Gravações simultâneas de longo prazo em dois estágios de processamento neuronal em comportar abelhas

Summary

Gravações de longo prazo simultâneos extracelulares de duas neuropiles cerebrais diferentes ou dois setores anatômicas diferentes foram estabelecidos em abelhas. Essas gravações permitem a investigação de aspectos temporais de processamento neuronal em diferentes áreas do cérebro, no único neurônio, bem como a nível conjunto em um animal se comportar.

Abstract

Em ambos os mamíferos e insetos informação neuronal é processada em diferentes centros de ordem superior e inferior do cérebro. Estes centros são acoplados via convergentes e divergentes conexões anatômicas incluindo alimentação para frente e fiação feedback. Além disso, a informação da mesma origem é parcialmente enviado através de vias paralelas ao diferente e, por vezes, nas mesmas áreas do cérebro. Para compreender os benefícios evolutivos, bem como as vantagens computacionais dessas estratégias de fiação e, especialmente, as suas dependências temporais à outra, é necessário ter acesso simultâneo a neurónios individuais de diferentes extensões ou neuropiles na mesma preparação a alta resolução temporal. Aqui nós nos concentramos em abelhas, demonstrando um acesso exclusivo extracelular longo prazo para gravar a atividade da unidade de multi em dois neuropiles seguintes ^1, o lobo antenal (AL), o primeiro estágio de processamento olfativo eo corpo de cogumelos (MB), uma ordem superior centro de integração involved na aprendizagem e na formação da memória, ou dois setores neuronais paralelos ² ligam a AL com a MB. O último foi escolhido como um exemplo, e será descrita em pormenor. No vídeo apoiando a construção e inserção permanente de eletrodos de fio multicanal flexíveis é demonstrada. Amplificação diferencial Pairwise dos canais de eléctrodos de fio de micro reduz drasticamente o ruído e verifica-se que a fonte do sinal está intimamente relacionada com a posição da ponta do eléctrodo. A flexibilidade mecânica dos eletrodos de fio utilizados permite gravações estáveis ​​invasivas a longo prazo ao longo de muitas horas, até dias, o que é uma clara vantagem em relação às técnicas extra e intracelulares em convencionais de gravação in vivo.

Introduction

As abelhas, assim como a maioria dos outros insetos dependem fortemente de olfato. Entre outros que utilizam sinais olfativos para a orientação, o acasalamento, a comunicação com membros da mesma espécie, e forrageamento. Seu sistema olfativo bem elaborado contribui para um rico repertório de comportamentos de aprendizagem relacionados a estímulos odor florais. Esses comportamentos podem ser facilmente estudados sob condições controladas de laboratório (para revisão ver ^3-5). Seus cérebros "mini" (cf. ⁶⁾ com seus números relativamente pequenos de neurônios faz a abelha um organismo modelo adequado para o estudo de codificação olfativo e aprender durante o monitoramento da atividade neural.

O sistema olfactivo em insectos, bem como em mamíferos mostra organização semelhante a uma grande extensão (para revisão ver ^7,8). Em abelhas cerca de 80.000 neurônios receptores situados em ⁹ sensilas ao longo da antenas ^10,11 traduzir o estímulo odor ambiental em um neursinal onal. Axónios de neurónios dos receptores olfactivos inervam o lobo antenal (AL), o qual tem uma organização glomerular comparável ao bolbo olfactivo de vertebrados. A AL compreende cerca de 164 glomérulos interligados uns com os outros por cerca de 4.000 interneurônios locais (LN) (para revisão ver ^12). Especialmente no abelha foi recentemente mostrado que LNs fornecer conectividade laterais parciais e que possuem propriedades diferentes subpopulações de codificação olfactivos elementares e configural ^13,14. A AL foi mostrado para ser subdividida em um lóbulo ventral e uma hemi dorsal dando origem ao medial eo trato lobo antenal lateral (m-e l-ALT; anteriormente denominada m-e l-APT para laterais protocerebrais lobo antenal-medial e trato ^15-17). Aqui uma nova terminologia trato introduzido por um esforço recente para uma nomenclatura unificada do inseto cérebro será utilizado ^18. Ambos ALTs (l-e m-ALT) combinam ou 410 (l-ALT) ou 510 (m-ALT) proje uniglomerularneurônios ction (PN), respectivamente ^15,16,19. PNs de ambas as áreas foram recentemente mostrado aos odores de código em paralelo ² (para revisão ver ^17,20), e ambos os trechos sinapticamente formar conexões divergentes com células de Kenyon (KC), o corpo de cogumelos (MB) principais neurônios. Cada MB contém cerca de 172.000 KCs ^21-23. Os MBs são conhecidos por estar envolvido na integração de estímulo, aprendizado e formação da memória. As dendrites axo de KCs formar o pedúnculo (haste do cogumelo), que tem duas regiões de produção principais: a vertica ou alfa-lobo ea horizontal ou beta-lobo ^22,24. A saída do MB converge para apenas cerca de 400 neurónios extrínsecos (PT) ^24. Ens responsável pelo processamento de informação olfativa inervam principalmente o aspecto ventral do lobo verticais ^22. Recentemente, tem sido mostrado que a ENS gravados nesta área codificar a associação odor recompensa ^25.

Temporal comoaspectos dentro do sistema olfactivo dos insectos, bem como vertebrados tornaram-se um aspecto importante e significativo como um princípio de codificação potencial ^26-29. Para ser capaz de gravar simultaneamente vários neurônios a partir de diferentes locais em alta resolução temporal, estabelecemos as técnicas de gravação da unidade de multi duplas utilizando eletrodos de fio multicanais personalizadas introduzidas para diferentes regiões-alvo no sistema olfativo da abelha. Essa abordagem nos permite analisar e comparar o processamento temporal no sistema olfativo das abelhas no nível dos neurônios individuais e populações de neurônios ou entre caminhos olfativos paralelas, o caminho olfativo dupla ² ou entre diferentes neuropils seguintes ^1. Recentemente, com uma abordagem experimental semelhante no sistema olfativo gafanhoto ³⁰ utilizando uma configuração diferente de eletrodos foram capazes de analisar mecanismo de codificação espaço-temporal para o reconhecimento de odores fundo invariante ^31. Thnós, as gravações duplas estabelecidos permitem a coleta de informações espaciais sobre perfis de actividade neuronal simultâneos.

Em comparação com a amostragem espacial mais amplo por meio de imagem de cálcio este método permite a gravação de apenas dois pontos. No entanto, a vantagem em comparação com técnicas de imagem de cálcio é a alta precisão temporal de ação possíveis gravações, as quais não podem ser fornecidos por qualquer imagem CCD convencional ou aquisição de imagens 2-fótons. Os eletrodos extracelulares aqui descritas são permanentemente implantados e fixa em relação ao cérebro e cápsula cabeça evitando eletrodo deriva. Isto é uma clara vantagem em comparação com a utilização de eléctrodos intracelulares afiadas. Outra vantagem em relação a gravações intracelulares e de imagem de cálcio é o tempo de observação neural estendida variando de muitas horas até dias. Este é um pré-requisito importante para investigar correlatos neurais da formação de aprendizagem e memória. Os benefícios adicionais de váriosgravações de unidade são ainda descritas na seção de discussão.

Nesta visão metodológica do processo de eletrodos de fio de design personalizado fabricação será mostrado, adaptado de ^32,33 e adequado para gravações de unidades múltiplas a longo prazo no cérebro das abelhas. Além disso, um exemplo de como estes tipos de eléctrodos são permanentemente implantado em dois sítios diferentes de gravação no sistema olfactivo abelha para gravar, simultaneamente, a l-e o m-ALT durante longos períodos de tempo, para permitir que muitos protocolos de estimulação é mostrado ^2. Para a verificação das posições de gravação é fornecido um exemplo e um protocolo para a coloração e gravação pós visualização dos locais de gravação.

Protocol

1. Eléctrodo de edifício (Figura 1)

1. Produção de um adaptador de eletrodo que se encaixa a placa de interface eletrodo de comercial de vários sistemas de amplificadores de canal ^1,2,25.
   1. Use uma pequena placa de acrílico colado a uma base de conector de 18 pinos.
   2. Ligue a base com três pequenos pedaços de fio isolado a 3 terminais de solda separados parafusados ​​na placa de acrílico (Figura 1 A1-A3).
   3. Insira uma ranhura na placa de plexiglas em que um capilar de vidro, pode facilmente mover-se e ser mantido no lugar por um parafuso (Figura 1 B1).
   4. Estender o capilar de vidro de cerca de 5 mm, utilizando um pino minutien.
   5. Prenda os fios micro eletrodo ao longo do pino minutien eo capilar de vidro para assegurar a estabilização e apoio.
2. Produção micro fio Multi-canal (adotado de Ryuichy Okada ^32,33)
   1. Span 3 micro fios (poliuretano revestido fio de cobre, 15diâmetro mM) de uma maneira que estes sejam colocados ao lado do outro (Figura 1 B2).
   2. Use uma agulha de solda 12 V para espalhar uma fina camada de cera de baixa fusão dental (50 ° C), parcialmente ao longo dos fios para colá-los juntos (ponta do eletrodo) (Figura 1 B3). Deixe alguns centímetros descolado (final) como eletrodo nesta seção será usada mais tarde para ligar o micro fios com o adaptador de eletrodo.
3. Conecte o canal micro fio de multi ao adaptador de eletrodo
   1. Retire o capilar de vidro do suporte e anexá-lo com o pino minutien para a ponta do eletrodo. Traga-o em uma posição paralela ao micro-eletrodo (Figura 1 B3).
   2. Cole a ponta do eletrodo para o pino minutien utilizando baixa temperatura de fusão de cera dental e cortar o micro eletrodo na ponta, projetando-se 2-3 cm do pino minutien e no final do eletrodo (pequenas setas Figura 1 B3).
   3. Deslize o sl capilarightly volta para o adaptador de eletrodo. Use o parafuso para corrigi-lo (Figura 1 B4).
   4. Soldar as pontas soltas dos três fios para as saliências de soldadura, utilizando uma pistola de solda com uma temperatura de cerca de 360 ° C para garantir a fusão do isolamento (Figura 1 B4). Depois de soldar, garantir que haja contato elétrico adequado (~ 300 kOhm).
   5. Montar um dos eletrodos (master) para a placa de interface eletrodo do headstage e corrigir o outro eletrodo multicanal (escravo) em um adaptador separado. Ligue os canais do escravo para o mestre eletrodo (Figura 1 C1). Além disso, a solda de referência, bem como eléctrodos musculares à base de eléctrodo principal (Figura 1 C2).

2. Abelha Preparação (Figura 2)

Nestas experiências descritas, as abelhas (Apis mellifera), que é um animal invertebradoe, portanto, não requerem licenças éticas específicas para o uso, é usado.

1. Pegar forrageiras de abelhas (A. mellifera) na entrada colméia de manhã, como mostrado por outros ^34,35.
2. Refrigerar as abelhas em gelo triturado até a imobilização (5 a 10 min) e fixar um num suporte de plexiglas padrão ou tubo metálico de forma a que a cabeça é exposta (Figura 2 A). Para minimizar os movimentos da cabeça usar cera dental de baixa fusão (~ 50 ° C) e fixe a cabeça cuidadosamente para o titular em torno da base dos olhos compostos e do pescoço.
3. Use cera de baixa fusão para fixar a SCAPI das antenas na cápsula cabeça (Figura 2 B), sem tocar o flagelo. O flagelo da antena deve ser apontada para a frente. Certifique-se de que a abelha pode se mover livremente sua tromba.
4. Raspar a cabeça da cápsula para assegurar uma visão sem perturbações e de acesso ao topo da cabeça.
5. Alimente a abelha com uma solução de sacarose 30% até saturatipara assegurar a humidif icação suficiente de tecido de cérebro e de boa viabilidade do animal (Figura 2 C).
6. Faça incisões cuidadosas verticalmente ao longo das fronteiras dos olhos compostos e horizontalmente acima das bases de antena, bem como sob o ocelos e remover a peça solta de cutícula (Figura 2 D).
7. Definir cuidadosamente de lado glândulas hipofaringe e remover a traquéia para garantir uma visão clara e acesso ao cérebro antes do eletrodo de inserção (Figuras 2E, 2F).

3. Eletrodo de Inclusão

No caso de exemplo ilustrado na Figura 2, um eléctrodo é posicionado com o objectivo de a l-ALT, a outra com vista na m-ALT ^2. Usando marcos particulares, outras regiões-alvo são possíveis, bem como, por exemplo, as regiões de saída AL e MB ^1.

1. Posicione os eletrodos usando micromanipuladores na região de interesse ( Figura 2G e 3A). Para direcionar o lugar m-ALT o eletrodo entre a AL e medial do lobo vertical da MB. Verifique se o local de inserção estar acima do ponto de ramificação das PNs ALT mediolaterais. Sobressair o eléctrodo no cérebro, com uma profundidade de cerca de 180 mM (Figura 2E). Para l-ALT PN lugar gravação do eletrodo abaixo protocérebro lateral (LH) no meio de uma linha imaginária entre a face lateral do lobo vertical e no meio da AL. Inserir o eléctrodo com uma profundidade de cerca de 300 mm (Figura 2E)
2. Insira a referência (fio de prata, cerca de 25 um de diâmetro) dentro do olho composto ipsilateral através de um pequeno corte na cutícula. Insira um outro fio de prata na região de projeção muscular abaixo do ocelos lateral. NOTA: Se necessário, o comportamento de aprendizagem de abelha pode ser monitorizada com grande precisão temporal, gravando o músculo M17, o qual está envolvido in a resposta da extensão da probóscide (PER) da abelha ^36, conforme descrito no ^25.
3. Para ancorar firmemente os eléctrodos dentro do cérebro e a cápsula de cabeça, cobrir todo o espaço acima do cérebro com dois silício componente (Figura 2H), que irá evitar o cérebro de secar. NOTA: as gravações pode durar horas até dias, e as abelhas podem por exemplo ser registada durante um procedimento de condicionamento clássico (Figura 2H) ou estimuladas com um grande painel de odores diferentes.

4. Aquisição de dados e pré-processamento

1. Use um software de aquisição adequada que atenda aos seguintes requisitos: taxa de amostragem de 25 kHz min; analógico ou digital ^{1,25 2} diferenciação cruzada entre os canais de eletrodos; banda passar filtro de 300 Hz a 8.000 Hz para extrair eventos de pico.
2. Use um software de pico de classificação disponível para extrair atividade única unidade, por exemplo templcomeu técnicas correspondentes como incluído no software Spike2 (Figura 3).
3. Para uma análise mais aprofundada usar os selos de tempo das unidades extraídas para calcular única unidade média de respostas de odor (Figura 4) ou para calcular vetores população para Análise de Componentes Principais (PCA) (Figura 5) através de software disponível comercialmente. Para analisar melhor unidade única e latência de resposta da população por favor comparar publicações recentes ^1,2,25.

5. Visualização de Posição Relativa do eletrodo (Figura 4)

1. Mergulhar as pontas dos eléctrodos numa solução de 5% ou Alexa hidrazida 568 ou 5% hidrazida Alexa 488, que é dissolvido em solução de cloreto de potássio 0,5 M antes de os experimentos de gravação.
2. Remova os eletrodos eo silício cobertura cuidadosamente após os experimentos, lavar o cérebro com solução abelha Ringer, remover glândulas e traquéia e inserir minúsculos cristais de tetramethylrhodamin dextrano ou inserir uma solução a 5% dissolvido em 1,0 M de acetato de potássio em AL para etiquetar as ATLs anterógrada. Execute as seguintes etapas na escuridão.
3. Permitir que o corante a ser feita e transportado pelos neurónios de projecção ao longo das suas extensões axonais (30-45 min) (Figura 4A), antes da lavagem do cérebro com solução de Ringer de abelha três vezes por outro 30-45 min.
4. Refrigere a abelha em gelo até a imobilização e remova cuidadosamente o cérebro da cápsula cabeça. Fixar o cérebro, por lavagem com uma solução de 0,1 M de PBS contendo 4% de formaldeído e mantê-lo durante a noite a 4 ° C.
5. Espere pelo menos 12 horas antes de lavar o cérebro duas vezes em 0,1 M PBS (10 min cada).
6. Lavar 3x cérebro durante 20 min em 0,2% de Triton X-100 diluído em 0,1 M de PBS antes da desidratação através de uma série ascendente de álcool (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3 x 100% de etanol, 20 min cada etapa).
7. Incorporar o cérebro desidratado em methylsalicylate numa lâmina de microscópio e seal-lo com uma lâmina de cobertura.
8. Use um microscópio de varredura confocal a laser e escanear o cérebro como secções ópticas cada 2-5 mM usando um Composto Harmonic objetivo Plano Apochromat (10X 0,4 NA imersão). Excite o tecido usando comprimento de onda 568 nm para tetramethylrhodamin dextrano e um comprimento de onda de 488 nm para a posição do eletrodo.
9. Reconstrua as estruturas cerebrais manchadas e caminhos eletrodo do pilhas de imagens em 3D com o software de reconstrução (eg. AMIRA ou Fiji) (Figura 4).

Results

"O presente protocolo permite gravações simultâneas em dois estágios de processamento diferentes dentro abelhas individuais e, adicionalmente, permite testar mecanismos subjacentes de aprendizagem e memória através, por exemplo., PER condicionado dentro de abelhas contido." Este é um pré-requisito para a análise de aspectos temporais do processamento neuronal. O método é facilmente adaptável para diferentes abordagens científicas para desvendar a rede neuronal do sistema olfativo da abelha. Por exemplo, este método é usado (i) para analisar o processamento temporal de PNs, dentro da via olfactiva dupla de abelhas, a l-e m-ALT PNs (Figura 5). Na Figura 5A um exemplo de uma PN l-ALT simultaneamente gravadas com um PN do m-ALT é dada como média de dez experimental e ilustra a sua força e a resposta de latência em relação a cinco concentrações diferentes de odor como cor codificada calor trama. Em uma média de sete abelhas com 11 l-e 13 mALT PNs (Figuras 5B, 5C) ilustra que tanto a força da resposta, assim como latência de resposta, em certa medida, reflecte a concentração odorante. Assim PNs neste exemplo aumentar a sua força enquanto resposta com o aumento da concentração odorante sua latência de resposta diminuiu (Figuras 5B, 5C). Este resultado é bastante limitado e só é válida para o odorante analisados, mas ainda assim é consistente com modelos computacionais recentes da AL ^37. Se codificação concentração de odor na AL da abelha está subjacente cálculos não lineares ou subjaz outras propriedades de codificação ainda precisa ser analisada no futuro. Além disso, o método pode ser utilizado (ii) comparar aspectos temporais na actividade população em duas fases de processamento subsequentes, o AL-MB-e de saída (Figura 6). Análise de componentes principais (PCA) ilustra que odor computação é prolongada e durar toda a apresentação odor no nível PN enquanto que no PTs apenas o odor dentro e fora do set foram representados na atividade da população (Figura 6). Assim, a população PT chegou a sua atividade máxima já em um ponto de tempo em que a atividade PN ainda está em desenvolvimento (cf. Filme 1).

.. Figura 1 fabricação de eletrodos micro-fio de três canais A1) As terminações de três fios são soldados a um conector de pino IC em posições 11, 13 e 16 A2) Quatro terminais de solda são parafusados ​​em uma chapa de base de plástico acrílico.; um pino minutien é inserido na ponta de um capilar de vidro, o qual é então ligado à placa de plástico. A3) A placa de plástico é colada no topo de um pino de ligação IC e a extremidade livre de cada fio é soldado a uma parte superior de solda lugs. B1) Para equipar o porta-eletrodo com os fios de cobre finos, o capilar deve ser levado para fora mais uma vez. B2) A base do suporte é então fixado em uma custom made ​​dispositivo alinhando. Três cobre micro fios estão alinhados ao longo do sulco e fixados com fita adesiva em cada extremidade B3) Os micro fios paralelos são coladas com cera dental e do capilar é colocado de volta no lugar (setas longas).; os micro fios colados são então anexado ao capilar com cera dental e suas extremidades são cortadas (setas curtas). B4) As três pontas soltas dos fios de cobre são soldadas aos três terminais de solda de topo trazendo-as em contato elétrico com a pinos de IC. C1) dois eléctrodos podem ser montados integralmente ligados um ao outro para utilização com um único andar de entrada. C2) Para este efeito, os pinos de um eléctrodo (esquerda, escravo) são ligados através de fios isolados para o outro eléctrodo (direita mastroer), que está ligada à fase de cabeça; o eletrodo conectado headstage também pode coletar a entrada de um músculo (M17) e eletrodo de referência (Ref).

Figura 2. Preparação e inserção de eléctrodo permanente no cérebro abelha. A) Uma abelha é inserido num suporte de plexiglas, após imobilização sobre gelo. Antenas com Flagelo (FL) e do uso de hastes (SC) são indicados. B) A cabeça e as antenas são fixadas com cera dental. C) A cápsula cabeça é raspada ea abelha é alimentado com água açucarada. D) A cápsula cabeça está aberta. E) Após a remoção das glândulas da traqueia e da parte superior do cérebro, as diferentes neuropiles e principais referências podem ser facilmente distinguidos. As trajetórias dos ALTs são indicados juntamente comuma marca onde os eletrodos são inseridos. (MB: corpo Mushroom, AL: lobo antenal, OL: lobo óptico, α: Alpha lobo ou lóbulo vertical, ALT: trato lobo antenal, E1: lado a inserção do eletrodo para gravações de m-ALT, E2: lado a inserção do eletrodo para l-ALT gravações). F) de referência (Ref.) e os eléctrodos musculares (M17) são inseridos no interior da cápsula através da cabeça pequenos buracos na cutícula ou o olho composto. G) Os eléctrodos de arame são inseridos no cérebro nos locais apropriados. H) Após fixação dos eletrodos no lugar usando dois componente de silício, a abelha ainda mostra PER e pode ser condicionada (por exemplo., usando água com açúcar).

Figura 3. Extracelular gravação em dois tratos neurais e extração de unidade única (pico de classificação). A B) gravações simultâneas a partir da l-e m-ALT PNs (verde e traços roxos) mostrando respostas excitatórias de ambos os folhetos para a estimulação de 500 ms odor de mel em solução de água com uma concentração de 1:100 a 33 ° C. Cada linha traçada representa os canais diferenciados como etiqueta com código de cores dos terminais de solda de eletrodos em A. Bar:. 50 mV C) Após os procedimentos de classificação de pico potenciais de ação individuais são ordenados e codificados por cores. Sobreposição das unidades classificadas ilustra a separação das formas de onda. D) Pico intervalo do histograma indica a qualidade de separação das unidades classificadas como prova de triagem pico adequado. Observe que não há aumento no período refratário da unidade. E) Dois pontos de vista (E1, E2) deum agrupamento 3D da unidade classificada com análise de componente principal, que indica a distância das unidades ordenados uns aos outros. Círculos indicam a 2,5 vezes a distância Mahalanobis que lembra o SD no espaço e indica uma diferenciação significativa dos clusters no espaço principal componente F) unidades de código de cores representam os potenciais de ação visíveis em uma ampliação de três canais de uma gravação trato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Visualização pós-gravação e 3D-reconstrução da posição de gravação. A) vista Projeção de orto-fatias ao longo dos eixos z com alinhamento intensidade máxima de um anteroe aterro retrógrada dos neurônios de projeção uniglomerular projetam da AL para a MB e LH. O marcador intracelular Microruby (tetramethylrhodamin dextrano) foi inserido na AL após as experiências de gravação. Glomérulos manchados dentro da visão de Projeção AL prova coloração PN adequada. B) de fatias de orto ao longo dos eixos z com alinhamento intensidade máxima de uma coloração dos dois eletrodos com Alexa hidrazida 488 indicando a colocação do eletrodo para o m-ALT (E1, seta ) e l-ALT (E2, seta). O traçador Alexa 488 Hidrazida migra para o tecido circundante e eléctrodo cora o sítio de inserção do eléctrodo. Nota, a coloração proeminente na AL é um artefacto superficial. C) 3D reconstruções das células alvo coradas (PNS) e o local de inserção de eléctrodo de A, B (lado direito), em conjunto com uma vista geral esquemática do sistema olfactivo abelha (esquerda lado), com a indicação do l-e m-ALT trajetórias. Note-se, apenas uniglomertratos ular PN são mostrados. AN: nervo antenal, AL: lobo antenal, LH: corno lateral, MB: corpo de cogumelo, E1, E2: locais de inserção de eletrodos, m-ALT: medial trato lobo antenal, l-ALT: lateral, trato lobo antenal, c: caudal, r: rostral, m: medial, l:. lateral, por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Exemplo de odor codificação concentração na via olfatória. Dupla A) parcelas de calor ilustrar a resposta de um único l-ALT (verde) e único m-ALT PN (roxo) adquiridos em simultâneo a partir de uma abelha individual na resposta à odorante hexanal em concentrações crescentes de odor (a partir de 1: 10 ^-6 a 1:100). Cada linha corresponde a uma média de dez ensaios STIMlação. A taxa de disparo é mostrado como a mudança de intensidade relativa, que é a taxa de disparo em relação à actividade espontânea subtraídos. B) População de latência de resposta de 11 e 13 de l-m-ALT PNs de 7 abelhas gravados. Em cada abelha as PNs de ambos os folhetos foram gravados simultaneamente. A latência de resposta da população mostra uma latência diminuindo com o aumento da concentração de odor em PNs de ambos os folhetos. O aparecimento de odores em resposta a antenas de 99 ms foi gravada através eletroantenografia e é subtraído as latências de resposta PN. Note-se que nas concentrações mais baixas respostas são demasiado fracos para medidas de latência e, portanto, foram excluídos resposta C) População. Taxa de disparo de PNs mesmos como em B. Com o aumento da concentração de odor a força de resposta está aumentando. A l-ALT mostra a força da resposta mais forte. No B, C a média e SD são dadas.

Figura 6. Comparando atividade população em duas etapas de processamento subsequentes ao longo caminho olfativo da abelha. Os dados foram registrados em 20 animais que foram estimuladas com 1-hexanol e 2-octanona. A) Cada linha representa a cor falsa codificado taxa de disparo média de uma projeção neurônio (PN), calculado através de 10 repetições de odor de 1-hexanol. Odor apresentação inicia no tempo 0 e durou três segundos. B) mostra o mesmo que em A), mas para o corpo cogumelo neurônios extrínsecos (PT). A matriz mostrado em A) pode ser visto como um vector população PN durante a estimulação de odor com 1-hexanol. Calculou-se o mesmo tipo de vetor população durante a estimulação odor com 2-octanona e usou as duas vetores em uma análise de componentes principais (PCA) mantendo temporal dimensão. C) Os três primeiros componentes principais (PC1, 2 e 3) foramplotada contra o outro para ilustrar a separação de odor na atividade do conjunto no PN saída do lobo antenal. O tempo antes do início do odor é marcado em preto. Atividade durante três segundos de estimulação com 1-hexanol é mostrado em azul. A atividade durante a estimulação com 2-octanol é mostrado em vermelho. Além disso, mostramos 1,5 segundos (pós) da atividade após odor de um conjunto de 1-hexanol (azul-claro) e 2-octanonen (rosa). Note-se que, a nível conjunto PN, ambos os odores evocando trajetórias muito distintas se estabelecer em um "ponto fixo", que sobrevive a todo período de estimulação odor. Somente após compensar odor as trajetórias voltar para a atividade de base sem estimulação odor. D) A mesma análise foi feita no nível do conjunto PT representando a atividade na saída do corpo de cogumelo. Em comparação com a actividade PN odores evocar uma trajectória menos distintas. Além disso, um "ponto fixo" não é observável. As trajetórias inicialmente odor induzidas intermingle com a actividade da linha de base, embora o odor ainda presente. Apenas o deslocamento odor evocou uma trajetória adicional.

. Filme 1 Hora resolvido avaliação de uma trajetória odor induzida após análise de componentes principais de um vetor PN-população (esquerda) e um vetor de população PT. (direita;. cp Figura 6) As partes superiores incluem os três primeiros componentes principais (PC1, 2 e 3) plotada contra o outro. Os painéis inferiores mostram a avaliação de PC1, 2 e 3 ao longo do tempo. Estimulação odor é marcada pela barra cinzenta. Todos os painéis foram sincronizadas. Note-se que a actividade de PT população começa um pouco antes de a actividade população PN, um fenómeno que parece ser contraintuitive mas pode ser explicado pela ligação e as propriedades das camadas envolvidas, o qual é discutido anteriormente ^1.

Discussion

Este artigo demonstra a produção e uso de design personalizado canal micro fio-eletrodos múltiplos. Os eletrodos descritos são adequados para gravação tanto única unidade e da população, que é especialmente útil para medidas de latência e outras propriedades de resposta temporal de diferentes neurônios e diferentes neuropils dentro de um único espécime (para detalhes, ver ^1,2,25). Além disso, temos mostrado como implementar permanentemente os eletrodos micro fio para permitir gravações estáveis ​​a longo prazo no comportamento das abelhas que duram horas até dias.

Gravações multi-unit extracelulares se tornou uma ferramenta favorável para atingir alta resolução temporal combinado com informação espacial. No nosso caso, estes são ou extensões neuronais paralelos ² ou dois neuropils diferentes ^1. Vários neurônios podem ser gravados e analisados ​​ao nível do neurônio único em paralelo e em alta resolução temporal. Registro Multi-unitmentos foram aplicados pela primeira vez em ³⁸ de mamíferos e mais tarde também em insetos ^39-41. Um progresso substancial foi alcançado com o desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas de gravação extracelulares multicanal ^42,43. Este, por exemplo, inclui o desenvolvimento de novos eletrodos ⁴⁴ ou novos pico de classificação e agrupamento algoritmos ^45. Métodos gerais de técnicas extracelulares de gravação multi-unidades estão bem descritas ^46-48. Os eletrodos auto construído mostrados neste vídeo também pode ser adaptado adicionando mais microfios por eletrodo ou os micro fios pode ser torcido para ganhar distâncias constantes mensuráveis ​​entre as pontas. Ambos os procedimentos que, no entanto, levar a diminuição da flexibilidade e aumento da espessura do eletrodo.

Em comparação com sondas de silício normalmente usados ​​para gravações extracelular em insetos muito maiores, como o falcão traça, gafanhotos e baratas ^{40,49 - 51} micro fio-eletrodos descritos são menores, flexível e pode lidar facilmente com os movimentos potenciais do cérebro e, portanto, pode ser usado de forma confiável em pequenos insetos sociais, como abelhas e formigas que mostram um repertório comportamental muito mais amplo. A maioria das sondas de silicone têm haste afiada como estruturas de corte axônios e tecido neural ao longo de seu canal de inserção, enquanto as micro fios descritos são redondos, flexível e menor e, portanto, são menos prejudiciais para os tecidos circundantes, que é uma clara vantagem se o objetivo é estudar a longo plasticidade prazo de um animal intacto e de se comportar. Outra vantagem de eletrodos micro fio é o seu baixo custo de produção eo fácil manuseio. Em vez de limpar cuidadosamente uma sonda de silicone caro os fios de eletrodos são recém-cortada antes da inserção do cérebro e, portanto, os problemas de falta de congestionamento. Além disso, é possível utilizar mais do que um eléctrodo de fio de micro na mesma preparação, quer inserido em diferentes neuropiles ¹ oextensões de r ² como mostramos aqui. Esta abordagem é especialmente favorável para analisar e comparar aspectos temporais como latências de resposta e interações em diferentes níveis de processamento neural.

Estamos conscientes do fato de que um sinal gravado extracelular não reflete a atividade das células único per se. É sempre um composto de atividade tensão em torno da ponta do eletrodo. Para identificar a origem do sinal da diferença de dois canais de fios de micro vizinhos dentro de um eletrodo é sempre calculado. Assim, a fonte para os sinais de pico usados ​​para extrair atividade única unidade foram sempre muito próximo de um ou outro canal de eletrodos, resultando em formas de onda de pico facilmente distinguíveis. Os sinais de mais longe, tal como a actividade muscular ou actividade de neuropils vizinhos, atingir os dois eléctrodos, ao mesmo tempo evoca formas e amplitudes comparáveis ​​e será descartado por este procedimento. Usando a técnica de casamento de modelos de Spike2,estamos muito confiantes para obter atividade única unidade, o que não é o mesmo, mas muito perto de atividade do neurônio único. No entanto, a emissão de pico de triagem pode ser evitado pelo uso de técnicas de gravação intracelulares.

Gravações de células individuais com tanto eletrodos pontiagudos ou pipetas de patch permitir o conhecimento aprofundado sobre as propriedades fisiológicas de um único neurônio. No entanto, devido ao pequeno tamanho dos neurônios do inseto e suas neurites (por exemplo., Menos de 1 mm para abelhas PNs ⁵²⁾ gravações apenas de curto prazo são gerenciáveis. Além disso, as gravações intracelulares pode ser invasivo e pode prejudicar a célula que é, possivelmente, uma outra razão para as limitações temporais. In vivo gravações intracelulares em insetos raramente durar mais que uma hora. A janela de tempo que foi suficiente para o trabalho pioneiro de Martin Martelo ⁵³ que gravou intracelular a partir de um único neurônio identificado, o ventral não pareado maxilar neurônio # 1 (VUMmx1). Ele poderia ltinta sua atividade diretamente ao caminho da recompensa. Juliane Mauelshagen ⁵⁴ registrado intracelularmente a atividade de um cogumelo corpo extrínseco neurônio identificado, o pedúnculo neurônio extrínseca # 1 (PE1), durante o condicionamento clássico. O mesmo neurônio estava no foco de Menzel e Manz ⁵⁵ quando encontraram LTP após a estimulação elétrica de Kenyon Cells. No entanto, Okada e colegas ⁵⁶ pode usar o padrão spiking intracelularmente bem caracterizado (picos duplos e triplos) para a identificação do PE1 durante gravações extracelulares. Afinal uma combinação de ambos os métodos, as gravações intracelular de neurônios identificados e gravações extracelular a longo prazo pode ser uma ferramenta poderosa para futuras investigações.

No entanto, usando eletrodos afiadas para gravar várias células (unidades), simultaneamente, em diferentes níveis de processamento de mais de muitas horas até dias para analisar as suas relações temporais de resposta e / ou até mesmo mudanças de plástico ié quase impossível.

Com a primeira imagem de cálcio se aproxima na abelha ^57,58 utilizando corantes sensíveis ao cálcio da análise de padrões espaciais de respostas odor eram acessíveis ^59-62. No entanto, em muitos casos, os corantes sensíveis cálcio tem que ser introduzido no tecido cerebral através de manipulações invasivos que novamente limitam a vida útil do abelha e propriedades intrínsecas das células analisadas. Este problema é superado em outros organismos modelo, como a mosca da fruta através de sensores de cálcio geneticamente introduzidas ^63,64. No entanto, em geral, os sensores de cálcio pode introduzir outras limitações que podem actuar como tampões de cálcio que provavelmente influenciam as propriedades temporais de respostas de odor. Gravações intracelulares simultâneos combinados com imagens de cálcio ou de abordagens computacionais pode provar a resolução temporal adequada de imagem processa ^65,66. No entanto, a resolução temporal do processo de imagem em si é rather limitada. Sistemas de aquisição ópticos normalmente usam CCD-imagem com uma resolução temporal de ⁶⁷ Hz 5-20, embora 2-Photon-Imaging pode ser capaz de adquirir as sequências mais rápidas ^68. No entanto, o aumento da taxa de amostragem sempre vai junto com uma perda de resolução espacial. Além disso, os corantes sensíveis ao cálcio utilizados na abelha sofrer branqueamento, o que também reduz o tempo de aquisição ^69.

Em comparação com outras técnicas de gravação fisiológicas em insetos nossos eletrodos micro-fio multi-canal flexíveis garantir o acesso de longo prazo a única unidade e atividade neuronal população em comportar abelhas.

Nós demonstramos como usar dois desses eletrodos em diferentes estágios de processamento no mesmo animal, o que facilita a análise de aspectos de codificação temporais entre os diferentes locais de gravação. Dependendo do problema de pesquisa eo modelo de inseto o método básico de construção do eletrodo demonstrado aqui é facilmente estendercapaz e / ou pode ser adaptado. Por exemplo, é concebível utilizar mais do que as três fios simples para a produção de eléctrodos de multi-canal. Além disso, o número de locais de gravação pode ser estendido e observando aspectos temporais de mais de duas vias ou neuropils é viável. Nossa esperança é que este método irá inspirar muitos cientistas e contribuirá positivamente para a compreensão do processamento neuronal sofisticado em pequenos cérebros.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Óleo de parafina	Fluka	76235
Odors	Sigma Aldrich
PBS			pH 7,2
4% Formaldeído	ThermoScientific	28908	Livre de metanol
Triton X	BioChemica	A1388
Metilsalicilato	Roth	4529,1
Tetrametilrodamina dextrana, 10.000 MW (Microrubi)	Invitrogen	D7162	manter escuro
Alexa 488 hidrazida	Invitrogen	A-10436	manter escuro
Alexa 568 hidrazida	Invitrogen	A-10437	manter escuro
Solução de toque de abelha	ver Brill et al.2
Fio de cobre revestido de poliuretano	Elektrisola	15 µ m diâmetro & P155 isolamento
Cera Dental	Cera Dental Densply Detrey	64103015S1	ponto de fusão moderado
	Flexaponal	124-202-00	cera de baixo ponto de fusão KWIK
SIl	WPI	03L
18 Pin Socket	Conrad Electronic	189634-62
Cola para fusão a quente	Conrad Electronic	827673
de solda	Conrad Electronics	830283	12 V
lug	Conrad Electronic	531901
Glaselectrodes	WPI	1B100F-3
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	V2A 0.2 x 12 mm
Headstage comutável	Tucer Davis Technologies	SH16
Módulo de conexão de headstage	NPI	INT-03M
Módulo Amplificador	NPI	PDA-2F
Placas de Aquisição	de Dados National Instruments	NI-6123, Ni-6143
Software de Aquisição	National Instruments	Lab View 8.2	design personalizado
Spike-Sorting	CED	Spike 2 v7.11
Matlab	Mathworks	R2008B
Micromanipulador	Manual Leitz
AG-wires	WPI	AGT05100
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica	TCS SP2 AOBS
AMIRA	Mercury Computer Systems	05/02/2000