, transportado para terra no ônibus espacial, e analisadas em laboratórios terrestres. Se os seres humanos são a viajar para além da órbita baixa da Terra, a transição para o espaço-pronto, ponto-de-cuidado é necessário (POC) de testes. Este tipo de teste precisa ser abrangente, de fácil execução em um ambiente de gravidade reduzida, e não afetado pelas tensões de lançamento e voo espacial. Inúmeros dispositivos POC foram desenvolvidos para imitar homólogos escala laboratorial, mas a maioria tem aplicações limitadas e poucos têm uso demonstrável em, um ambiente de gravidade reduzida em voo. Na verdade, as manifestações de diagnósticos biomédicos em gravidade reduzida são limitados por completo, fazendo a escolha de componentes e certos desafios logísticos de difícil abordagem quando se pretende testar uma nova tecnologia. Para ajudar a preencher o vazio, estamos apresentando um método modular para a construção e operação de um dispositivo de diagnóstico protótipo do sangue e sua p associadoarabolic equipamento de teste de vôo que cumprir as normas de vôo-teste a bordo de um vôo parabólico, aeronave de gravidade reduzida. O método se concentra primeiro em assembléia plataforma para, testes de gravidade reduzida em voo de um citômetro de fluxo e um chip de mistura microfluídica companheiro. Componentes são adaptáveis ​​a outros projetos e alguns componentes personalizados, tais como um carregador amostra microvolume eo micromisturador pode ser de particular interesse. O método então foco muda para a preparação do voo, oferecendo orientações e sugestões para se preparar para um teste de vôo bem sucedido no que diz respeito ao treinamento do usuário, o desenvolvimento de um procedimento operacional padrão (POP), e outras questões. Finalmente, os procedimentos em voo experimentais específicos para nossas manifestações são descritas.

Introdução

A inadequação dos diagnósticos de saúde atual do espaço do pronto apresenta um fator limitante para a mais profunda exploração espacial tripulada. Diagnóstico precisa ser abrangente e fácil de usar em gravidade reduzida, e relativamente pouco afetado pelas tensões de lançamento e voo espacial (por exemplo, altas forças G, vibração, radiação, mudanças de temperatura e de pressão da cabine alterações). A evolução dos testes point-of-care (POCT) pode se traduzir em soluções eficazes voo espacial através do uso de amostras de pacientes menores (por exemplo, uma picada no dedo), fluídica mais simples e menores (ou seja, microfluidics), e reduziu exigências de energia elétrica, entre outros vantagens. Citometria de fluxo é uma abordagem atractiva para o POC em espaço devido à ampla utilidade da tecnologia, incluindo para contagem de células e quantificação biomarcador, assim como o potencial de miniaturização significativa. Relevante-espaciais anteriores citómetros de fluxo incluem o 'effic embalagem nucleariency '(NPE) instrumento que utilizou fluorescência induzida simultânea arco-lâmpada e volume eletrônico (Coulter volume) de medição 1-4, um relativamente pequeno fluxo de bancada citômetro representando a' primeira geração de fluxo em tempo real de dados de citometria durante gravidade zero "5, um "microflow sheathless citômetro" capaz de 4 e 5-parte de glóbulos brancos (WBC) contagem diferencial utilizando pré-tratados 5 mL de amostras de sangue total de 6-9, e um 'de fibra óptica baseado' citômetro de fluxo recentemente testado a bordo no Internacional Space Station 10.

Avaliando tecnologia de diagnóstico para aplicações espaciais em potencial é normalmente realizada a bordo da aeronave de gravidade reduzida que utilizam uma trajetória de vôo de aproximadamente parabólico para simular um nível escolhido de ausência de peso (por exemplo, de gravidade zero, marciano-gravidade) 11. A avaliação é um desafio, porque oportunidades de voo são limitados, RePetjanelas curtas tivo da microgravidade pode torná-lo difícil de avaliar metodologias ou processos que normalmente requerem períodos ininterruptos com mais de 20-40 segundos, e as manifestações podem exigir equipamentos adicionais que não são facilmente utilizado em voo 12-15. Além disso, as manifestações anteriores do in vitro (IVD) tecnologias de diagnóstico usados ​​em, ou concebidos para reduzir a gravidade são limitados e muito trabalho ainda não publicado. Além dos citómetros de fluxo acima, outros IVD-tecnologias relevantes para o espaço descrito na literatura incluem um dispositivo de toda mancha de sangue para aplicações de imunofenotipagem 16, um baseado em câmera automatizada citômetro 12, um analisador clínico portátil para potenciometria integrado, amperometria, e Conductometria 12,17, um dispositivo de microfluidos 't-sensor de' para a quantificação do analito que se baseia na mistura à base de difusão e de separação 18, e uma rotação 'laboratório num CD' diagnósticos plataforma 19,20. Os recém-chegados aos testes em gravidade reduzida pode também olhar para demonstrações de vôo parabólico não relacionadas com diagnóstico in vitro ao tentar fazer avaliação dispositivo possível (ou descobrir o que é possível). Manifestações de outros experimentação médica ou biológica anterior com a preparação do voo, as estratégias de bordo e equipamentos de teste de vôo documentado estão incluídos na Tabela 1 15, 21-35. Estes podem ser informativo, devido à inclusão de tarefas manuais de bordo, o uso de equipamentos especializados e de contenção experimental.

Categoria Exemplos
Atendimento médico de emergência A intubação traqueal (guiado por laringoscópio, em manikem) 21, de suporte de vida cardíaca (porcos anestesiados) 22
O tratamento cirúrgico A cirurgia laparoscópica (vídeo simulado 23, em porcos anestesiados 24,25)
Imagiologia médica ou avaliação fisiologia O ultra-som com câmara de pressão negativa inferior do corpo 26, fluxômetro Doppler (cabeça montado) 27, monitor de pressão venosa central 28
Equipamento biológico Especializada Leitor de microplacas (e caixa em voo luva) 29, o sistema de controle de temperatura para os experimentos do ciclo celular, 30 (microscópio de campo claro, contraste de fase e fluorescência multi-canal capaz) 15, capilarunidade de electroforese acoplada ao microscópio vídeo 31
Outro Colheita das plantas com uma pinça 32, continha 33,34 ratos e peixes 35 para observação

Tabela 1. parabólica voo de demonstração com exemplos bem descrito Métodos / Experimentos

Para expandir a exemplos anteriores e proporcionar um maior conhecimento sobre bem-sucedidas demonstrações em voo, estamos apresentando um procedimento modular e adaptável para a construção e operação de um protótipo citômetro de fluxo com tecnologia de mistura de microfluídica relacionado como parte de um equipamento de teste de vôo parabólico. O equipamento permite demonstrações de carregamento da amostra, mistura de microfluídica, e detecção de partículas fluorescentes, e foi testado a bordo da NASA Facilitado Access 2010 para o ambiente espacial (FAST) flig parabólicahts, voadas a partir de 29 setembro - 1 outubro de 2010. Estas demonstrações puxar desde o início, meio e fim, respectivamente, de um fluxo de trabalho dispositivo potencial no qual amostras de sangue do tamanho de ponta de dedo-são carregados, diluído ou misturado com reagentes, e analisados ​​por meio óptico detecção. Dimensionamento de um citômetro de fluxo em uma unidade compacta requer inovação e seleção cuidadosa parte. Personalizado e componentes off-the-shelf são usados ​​aqui, escolhido como melhores aproximações iniciais de escolhas componente final, e pode ser adaptável para os projetos de outros inovadores. A seguir um resumo das escolhas de componentes do protótipo, a instalação é descrita em uma estrutura de apoio que serve como um esqueleto para a montagem da sonda. Componentes do protótipo são atribuídos locais, garantido, e acompanhado pelos componentes adicionais necessários para a experimentação bem sucedida. Atenção então muda para procedimentos mais abstratos que envolvem o procedimento padrão de operação (SOP) desenvolvimento, treinamento e outros aspectos logísticos. Finalmente, os procedimentos específicos de demonstração sãodescrito. As estratégias descritas aqui e as escolhas de apoiar os componentes da plataforma (por exemplo, microscópio, caixa de acrílico, etc.), embora implementadas aqui para protótipo específico, falar com as questões gerais e desafios relevantes para testar qualquer equipamento de diagnóstico de sangue em um ambiente de gravidade reduzida .

Nos vôos 2010, dois lunar-gravidade (que atingem cerca de 1/6 terra gravidade) e dois voos de micro-gravidade foram agendadas por 4 dias, embora em última análise, estes foram reprogramadas por 3 dias. Manifestações foram realizadas a bordo de um jato modificado avião privado operado, narrow-body 36. Cada voo desde 30-40 parábolas, cada um produzindo cerca de 20 seg de alta gravidade (aproximadamente 1,8 g), seguido de 20-25 segundos de condições de gravidade reduzida. Depois de metade das parábolas foram executados, o avião fez uma pausa por um período de cerca de 5-10 min em vôo nivelado para permitir que o avião dar meia volta e voltar para o local de pouso enquanto performing o restante das parábolas.

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Protocolo

As amostras de sangue humano utilizados neste protocolo foram coletados com a aprovação do IRB utilizando protocolos minimamente invasivos (ver Agradecimentos).

1. Rig Assembleia

  1. Montar componentes do protótipo (fluídicos, ópticos, eletrônicos de controle / aquisição de dados) para um fluxo simples sistema de citometria para ser usado em condições de gravidade reduzida
    1. Prepare um sistema de pressão com peso e mínimo de energia necessário para conduzir fluidos do sistema
      1. Ligue a bomba de ar em miniatura a um sensor de pressão diferencial.
      2. Para manter uma pressão constante de condução, controlar a saída da bomba usando por largura de pulso modulação e um ciclo de trabalho regulado utilizando um controlador proporcional-integral-derivativo em software de controle personalizado (passo 1.1.7).
    2. Montar um recipiente fonte de fluido que pode ser carregado sem retenção de ar (veja o passo 3.4)
      1. Montar um frasco de plástico rígido (Figura 1A), com uma diaphra látexgm, firmemente cap alcançável, e tubos de entrada de ar na base do frasco (selada conexão usando adesivo óptico).
      2. Assegure-se que a bomba pressuriza o ar ou frasco sem vazamento de fluido, comprimindo o diafragma para conduzir o fluxo de fluido para fora do tubo de tampa de saída.
    3. Projetar um recipiente de resíduos de fluidos para coletar resíduos sem a construção de uma contrapressão que irá comprometer o fluxo
      1. Use uma colada frasco-dentro-de-um-frasco de design (Figura 1B) para contenção de casal.
      2. Tampe os frascos com uma janela de esponja de espuma de seguro que retém resíduos flutuantes, mas permite a equalização da pressão de ar com o ambiente de cabine.
    4. Faça um carregador de exemplo para utilização em gravidade reduzida
      1. Máquina e montar um projeto de fixação de mola com guiderails (Figura 1C) de tal forma que grampos de forma confiável uma coluna capilar equipado bainha entre dois anéis de vedação na linha de fluido. Certifique-se de que preserva volume de amostra ao carregar, acomoda sistema priming quando uma amostra não for inserido, e evita a introdução de bolhas errante.
      2. Certifique-se de que, na ausência de um capilar, as molas apertam os O-rings em conjunto para completar a linha de fluido e permitir escorva sem vazamento (Figura 1D, esquerda).
    5. Projetar um micromisturador que não depende de subcomponentes mecânicos movidos a funcionar
      1. Conceber um micromisturador-vórtice espiral de dois entrada (Figura 1E) que atinge adveccao caótica necessária para vencer um fluxo laminar dentro dos canais de microfluidos. Este projeto oferece toda entrar fluido a jusante, de modo que um prazo amostra não afeta o outro.
      2. Por conveniência, fabricar desenho escolhido usando o método (Figura 1F) rápida protótipo polidimetilsiloxano (PDMS). Utilize um projetado fotomáscaras computer-aided bidimensional impresso em 20.000 dpi para fabricar o necessário SU-8 molde em uma instalação de sala limpa 37.
        NOTA: Use um modicados calibre 23 ajuste a um moinho de perfuração vertical para fazer furos nas entradas, vortex, entrada de detecção, e os pontos de saída de detecção, e uma lupa de mão para ajudar a apontar a agulha. Recorte as fichas dos PDMS utilizando uma lâmina de barbear e se encaixam nos furos com 0,5 "pinos de aço ocos saindo do lado não-moldado volta do chip. Conecte o pino de saída espiral central para o pino de entrada do canal de detecção utilizando tubos microbore.
      3. Chips completamente limpo com etanol e seco superfície moldada com fita adesiva fosca. Use uma seringa vazia para explodir etanol fora dos pinos. Trate chip de PDMS e uma tampa de vidro intocada dentro limpador de plasma e unir-los dentro de 10 segundos, aplicando uma leve pressão, verificando imediatamente por microscopia de luz que o chip está totalmente pressionado, sem comprometer a permeabilidade do canal.
    6. Montar um bloco óptico em miniatura na palma da mão para detectar partículas de fluxo individuais
      1. O design na Figura 2AB é adequado para duas cores eiluminação a laser pifluorescence e detecção, e utiliza um canal direto PDMS (120 por 200 mm) célula de fluxo por conveniência.
      2. Monte bloco (Figura 2C) utilizando componentes optomechanical disponíveis no mercado e alinhar os módulos de contagem de fóton único juntamente com fibras.
    7. Eletrônica de design e software para controle de dispositivos e aquisição de dados
      1. Por conveniência em prototipagem cedo, utilizam peças soldadas à mão ligadas a aquisição de dados (DAQ) cartas (Figura 2D).
      2. Código e um programa de software personalizado (exemplo na Figura 2E) para operar dispositivos de plataformas e sincronizar todos os dados.
  2. Os componentes adicionais (não formalmente parte do protótipo)
    1. Incorporar um acelerômetro de 3-dimensional (Figura 2D, à esquerda) e um medidor de vazão (não retratado). Um acelerômetro está presente a bordo da aeronave, mas (provavelmente) não pode ser diretamente sincronizado com other dados gravados.
  3. Esquema de energia elétrica
    1. Um mecanismo de desligamento eletrônica rápida e completa (necessário por razões de segurança nos voos de gravidade reduzida)
      1. Conecte um filtro de linha única (com um único botão I / O) para o painel de distribuição de energia da aeronave (120 VAC 60 Hz).
      2. Remova a bateria do laptop e definir laptop para operar através de cabo de alimentação sozinho.
    2. Energia para todos os dispositivos
      1. Energia diretamente do computador portátil (bateria removida), um microscópio de luz, e dois detectores de fótons usando filtro de linha.
      2. Dispositivos da energia restante através de cartões DAQ USB conectado ao laptop ou usando baterias.
  4. Layout de equipamento de vôo-pronto
    1. Considerações sobre o sucesso do desempenho em voo
      1. Espaço total disponível é limitada a uma área menor do que o previsto para uma demonstração semelhante no chão (Figura 3A). Considere o espaço total disponível e como isso éritmo será dividido entre o espaço plataforma experimental (incluindo para componentes além daqueles formalmente parte do protótipo) eo espaço do usuário em torno do equipamento. Plataformas experimentais variam em termos de posicionamento para a frente ou para trás, mas isso não afeta em grande parte do espaço operacional disponível (ou em voo física).
      2. Determinar quais componentes são mais apropriadamente acessado em um pé, ajoelhado, ou altura do piso, bem como considerando que os componentes irão beneficiar a maioria da protecção alcançado dentro de uma estrutura de apoio.
    2. Estrutura de apoio Rig
      1. Obter ou construir um rack de equipamento vertical que atende considerado necessidades de layout, contém todos os componentes, permite diferentes níveis verticais de organização, resiste a acelerações de vôo, e de forma segura atribui ao chão da cabine da aeronave pretendida.
      2. Atribuir componentes para níveis dentro do rack de equipamentos (Figura 3B): um nível superior para colocar o laptop, um nível médio-rack para csubcomponentes protótipo ontain e um nível do chão para conter toalhetes extras, luvas e um recipiente de resíduos diversos.
      3. Conceber estruturas adicionais dentro do rack para acomodar diferentes níveis desejados. Implementar vigas de suporte em 'mid'-altura para segurar um 2 pés por 2 pés placa microscópio placa de ensaio para aparafusar os componentes da plataforma, e vigas de sustentação de aproximadamente dois pés mais elevados para apoiar um laptop cocho aprovado o vôo.
      4. Dentro níveis verticais, determinar disposição dos componentes ideal, tendo em conta as limitações de acessibilidade incorridos devido à presença de outros componentes, bem como devido ao potencial de posição / orientação do próprio equipamento a bordo de um voo (por exemplo, 4 th lado de uma plataforma quadrada pode estar perto de parede aviões, deixando apenas três lados acessíveis).
        NOTA: As tiras de perna para proteger os operadores de teste estão a uma distância fixa da plataforma e podem não estar disponíveis em todos os lados.
      5. Com base nestas determinações, divide a placa de placa de ensaio em 4 quadrantes (Figura 3C), colocando locais dedicados para a eletrônica e bloco óptico em direção à parede da aeronave, eo carregador de amostra e chip microfluídico em direção ao espaço da cabine.
  5. Protótipo de fixação, contenção e configuração de visualização
    1. Eletrônica do sistema
      1. Projeto, de corte a laser, e montar uma caixa de acrílico personalizado (Figura 2D) para conter os cartões DAQ (amarrado) e placas de mão soldada (aparafusada à parede caixa).
      2. Utilize uma porta de vaivém para facilitar o acesso (fixo em voo com prendedor de tecido gancho e loop) e orifícios de saída para cabos USB e fios.
    2. Carregador de Amostra
      1. Fabricar um acrílico personalizada caixa 'luva' (Figura 4A) com orifícios de acesso braço para proporcionar um espaço cúbico no qual executar a demonstração loader (Figura 4C) sem risco de contaminação da cabine de vôo.
      2. Tubagem de alimentação de e para o carregador através de pequenos furos circulares na parte lateral da caixa.
    3. Micromixer
      1. Adaptar o equipamento utilizado no terreno. Tranque um microscópio estereoscópico (Figura 4B) para a placa de placa de ensaio e encaixá-lo com um suporte de acrílico chip de costume, também aparafusado à placa.
      2. Montar uma câmera CCD USB ​​à ocular do microscópio e conectá-lo ao computador portátil (Figura 4D) para salvar vídeo sincronizados com outros dados (gravidade, pressão condução ea taxa de fluxo).
    4. Bloco óptico
      1. Fabricar uma caixa de acrílico personalizado opaco (Figura 4A, à direita) para cobrir o bloco, protegendo-o da luz ambiente e controlar os perigos a laser.
      2. Utilize uma 'janela' filtro óptico para verificar com segurança a função laser.
    5. Laptop
      1. Tranque uma bandeja laptop aprovado o vôo para as vigas de apoio dentro da estrutura de apoio.
      2. Use hook-e-velcro para prender os cabos USB junto arquitetura rack.
  6. Em voo implementação demonstração
    1. Intervenções simples para avançar através de manifestações
      1. Incorporar componentes adicionais que eliminam necessários ajustes manuais de tubulação em voo ou outras ações que exigem destreza significativa ou se arrisquem a vazar fluidos para o ambiente da cabine.
        1. Custom-máquina e integrar um colector de pressão (Figura 5A) consistindo de um cilindro de alumínio perfurado e roscado para encaixar um adaptador luer rosca de agulha servindo como uma admissão de pressão. Faça furos pequenos em torno da circunferência para caber anéis e tubos microbore como outlets. Use a pressionar vários frascos de origem simultaneamente.
        2. Montar um painel de três vias válvulas solenóide (Figura 5B) controladas por interruptores em tandem MOSFET (Figura 5C) conectados a uma placa DAQ. Adaptar microbore tubulação para caberportas da válvula. Use para controlar o fluxo de fluido dos diferentes frascos.
      2. Software programa para prosseguir através de demonstrações (Figura 6) com intervenções de um único botão (por exemplo, um único clique no laptop).
    2. Controle manual de backup
      1. Adicionar grampos de slides para fraudar a permitir algum controle manual sobre os fluidos, talvez se inesperadamente tubulação precisa ser desconectado e reconectado durante o vôo.
      2. Incluir toalhetes de limpeza suficientes na seção rack de chão em caso de vazamentos em vôo.
  7. Voo perturbação prontidão: sistema Pronto para possíveis forças repentinas solavancos, vibrações, ou colisão de passageiros em vôo.
    1. Estabilização Alinhamento
      1. Aplicar epóxi de secagem rápida aos componentes alinhados que são facilmente desajustado, particularmente os componentes ópticos.
      2. Aplicar epóxi de grau industrial sobre o epóxi de secagem rápida, bem como para garantir outro components como necessárias, incluindo a fixação da câmera CCD à ocular do microscópio.
    2. Teste de perturbação física
      1. Agite estrutura de apoio equipamento com todos os componentes no lugar.
      2. Verifique a funcionalidade componente individual depois de submeter o equipamento à perturbação, componentes ópticos especialmente alinhados.
    3. Gestão de risco de Passageiros
      1. Aplicar enchimento de espuma para áreas (cantos, bordas) do equipamento estrutura de rack vertical que poderia prejudicar um passageiro de vôo que acidentalmente bate na plataforma (Figura 4C).
      2. Estofamento seguro com fita adesiva preta.

2. Demonstração Preparação e Logística

  1. Em voo e equipe de terra atribuições de função
    1. Atribuir operador (s) equipamento para realizar tanto a configuração do equipamento e todas as operações de hands-on em voo. Hands-on operadores podem visualizar melhor quando a instalação equipamento é completo.
    2. Atribuir um leitor SOP para ler o SOP em voz alta durante o treinamento e durante o voo. O processo de leitura SOP durante o treinamento pode identificar encenação estranho ou inoportuna.
    3. Atribuir apoio em terra para realizar a preparação da amostra e quaisquer outras tarefas de preparação que não envolvem diretamente o equipamento, minimizando os encargos de tempo aos operadores de plataformas.
  2. Procedimento operacional padrão inicial (SOP) desenvolvimento
    1. Escreve todas as medidas para incorporar pré-vôo (dia anterior e de manhã antes), em voo, e os procedimentos pós-voo, utilizando apenas equipamentos e materiais que estarão disponíveis no local de vôo. A 5-10 min bloco de nível de vôo de avião pode estar disponível para os procedimentos de configuração de última hora antes de começar parábolas ou no meio do caminho, enquanto o avião gira em torno.
    2. Atribuir procedimentos experimentais em voo para números dedicados de parábolas, lembrando que as parábolas provavelmente vai ser separada a meio para permitir que o avião dar meia volta e voltar para o pousolocal, e que um outro grupo pode solicitar ao plano para nivelar meados de experimento ou menos parábolas podem ser voadas do que o esperado.
    3. Conceber procedimentos de demonstração para minimizar o risco de perigo biológico além contenção eficaz, evitando espécimes biológicos reais quando possível. Utilize corante alimentar azul cravado com contas de contagem fluorescentes (Figura 1D) como uma alternativa para o sangue durante a manifestação carregador amostra.
  3. Formação de Demonstração
    1. Definir um cronograma de treinamento suficiente para rever integralmente e refinar a SOP, bem como gerar dados de controle de solo completos para comparar com os dados de voo.
    2. Depois de realizar SOP pré-vôo, 'bloquear' o equipamento em uma sala para simular a experiência em voo, cortando o acesso a ferramentas ou materiais terrestres. Para o treinamento ainda mais rigoroso, marcar uma parte do piso satisfazer as dimensões atribuídas que estarão disponíveis em voo 32.
    3. Durante o treinamento, siga SOP eXactly, e usar um cronômetro para anunciar 20-30 parábolas seg, indicando entrada e saída de gravidade reduzida, bem como uma ruptura parábola pleno vôo.
    4. Incorporar SOPs finalizados em horários reais dias de voo, dividindo as atividades "pré-vôo" entre o dia de vôo e do dia-antes-de vôo.
    5. Treinar para ocorrências inesperadas durante o voo, incluindo forças repentinas bater o equipamento ou o avião de repente nivelamento no meio de um experimento.
    6. Estabilidades das análises das amostras e reagentes quando submetido a uma pausa prolongada (hr ou mais) entre procedimentos pré-voo e em voo atividade. Note também que as temperaturas podem ser significativamente maior no local de vôo.
    7. Treinar várias pessoas como operadores primários para operar habilmente o dispositivo durante o vôo. É imprevisível que vai ficar doente durante as parábolas, e um determinado usuário pode ser afetado em um vôo e ficar doente em outro.
  4. Equipamento de terra e apoiandomateriais
    1. Montar uma caixa de ferramentas para incluir componentes e equipamentos de backup necessárias para reparos, incluindo ferramentas manuais, equipamentos de solda e cola epóxi / entre muitos outros itens.
    2. Reúna amostra e as quantidades de reagentes para além do que é destinado para uso durante os voos regulares em caso de adiamento de vôo inesperado ocorre depois de uma amostra ou reagente já foi preparado para o vôo.
  5. Remessa
    1. Remessa necessária para transportar o equipamento de instalação, equipamento de terra (ferramentas, centrífuga, Pipetas, misturador de vórtice, outros) e perecíveis (células do sangue, reagentes). Certifique-se o tempo adequado para receber, inspecionar, montar e hardware de teste para a campanha de vôo.
    2. Rig Encase em todos os lados, exceto inferior utilizando plástico bolha. Rig navio utilizando uma caixa caixote de madeira personalizado, equipado internamente com almofadas de espuma e material de choque.
    3. Navio de apoio equipamento de terra / ferramentas em um recipiente rígido ou no peito.
    4. Perecíveis navio em 1 de espessura. Isoladoscaixa da espuma, contendo gelo seco para itens que necessitam de -20 ° C e freezer de armazenamento pacote legal para itens que necessitam de 4 ° C de armazenamento.
  6. Testes pré-vôo
    Realizar testes de pré-vôo no local de vôo para verificar a funcionalidade de todos os componentes de vários dias antes dos vôos.
    Plataformas de vôo são pesadas e grua carregados na aeronave, e, provavelmente, permanecer na aeronave para a duração da semana de vôo.

3. demonstrações em voo

Manifestações / experimentos estão divididos entre duas designações dia ("Dia A" e "Dia B" abaixo). Dia Um é designado para a demonstração micromistura e Dia B é designado para as manifestações de carga de detecção de partículas e de amostra.

  1. Preparação de amostras de aterramento para manifestações micromisturador (somente Um Dia)
    1. Dilui-se 3 ml de corante alimentar azul em 12 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS).
    2. Dilui-se 3 ml de corante amarelo alimentar into 12 ml de 1x PBS.
    3. Estirpe 15 ml de glóbulos vermelhos comercialmente purificadas.
      CUIDADO: Porque nenhum método de teste pode garantir com 100% de certeza da ausência de um agente infeccioso, os produtos de origem humana deve ser sempre tratada como riscos biológicos.
    4. Frascos de amostra de carga (Ver passo 3.3) para cada amostra, mais um adicional frasco contendo apenas soro fisiológico.
  2. Preparação de amostras de aterramento para a demonstração bloco óptico
    1. Combine 60 mL contas de contagem fluorescentes com 14 ml 1x PBS (4,3 contas / ul) com 1% Tween. Coloque em frasco da amostra.
      CUIDADO: Manuseie todos os produtos químicos com cuidado e usando equipamentos de proteção individual (EPI).
    2. Diluir 50 uL de uma picada no dedo amostra de sangue total de 100 vezes com 1x PBS e adicionar corante para SYTO 83 [final] = 5 uM. Levemente vortex para misturar. Incubar durante> 5 min à temperatura ambiente.
      ATENÇÃO: 83 corante SYTO é dissolvido em dimethylsulfoxides (DMSO), que é prontamente absorvido através da pele. Pode ser irritante para os olhos, vias respiratórias e pele. Manipular usando EPI.
    3. Centrífuga amostra de células (a 2.300 xg por 4 min), pipeta off sobrenadante.
    4. Lavar amostra de células coradas pela adição de 1 ml de PBS 1x, centrifugação a 2.300 x g durante 4 min pipetagem fora sobrenadante. Repita mais duas vezes.
    5. Retorno volume para 15 ml com PBS 1x para chegar a uma final de diluição 1: 500 vezes de estoque comercial original. Células de deformação e carga em frasco da amostra.
  3. Preparação de amostras de aterramento para carregador amostra de demonstração (apenas Dia B)
    1. Prepare consumíveis capilares para carregador amostra demonstração cortando tubos capilares micro-hematócrito em 15 segmentos mm com uma lâmina de barbear.
    2. Prepare amostra para carregador demonstração: Misture 250 L esferas estoque fluorescentes com corante alimentar azul puro 250 mL (500 contas / ul). Desenhe 250 mL da amostra em duas seringas de 1 ml, cada um equipado com um ne ponta rombaedle que está fechada com fita adesiva com fita isolante.
  4. Carregar frascos fonte de fluido
    1. Aplicar fresco, látex diafragma sem pó ao frasco (corte dedo de luva aceitável). Verifique se o diafragma é o tempo suficiente para estender a partir do piso do frasco e dobre a borda superior externa. Deslize o anel de frasco sobre a porção dobrada.
    2. Coloque uma braçadeira corrediça temporária para tubulação de saída tampa que vai impedir a expulsão de líquidos durante tampa de inserção.
    3. Antes de encher o frasco, negativamente pressurizar o frasco com uma seringa para expandir o diafragma. Despeje fluido a parte superior do frasco e coloque a tampa em um ângulo de modo que nenhum ar está preso sob a tampa durante a colocação do tampão (algum líquido vai derramar). Resumidamente remover braçadeira de slides para iniciar a tubulação de saída e liberação colapso pressão exercida pelo diafragma.
  5. Prepare demonstrações da plataforma
    1. Ligue e verifique todas as conexões de tubos
    2. Gancho frascos de origem no sistema. Frascos de caber em um acry personalizadotitular frasco lic e prenda-os com fecho e gancho-e-loop.
    3. Esvazie os resíduos contidos em frascos ou caixas.
    4. Verifique o espaço em disco rígido e software de demonstração personalizada de inicialização.
    5. Realize fluídica Sistema de injeção de procedimento específico para cada demonstração.
    6. Trocar em novas baterias para qualquer dispositivo alimentado por bateria (por exemplo, acelerômetro).
    7. Agitar manualmente amostras de partículas fluorescentes.
    8. Execute breve pré-vôo experimento de teste.
  6. Evite em voo enjôo
    1. Tome os medicamentos fornecidos (escopolamina e dextroanfetamina, ambos seguros e eficazes para a prevenção da doença de movimento em voo)
    2. Heed recomenda estratégias de posicionamento do corpo durante o voo (por exemplo, deite-se de costas durante o aumento da gravidade, com o corpo reto e cabeça inclinada para a frente, e permitir que o corpo a flutuar sobre o seu próprio durante a transição para a gravidade reduzida). Se possível, utilize várias parábolas iniciais para ajustar-se às mudanças de gravidade.
    3. Manter um saco de vômito de plástico facilmente acessíveis em um bolso frontal. Vômitos podem ocorrer de repente e sem precedente náuseas.
  7. Operadores de posição da plataforma, uma vez a bordo, se aproximando do espaço aéreo parábola dedicado. Fornecer espaço suficiente para permitir que os operadores de sonda para se deitar durante os intervalos de alta gravitação e permitir o acesso a tiras de perna. Uma vez parábolas começar, não se aplicam forças no corpo durante a gravidade reduzida, pois isso pode enviar o corpo para cima muito rapidamente e um pouco perigosa.
  8. Realize microfluídica misturador de demonstração (só dia A)
    1. Agitar manualmente frasco de sangue antes de execução de teste.
    2. Misture sangue e soro fisiológico em uma proporção de 1: 1 a 1,5, 2, 3, 4, 5, e 6 psi, durante pelo menos 2 parábolas cada, a gravação de dados de vídeo sincronizadas para outras leituras.
    3. Injectar ar na entrada de solução salina para testar se arquitetura canal vontade armadilha uma bolha que poderia evitar a mistura ideal.
    4. Misturar azuis e amarelas corantes alimentares em 1,5, 2, 3, 4, 5, e 6 psi durante pelo menos 2parábolas cada, mais uma vez a gravação de dados sincronizados.
    5. Aplicar grampos de slides para fluidos do sistema quando terminar para evitar ainda mais a produção de resíduos.
    6. Verifique a integridade dos dados antes de desligar eletrônicos em caso de demonstração repetição é necessária.
  9. Realize bloco óptico e demonstrações carregador de amostras (somente Dia B)
    1. Agitar manualmente amostras antes de executar.
    2. Dirija esferas fluorescentes de contagem através do bloco óptico para três parábolas. Sistema Lave com soro fisiológico durante pelo menos 1 parábola entre tipos de amostras.
    3. 3.9.2 Repetir para as partículas de hidrogel fluorescentes e glóbulos brancos.
    4. Verifique os dados para quaisquer entidades ausentes que precisam ser repetidos antes de passar para carregador amostra demonstração.
    5. Começar a gravar demonstração carregador amostra utilizando gravador de vídeo HD.
    6. Quando o avião entra gravidade reduzida, usar uma seringa de amostra para colocar uma gota da mistura de corante de contagem grânulo em uma ponta do dedo para simular uma amostra de picada no dedo. Use umaexageradamente grande queda (Figura 1D) para testar os limites da manutenção de uma amostra de picada no dedo em um dedo durante a gravidade reduzida.
    7. Use consumível capilar para pegar amostra (cerca de 10 mL) o dedo e carga em carregador capilar.
    8. Limpe amostra restante do dedo usando lenços incluídos na caixa.
    9. Dirija amostra em sistema óptico para detecção.
    10. Repita os testes várias vezes usando diferentes operadores.
    11. Verifique os dados para quaisquer entidades ausentes que precisam ser repetidos antes de desligar aparelhos eletrônicos.
  10. Desligamento pós-vôo
    1. Resíduos vazio e descartar corretamente usando recipientes de contenção de risco biológico rotulado como necessário. Os resíduos perigosos podem requerer a expedição para fora da instalação de aeronaves.
    2. Lavar completamente sistema, usando uma seringa de 5 ml carregado com água para proporcionar uma limpeza vigorosa. Válvulas de descarga para trás e para a frente através de todos os três portos.
    3. Limpe qualquer confusão usando álcool.
    4. Sistema reinjete para a próxima manifestação.

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Resultados

Os resultados representativos para a demonstração micromisturador aparece na Figura 7, quando vistos pela câmara CCD montada no microscópio estereoscópico. A mistura pode ser avaliada visualmente, em qualquer ponto ao longo da espiral, bem como no canal de saída para experiências que envolvem dois conjuntos de fluidos: sangue / soro fisiológico e corante azul / amarelo. A análise quantitativa das imagens bidimensionais podem incluir a determinação da uniformidade sombra por toda a largura do canal em di...

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Discussão

O método descrito aqui habilitado demonstração efetiva dos principais componentes de tecnologia (de carregamento da amostra, mistura microfluídica e detecção óptica) durante os 2.010 vôos parabólicos da FAST, com resultados comparáveis ​​aos testes em solo. Os métodos de treinamento e SOP aqui descritos foram particularmente eficazes, e ajudou a iluminar ferramentas e outro ser 'muletas' invocado para demonstrações práticas que não estariam disponíveis a bordo do vôo parabólico.

Área...

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Divulgações

Eugene Y. Chan, Candice Bae, e Julia Z. Sharpe são inventores de patentes de tecnologia relacionados apresentados através do Instituto de Medicina DNA, uma entidade comercial.

Agradecimentos

Desenvolvimento de hardware foi apoiada pela NASA SBIR Contratos NNX09CA44C e NNX10CA97C. A análise dos dados para os blocos e carregador amostra manifestações ópticas foi apoiado pela NASA Fase III Contrato NNC11CA04C. A coleta de sangue humano foi realizada utilizando NASA IRB Protocolo # SA-10-008. Software de controle / aquisição fornecido através do Dispositivo Médico Instrumentos Programa Nacional de Grant. Moldes para os microchips foram feitas na instalação de microfabricação Johns Hopkins e do Centro Harvard para sistemas em nanoescala. Otto J. Briner e Lucas Jaffe (Instituto de Medicina DNA) ajudou na montagem do rack durante o verão de 2010. NASA funcionários vídeo voo desde imagens de vídeo durante a semana de vôo. Carlos Barrientos (Instituto de Medicina DNA) prestou assistência fotografia e figura. Um agradecimento especial para o acesso facilitado ao ambiente do espaço de Tecnologia Programa 2010, a gravidade Escritório NASA reduzido, a adaptação humana e Contramedidas Division, NASA Glenn Research Center,ZIN Technologies, e do Programa de Pesquisa em Seres Humanos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Micro bomba de arSmart Products, Inc.AP-2P02APressão máxima = 6,76 psi; 1,301" x 0,394" x 0,650", 0,28 oz (8 g); disponível diretamente na Smart Products
Sensor de pressão diferencialHoneywell International, Inc.ASDX015D44RFaixa de  0-15 psi; 0,974" x 0,550" x 0,440", 0,09 oz (2,565 g); os fornecedores incluem Digi-Key e Mouser Electronics
Frasco de plástico rígido (tamanho pequeno)Loritz & Associados, Inc.55-05Poliestireno; ID 0,81" (20,6 mm), IH 2,06" (52,4 mm); disponível diretamente da LA Container Inc.; produto similar disponível na Dynalab Corp.
Luvas de Exame de LátexDynarex Corporation2337Dedo médio usado para diafragma de látex em frasco de fonte de fluido.  Outras marcas (e.g., Aurelia ®   Vibrante &comércio;) Aceitável.
Cola ópticaNorland ProductsNOA 88Adesivo de baixa desgaseificação; disponível diretamente da Norland; Também disponível na Edmund Optics Inc.
Válvulas solenóides de 3 viasA LEE CompanyLHDA0531115Hválvulas de gás, mas pode funcionar com líquido; 1.29" L, 0.28" D.  Produto descontinuado.  Produtos similares disponíveis na The LEE Company.
Medidor de vazão de água volumétricoOMEGA Engineering inc. FLR-1602AMedidor de vazão sem contato é fortemente preferido.  Recomendamos o sensor de fluxo de líquido OEM SENSIRION LG16 para vazões de nl/min até 5 ml/min.
PCD-mini detector de fótons SenslPCDMini-00100Para detecção de fluorescência; disponível diretamente da Sensl
AccelerometerCrossbow Technology, Inc.CXL02LF3detecção de força de 3 dimensões.  Fornecido à DMI pela NASA. Produto similar disponível na Vernier Software & Tecnologia, LLC. 
EstereomicroscópioAmScopeSE305R-AZ-E
CCD CameraThorlabsDCU223CResolução de 1.024 x 768, Cor, USB 2.0; disponível diretamente da Thorlabs
USB e Cabo de disparo (In/Out) para câmera CCDThorlabsCAB-DCU-T1Disponível diretamente da tubulação
MicroboreSaint-Gobain CorporationAAD04103Tygon®; ID 0,02", OD 0,06", 500 pés, 0,02" parede. Fornecedores: VWR, Thermo Fisher Scientific Inc.
Pinos de aço ocosNew England Small Tube(Custom)0.025" OD, 0.017" ID, 0.500" L, tubo de aço inoxidável, tipo 304, cortado, rebarbado, passivado; permitir conexões de tubulação microbore, conexões de tubulação de cavacos
Grampo deslizanteWorld Precision Instruments, Inc.14042Disponível diretamente da World Precision Instruments
Peças adaptadoras de LeurWorld Precision Instruments, Inc.14011Disponível diretamente da World Precision Instruments
Bolacha de silícioAddison Engineering, Inc.6" de diâmetro; para fabricação de moldes SU-8
Agente de cura de elastômero Polidimetilsiloxano (PDMS)Dow Corning3097358-1004Fornecedor: Global Industrial SLP, LLC
Agulha (23 gauge), ponta chanfradaTerumo Medical CorporationNN-2338RParede ultra fina; 23 G x 1.5"; 22 G também utilizável; fornecedores: Careforde, Inc.,  Agulha
de dispensação médica Port City (calibre 23), ponta rombaCML Supply901-23-10023 G x 1";   disponível na CML
Supply Cover glassThermo Fisher Scientific, Inc.12-518-105EGold Seal™ vidro borossilicato não corrosivo; para tampa de chip PDMS; 24 x 60 mm; disponível na Thermo Fisher Scientific, Inc.
Bomba de vácuoMountainMTN8407Para desgaseificação PDMS; fornecedor:  Ryder System, Inc. 
Câmara de vácuoThermo Fisher Scientific, Inc.5311-0250Nalgene™ Policarbonato transparente; disponível na Thermo Fisher Scientific, Inc.
Limpador de plasmaHarrick PlasmaPDC-32G
Lupa de mãoMitutoyo183-131Use na direção inversa para permitir a visualização em ~15".
EtanolCAROLINA861283Para limpeza de cavacos. Diluir a 70% usando água milipore.
Sistema de purificação de águaThermo Fisher Scientific, Inc.D11901Disponível diretamente da Thermo Fisher Scientific, Inc.
Montagens de translação optomecânicaThorlabsK6X6-Axis Kinematic Optic Mount; produto descontinuado; novo produto (K6XS) disponível diretamente do laptop Thorlabs
Hewlett-PackardVP209AVHP Pavilion Laptop executando a
(com mola)National Products, INC.RAM-234-3 RAM Tough-Tray™. Pode acomodar laptops de 10 a 16 polegadas de largura.
Divisor USBConnectland Technology Limited3401167
Cartões de aquisição de dados USB (8 entradas analógicas, 12 E/S digitais)National InstrumentsNI USB-600812 bits, 10 kS/s Cartões de aquisição de dados USB multifuncionais de baixo custo
(16 entradas analógicas, 32 E/S digitais)National InstrumentsNI USB-621616 bits, 400 kS/s Isolado Série M MIO DAQ, controle alimentado por barramento
/ Software de aquisiçãoNational InstrumentsLabVIEW 2009National Instruments (NI) codificado sob medida LabVIEW 
Software de Modelagem Sólida 3DDassault Systè mes SolidWorks Corp.SolidWorks 2011
AUTODESKAutoCAD LT 2008
Rack de equipamento vertical(fornecido pela NASA)N/A
Placa de ensaio óptica de alumínio sólidoThorlabsMB242424" x 24" x 1/2", 1/4"-20 Torneiras; disponível diretamente do
aço e endurecedor de grau industrialThe J-B Weld CompanyCola Epóxi Reforçada com Aço J-B Weld
Micro-hematócrito capilarFisher Scientific22-362-574interno 1,1 a 1,2 mm
seringas de 1 mlHenke-Sass, Wolf4010.200V0NORM-JECT®; fornecedor: Grainger, Inc.
Pesquisa InovadoraGlóbulos Vermelhos HumanosIPLA-WB3Testado e considerado negativo pelo fornecedor para: HBsAg, HCV, HIV-1, HIV-2, HIV-1Ag ou HIV 1-NAT, ALT e sífilis por Métodos Aprovados pela FDA. Como nenhum método de teste pode garantir com 100% de certeza a ausência de um agente infeccioso, os produtos derivados de humanos devem ser manuseados conforme sugerido no Manual do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA sobre BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIOS MICROBIOLÓGICOS E BIOMÉDICOS, PARA AMOSTRAS DE SORO HUMANO OU SANGUE HUMANO POTENCIALMENTE INFECCIOSAS
Concentrado de solução salina tamponada com fosfatoP5493SIGMA10x; diluído para 1x
TweenP9416SIGMATWEEN® 20
CentrífugasLW ScientificSTRAIGHT8-5KSwing-Out 8-place Centrifuge.  Disponível através de revendedores autorizados.  Outras centrífugas disponíveis diretamente da LW Scientific.
Gravador de vídeo HDSonyMHS-CM5
Mancha de ácido nucleico fluorescente laranjaInvitrogenS-11364SYTO® 83 Mancha de ácido nucleico fluorescente laranja.  Armazenado em solvente DMSO. Sempre use equipamento de proteção individual recomendado. Não é necessário aconselhamento especial sobre manuseio
.
Contas de contagem fluorescentesInvitrogenMP 36950CountBright™ Contas de Contagem Absoluta.  Sempre use equipamento de proteção individual recomendado. Não é necessário nenhum conselho especial de manuseio.
da Thorlabs bandeja para laptop Windows 7 Software de Modelagem 2D Thorlabs diâmetro de

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