Artigo de método

Medir a função respiratória em ratos usando Unrestrained pletismografia de corpo inteiro

DOI:

10.3791/51755

⸱

12 de agosto de 2014

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1The Ritchie Centre, Monash Institute of Medical Research, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash Medical Centre, 3Animal Resource Centre, Perth, Australia, 4Wake Forest Institute for Regenerative Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A avaliação da fisiologia respiratória, tradicionalmente invocado técnicas, que exigem contenção ou sedação do animal. Unrestrained pletismografia de corpo inteiro, no entanto, fornece uma análise precisa, não-invasivo, quantitativo de fisiologia respiratória em modelos animais. Além disso, a técnica permite a avaliação repetida respiratório de ratos permitindo estudos longitudinais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A disfunção respiratória é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo e as taxas de mortalidade continuam a subir. A avaliação quantitativa da função pulmonar em modelos de roedores é uma ferramenta importante para o desenvolvimento de futuras terapias. Comumente utilizadas técnicas de avaliação da função respiratória, incluindo pletismografia invasivo e de oscilações forçadas. Embora essas técnicas fornecem informações valiosas, a coleta de dados pode ser repleta de artefatos e variabilidade experimental, devido à necessidade de anestesia e / ou instrumentação invasiva do animal. Em contraste, a desenfreada pletismografia de corpo inteiro (UWBP) oferece uma maneira precisa, não-invasivo, quantitativo por que analisar parâmetros respiratórios. Esta técnica evita o uso de anestesia e apoios, o que é comum para as técnicas tradicionais de pletismografia. Este vídeo vai demonstrar o procedimento UWBP incluindo o equipamento configurado, calibração e pulmão gravação função. Eleirá explicar como analisar os dados recolhidos, bem como identificar os outliers experimentais e artefatos que resulta da circulação de animais. Os parâmetros respiratórios obtidos utilizando esta técnica incluem o volume corrente, volume minuto, ciclo inspiratório, fluxo inspiratório ea relação entre tempo de inspiração para tempo de expiração. Não UWBP não dependem de habilidades especializadas e é barato para executar. Uma característica fundamental do UWBP, e mais atraente para os potenciais utilizadores, é a capacidade de executar medidas repetidas da função pulmonar no mesmo animal.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A disfunção pulmonar é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo. A condição é caracterizada por troca de oxigênio inadequada, sinônimo de tosse, dores no peito e dispnéia. Contas de doença respiratória para ~ 10% de mortalidade em todo o mundo 1. Segundo a Organização Mundial de Saúde, as taxas de mortalidade são definidos a subir devido à persistência do tabagismo, poluição e irritantes ocupacionais. UWBP é uma adição útil para o estudo da fisiologia pulmonar, que complementa fortemente bioquímicos tradicionais e análises histológicas 2. Outros procedimentos utilizados para a avaliação de pulmão não oferecem as mesmas vantagens que UWBP. Pletismografia invasiva é uma técnica comumente utilizada, que exige que o animal seja anestesiado 3,4 e, portanto, as medidas respiratórias decorrentes não são necessariamente reflexo de um estado natural. Além disso, a exigência de desafios de ventilação mecânica e química impede futuras medições 3,4.Outro método de coleta de dados respiratória é de oscilações forçadas, o que é mais sensível às mais refinadas alterações nos parâmetros respiratórios em comparação com UWBP 5. Oscilação forçada é, no entanto, uma técnica invasiva e requer terminação dos animais para coleta de dados 5-7.

UWBP envolve a colocação de um animal dentro de uma câmara especializada. Durante a inspiração, o ar é aquecido de maré e humidificado dentro dos pulmões aumento da pressão do vapor de água e faz com que a expansão térmica do gás 8. Este efeito provoca uma alteração líquida no volume de ar criando um aumento da pressão no interior da câmara 8 pletismógrafo. O oposto ocorre durante a expiração criar uma forma de onda respiratória do animal. Análise de forma de onda é, então, usado para medir a partir do traço respiratória: freqüência respiratória (respirações / min), tempo total do ciclo respiratório (seg), inspiração / expiração tempo (Ti / Te, sec) e alterações na pressão devido a cada volume corrente (P T). A figura 1 ilustra cada origem medições de um rastreio respiratório. Estas medições são simples de calcular e vários parâmetros respiratórios podem ser derivadas a partir destas medições. Estes parâmetros incluem: O volume corrente (o volume de ar deslocado entre a inalação e exalação normal), volume minuto (volume de gás inalado pelos pulmões por minuto), ciclo inspiratório (a percentagem de tempo de inspiração para a duração total do ciclo de respiração) e taxa de fluxo inspiratório (a quantidade de ar inspirado em um dado momento).

UWBP fornece uma análise precisa, não-invasiva, quantitativa da fisiologia respiratória em modelos animais e pode ser utilizada para medir a progressão da doença respiratória e função pulmonar 6,9. Ao contrário de outras técnicas de pletismografia, UWBP evita o uso de anestesia, restrições e manipulações invasivas que produzem artefatos e experimental 6,9 variabilidade. A anestesia pode suprimir a respiração,alterar a freqüência cardíaca e pode ser um desafio para regular 10. Restrições induzir um aumento na respiração devido ao estresse adicional via corticosterona e adrenalina liberar 11,13. A principal característica do UWBP é repetido avaliação fisiológica tornando-se passíveis de estudos longitudinais. UWBP é altamente recomendável para a avaliação longitudinal de fisiologia pulmonar e oferece uma valiosa habilidade para futura avaliação do medicamento respiratório.

Bleomicina, ovalbumina, e hipoxia têm sido utilizados para induzir desafios respiratórias em diversos estudos e UWBP mediu sucesso pulmão precisas avaliação fisiológica 7,9,13-16. O protocolo descrito foi concebido para ratos de laboratório normais de adultos. No entanto, UWBP foi adaptado a outros animais tais como ratos, cobaias, e primatas não-humanos 17-20. UWBP não se restringe apenas à avaliação da disfunção pulmonar, mas também tem sido utilizada para a avaliação da maturação pulmonar 3.A versatilidade, simplicidade e reprodutibilidade dos UWBP estabeleceram uma excelente técnica para avaliar a função pulmonar em animais. Software Vários (ver materiais e equipamentos de mesa) serão obrigados a seguir este procedimento. Um cientista experiente seria capaz de realizar este protocolo com um rato dentro de 1 hora.

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Protocolo

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NOTA: O seguinte procedimento experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Monash e conduzida de acordo com o Código brasileiro de Prática para o Cuidado e Utilização de Animais para Fins Científicos (2006). Fêmea Adulta C57BL / 6 utilizados para gerar os resultados representativos foram obtidos a partir dos Serviços Animais Monash. Os ratinhos foram alojados em um agente patogénico livre, a temperatura e humidade ambiente específico controlado com um ciclo de luz-escuro de 12 h. Estes ratos tiveram livre acesso a comida e água.

1 Configuração inicial

  1. Conecte o laptop / desktop para a máquina de aquisição de dados para a gravação através de um cabo USB.
  2. Ligue o amplificador de Ponte de 'saída de 1 "a" entrada 1 "da máquina de aquisição de dados através de um cabo BNC.
  3. Insira o transdutor de pressão em "Canal 1" da Octal Ponte Amp. Desligue a máquina de aquisição de dados e abra o software de análise. O software deve autocamente detectar a configuração do equipamento (ver tabela de materiais e equipamentos).
  4. Configurações de canal aberto encontrados na barra de ferramenta de configuração do software. Alterar o número de canais que estão sendo gravados para um.
  5. Configure o barómetro para medir a pressão do quarto e do aparelho de coluna de água para calibrar o amplificador Bridge. O aparelho de coluna de água inclui duas pipetas de seringa de 5 ml serológicos ligados por um tubo de plástico.
  6. Preencha as colunas com água e garantir os níveis de água são equilibradas com uma régua. Conectar um pedaço de tubo de plástico de topo de cada pipeta. Figura 2 mostra a coluna de água definida acima.

2. Calibração Amplificador Ponte

Nota: Para calibrar o amplificador de ponte de uma injecção de ar para dentro da coluna de água é necessária para criar a 1 cm de H 2 O de deflexão. Isto irá ocorrer sob um único conjunto de condições e é dependente do aparelho do utilizador. Para esclarecimento destes passos demonstrate como este laboratório seria realizar a calibração.

  1. Retirar uma seringa de 1 ml para 300 ul; fixar a seringa para a torneira de passagem no final do tubo, do lado direito da coluna de água. NOTA: Verifique se a torneira está aberta para a seringa e da coluna de água e fechado para o ar ambiente. Se o nível de água não está em equilíbrio, neste ponto, virar a torneira para que ele seja aberto ao ar ambiente, e a coluna de água, isso vai reequilibrar a água. A tubagem do lado esquerdo da coluna de água deve ser ligada ao transdutor de pressão para medir a alteração da pressão induzida pela queda da seringa.
  2. Conecte o tubo da coluna de água, no lado esquerdo para o conector do transdutor de pressão (anel superior do transdutor).
  3. Selecione o menu de rolagem para baixo encontrado próximo ao canal 1 para a tela principal, no lado direito do software e selecione "amp Bridge" (ver tabela de materiais e equipamentos).
  4. Digiteas configurações a 5 mV, 20 Hz passa-baixa, marque a caixa 'invertido' e clique em "zero". Clique em "zero" para definir o traço em ~ 0 mV. Reduzir o tamanho da janela para 4: 1 para facilitar a visualização.
  5. Com tudo configurado, pressione a seringa de 1 ml, deixando-o por 3 s. Isto irá mostrar um aumento repentino no software, porque a pressão mudou. Quando os 300 ul é pressionado, a pressão vai passar a água na coluna de água de 1 cm. Este valor conhecido vai ajudar a calibrar o amplificador Bridge.
    NOTA: O aumento da pressão na câmara devido à depressão 300 ul corresponde ao valor P K usado para cálculos posteriores.
  6. Escolha das unidades de entrada 'encontrado no canto inferior esquerdo da janela do Bridge Amp.
  7. Realce o "traço fundo" antes do pico também conhecido como o 'Zero Região ".
    1. Clique na seta ao lado de "ponto 1" e isso vai produzir o background sinal no intervalo de -0,002 0,002 mV-mV (o valor nunca será exactamente a 0 mV).
    2. Tipo "0" na janela adjacente à janela de sinal de fundo.
  8. Destaque a "região pressão aumentou de gráfico" a partir de quando a seringa é deprimido. Clique na seta ao lado do ponto 2 eo valor deve estar no intervalo de 0,9-1,2 mV.
    1. Tipo "1" na janela ao lado da janela "aumento da pressão". Para um esclarecimento visual passos 2.7 e 2.8, consulte a Figura 3. Valores encontrados fora dos limites especificados pode indicar danos ao Octal Ponte Amp.
  9. Ir para "definir as unidades 'encontrado no canto superior direito da janela e selecione" cmH 2 O ". Se esta opção não estiver disponível, podem ser introduzidos manualmente. Clique em OK.
  10. Voltar para o menu do 'Ponte Amp "(vide 2.1). Selecione 1 mV e definir amplificador para "zero";. Isto irá completar a calibração e da coluna de água pode ser removido com segurança.

Função 3 Gravação Lung

  1. Pesa-se o rato (g). NOTA: Uma semana antes da avaliação fisiológica introduzir o mouse para o ambiente de câmara pletismografia. Isso vai ajudar na aclimatação e reduzir o estresse ao realizar este procedimento em uma data posterior. Para um esquema geral que demonstra a configuração UWBP, por favor, consulte a Figura 4.
  2. Medir a temperatura do corpo com um termômetro retal. Lubrifique o termômetro com vaselina antes da inserção. Gravar a leitura da temperatura do lubrificante e limpar-se com 80% (v / v) de etanol. Se usar muito pequenos animais, como filhotes de rato recém-nascidos, o valor médio da temperatura corporal pode ser determinada com um termômetro infra-vermelho em seu lugar.
  3. Coloque a sonda de umidade / temperatura relativa no final de um buraco da câmara de pletismografia. Registre a temperatura, umidade e barometric pressão dentro da câmara de pletismografia, antes de colocar o rato dentro.
  4. Posicione o mouse na câmara de pletismografia, cobrir a extremidade aberta ligeiramente. Isso permite que o mouse para aclimatar. Feche a câmara.
  5. Com a sonda de temperatura / humidade inserido na parte lateral da câmara de pletismografia com um furo, agora introduzir a seringa no transdutor e do outro lado com os dois orifícios.
  6. Pressione 'Start' no programa de software e registro de aproximadamente 15-45 seg. Recorde 5-10 seg de dados onde o animal não estiver em movimento. Movimento de vai alterar basal fisiologia respiratória do animal e fornecer maus resultados. A respiração deve oscilar num movimento linear no programa. Estes dados são utilizáveis. Nota: urinar ou defecar pode levar a um aumento da temperatura e humidade no interior da câmara de pletismografia. Isto irá obscurecer resultados durante a análise. Em caso de urinar ou defecar, parar a gravação imediatamente e limpar o plethysmography câmara com 80% (v / v) de etanol. Consulte a Figura 6 para uma representação visual de resultados abaixo do ideal, onde os dados devem ser rejeitados.
  7. Após a gravação de 45 segundos, pressione "Stop" no software (ver tabela de materiais e equipamentos) programa. Remover o rato da câmara de pletismografia e gravar imediatamente a temperatura ea umidade câmara. Não gravar continuamente por mais de 45 segundos, pois isso pode estressar o animal.
  8. Retorne o mouse para sua gaiola, spray e limpe a câmara com 80% (v / v) de etanol.
  9. Permitir que a câmara para secar e voltar à temperatura e humidade de linha de base, antes de prosseguir para o próximo rato. Repita os passos de 3,1-3,9 para animais subsequentes. Nota: Se vários animais estão sendo estudados, garantir que a temperatura da câmara e retorno aos valores basais umidade perto antes de cada novo animal é colocado na câmara.

4 Análise pletismografia

Nãote: Para calcular os parâmetros respiratórios, como volume corrente (V T) e volume minuto as seguintes variáveis ​​precisam ser mensurados: freqüência respiratória (respirações / min), a respiração total de tempo de ciclo (seg), inspiração / expiração tempo (Ti / Te, segundos) e alteração na pressão devido a cada volume corrente (P T). figura 1 ilustra as variáveis ​​que podem ser medidos a partir de um traço. Os passos seguintes utilizam um software (ver materiais e equipamentos de mesa) para medir essas variáveis. Ao analisar, evite regiões do traço contendo cheirar ou movimento. Para obter resultados reproduzíveis, pelo menos, 5 segundos de boa traço respiração é necessária. Para um exemplo de diferentes traços de respiração consulte a Figura 5 e 6.

  1. Abra a tela para tela cheia, defina vista a 1: 1 e selecionar 5 seg de dados utilizáveis. Um instantâneo representativo disto é mostrado na Figura 5.
  2. Abra a janela de mini-pad dados encontrado na parte superior do programa na aba Datapad. Escolha o canal 1 e selecione 'medições de ciclo' na coluna da esquerda e 'height cíclica média' na coluna da direita.
    1. Selecione 'Opção' e definir a escala para a detecção de pico mínima de 1 (ms). Isto irá permitir a detecção de todos os valores de pico e torna-se extremamente importante na utilização de pequenos animais que produzem pequenas oscilações.
    2. Clique em 'OK'. Isto irá apresentar «deformação Pressão devido a cada volume corrente" medida (P T).
  3. No bloco de dados mini, selecione 'medições de ciclo "seguido de" contagem de eventos' e clique em 'OK'. Isto irá apresentar o «frequência» (f) medição.
    1. Frequência precisa de ser convertido em respirações / min. Isto é feito através da multiplicação do valor por 60 seg e dividindo a resposta pelo tempo total de gravação (min).
  4. No bloco de dados mini, selecione 'cymedições cle 'seguido de' período 'e clique em' Ok '. Isto irá apresentar o "tempo total do ciclo de respiração '(T tot, sec) de medição.
  5. Os próximos passos são usados ​​para criar um macroinstruction para gerar inspiração e expiração valores de tempo de pico. Verifique se o cursor estiver diretamente sobre o máximo do pico / cocho e adicionar um comentário em 9 picos seqüenciais e depressões. Comece com o pico da oscilação, como mostrado na Figura 5.
  6. Posteriormente, selecione janela: Almofada de dados e coluna 1 Na janela que aparecer, clique em "informações de seleção" na coluna da esquerda, "duração" na coluna da direita e clique em 'OK'.
  7. Selecione macro encontrada na parte superior do programa e, em seguida, iniciar a gravação. Agora selecione comandos: 'Encontrar', 'Go', 'Start of File "e clique em' Pesquisar '.
  8. Selecione os comandos: 'Find' e 'Find comentários'. Digite a mesma frase digitada para a caixa de comentário na caixa 'contendo' fornecido. Escolha o 'Selecione a ponto anterior' guia e 'Pesquisar'.
  9. Selecione os comandos: "Adicionar ao bloco de dados". Em seguida, selecione macro: comandos de macro e começar a repetir. A janela de contagem de repetição que aparece deve ser fixado em 9.
  10. Selecione o comando: 'Encontrar próximo'. Escolha um comando: "Adicionar ao bloco de dados". Finalmente, selecione comandos de macro e final da repetição.
    1. Agora, selecione a macro e parar a gravação. Salve e nomeie a macro depois que o número de animais. NOTA: A configuração do macro para cada animal permite que a macro a ser utilizado para estudos longitudinais e economiza tempo.
  11. A macro agora pode ser executado para obter o Inspiration (T i) e expiração (T e) tempo entre cada comentário. Os dados serão exibidos em canal 1 da datapad. Expiração e inspiração ocorre consecutivamente e os dados aparecerão nesta ordem.
    1. Os dados precisam ser divididas manualmente em valores de inspiração e expiração. Calcule a média dos quatro valores de dados de cada parâmetro para se obter a média i o t e t e.
  12. Uma vez que os valores primários foram derivados do volume corrente (V T, ml) pode ser calculado. Para obter o volume corrente a equação de Drorbaugh Fenn e 8 é usado:
    V T (ml) = (P T / P K) x (V K) x ((temperatura central (P B - P C)) / (temperatura central (P B - P C) - T C (P B - P CORE)))

    Onde
    V T: Volume Tidal
    P k: desvio de pressão devido a cada injeção de 1 ml (Consulte o passo 2.5)
    T core: temperatura do núcleo de cada animal
    P C: pressão de vapor de água na câmara de temperatura X Umidade relativa em chamber
    T C: temperatura na câmara de animais
    P central: Pressão à temperatura do corpo (pressão do vapor de água à temperatura do corpo x 1.0)
    P t: desvio de pressão devido a cada volume corrente
    V k: Volume de injeção para a calibração
    P B: pressão barométrica
  13. Uma vez que o volume corrente tem sido calculados os seguintes parâmetros também podem ser determinados:
    • Volume minuto (ml / min) = V T xf
    • Volume minuto (ml / min / kg) = (V xf T) / Peso corporal (kg)
    • V T (ml / kg) = V T (ml) / peso do corpo (kg)
    • Ciclo inspiratória (%) = T i / T tot
    • Inspiratória Vazão (ml / seg) = V T / T i
    • Proporção de tempo de inspiração para tempo de expiração = T i / T e
    • O tempo total do ciclo (sec) = tempo de Inspiração (s) + tempo de expiração (seg)

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Resultados

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Quando este procedimento foi seguido corretamente, um traço oscilante consistente é criado no software de análise de dados. O procedimento prevê um traço respiratória em poucos minutos após a configuração com cálculos simples de computação para determinar parâmetros respiratórios indicados. Figura 5 representa um traço respiratória adequada de um controle (saudável) do mouse. Dados oscilante adequado é produzido quando o animal não está em movimento activamente.

UWBP é uma a...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A técnica descrita aqui é um método não-invasivo para avaliação de parâmetros respiratórios de ratos sem restrições e não anestesiados. Os pontos fortes deste protocolo incluem sua simplicidade e precisão para medir a função pulmonar longitudinalmente com artefatos mínimos. Existem, no entanto, algumas limitações e passos críticos para ser notado sobre o procedimento. Em primeiro lugar e mais importante, o mouse deve manter a calma dentro da câmara por um período mínimo de cinco segundos. Adicionado estresse pode atrapa...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes. Os autores não têm conflitos a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer ao Prof. David Walker por sua assessoria técnica e fornecimento de equipamentos no desenvolvimento desta técnica. Este trabalho é apoiado pelo Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo de Victoria. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo de Victoria.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Software LabChart 7 (para Macintosh)ADINSTRUMENTSMLU60/7usado na etapa 4 do protocolo
PowerLab 8/30 (modelo ML870)ADINSTRUMENTSPL3508
Octal Bridge Amp (modelo ML228)ADINSTRUMENTSFE228
Cabo BNC preto para BNC (1 m)ADINSTRUMENTSMLAC01
Macintosh OSApple Inc.Mac OS X 10.4 ou posterior
Termômetro retal digital SurgipackVega TechnologiesMT-918
Transdutor de pressão volumétrica de grama PT5AGrass Instruments Co.Número do modelo PT5A; nº de série L302P4.
Seringa de 1 mlBecton Dickinson (BD)309628
Pipetas de seringa serológica de 5 mlGreiner Bio One606160Conectada por meio de tubo de plástico
BalançasVWR International, Pty LtdSHIMAUW220DQualquer balança com resolução de 0,1 grama
HM40 Medidor de umidade e temperaturaVaisalaHM40A1AB
BarômetroBarômetro Mundo1586
Tubulação de laboratórioDow Corning508-101Usado para conectar a coluna de água à seringa e ao transdutor de pressão
Câmara cilíndrica de perspexDynalab Corp.Câmara cilíndrica construída sob medida com dimensões internas da seguinte forma: 50 mm (l) x 1.500 mm (l). Existem duas tampas para cada lado, com dimensões de 80 mm (l) x 80 mm (w). Cada tampa tem um orifício circular de 60 mm de largura cortado na face da tampa com 50 mm de profundidade. Isso permite que a câmara se encaixe na tampa. Um anel de borracha é encaixado ao redor de cada orifício da tampa onde a câmara se encaixará. Para fixação da seringa e do transdutor de pressão, as aberturas têm 5 mm de diâmetro. Para fixação da sonda de umidade, as aberturas têm 25 mm de diâmetro.
80% de etanol (4 L)VWR International, Pty LtdBDH1162-4LP

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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