Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

Resumo

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Resumo

As células-tronco se dividem de forma assimétrica para gerar duas células de progênie com desigual potencial destino: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação de uma célula. Dada a sua relevância para o desenvolvimento e da doença, compreender os mecanismos que regem a divisão de células-tronco assimétrico tem sido uma área forte de estudo. Porque eles são geneticamente tratável e submetidos a ciclos sucessivos de divisão celular uma vez a cada hora, as células estaminais do sistema nervoso central, de Drosophila, ou neuroblastos, são modelos indispensáveis ​​para o estudo da divisão de células estaminais. Cerca de 100 células estaminais neurais estão localizadas próximo da superfície de cada um dos dois lobos cerebrais larvais, tornando este sistema modelo particularmente útil para estudos de microscopia de imagens em tempo real. Neste trabalho, nós revisamos várias abordagens amplamente utilizado para visualizar as divisões de células-tronco, e abordar as vantagens e desvantagens relativas as técnicas que empregam dissociados contra tecidos cerebrais intactas. Nós também detalhar nossa simplifprotocolo IED usado explantar cérebros inteiros a partir de larvas de terceiro estádio de imagens de células vivas e aplicações de análise fixos.

Introdução

As células-tronco manter um equilíbrio de diferenciação e auto-renovação para gerar diversidade celular durante o desenvolvimento precoce e substituir as células danificadas em tecidos adultos. A regulação deste homeostase impede tanto a perda como sobre-expansão da população de células estaminais, o que pode resultar em degeneração de tecido nocivo ou tumorigénese.

Os neuroblastos (RN), são as células estaminais neurais amplamente estudadas do sistema nervoso central de Drosophila (Figura 1A), que durante a primeira forma estágios embrionários ^{1, 2.} RN submetidos a repetidos ciclos de divisão celular ....

Protocolo

1. Preparação de materiais necessários para Explante Brains terceiro instar larval

1. Preparar as ferramentas necessárias para a microdissecção.
   1. Forjar duas ferramentas de dissecação (um bisturi e um gancho), colocando primeiro um único pino de dissecação em cada titular pino. Prenda os pinos firmemente com a mão ou com um alicate (Figura 1C).
   2. Use um par de pinças de idade para dobrar um pino de dissecação de um ângulo de aproximadamente 120 °. Faça isso sob um microscópio de dissecação para garantir que a metade superior do pino fica plana quando o titular do pino é segurado na mão. Esta ferramenta deverá ser utilizada com....

Resultados

Imagens ao vivo elucidou uma série de mecanismos que regulam NB ACD. Antes da aquisição da imagem, é necessário determinar as condições de imagem ideal. É necessário equilibrar a taxa de captura de quadro com a duração de imagens de células vivas. Para a análise celular fina, por exemplo, o aumento temporal e resolução óptica pode ser necessária. Ao visualizar um único ciclo celular NB (Figura 4A), a taxa na qual as imagens são captadas pode ser aumentada, sem a introdução de fotoenvelhecimento. Normalm.......

Discussão

Imagens de células vivas é uma abordagem valiosa usada para estudar os mecanismos que regulam a ACD de células-tronco, a diferenciação de linhagens celulares, ea morfogênese de tecidos complexos. Embora os grupos de pesquisa têm historicamente utilizada uma variedade de técnicas para visualizar NB ACD, estas abordagens podem ser geralmente agrupadas em duas categorias que diferem principalmente no que diz respeito ao facto de o tecido cerebral é deixada intacta ou dissociada.

Imagem dissocia.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de tecidos Lumox 50 x 12 mm	Sarstedt	94.6077.410	Uma placa de cultura reutilizável com uma base de filme permeável a gás e opticamente transparente.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiótico-Antimicótico (100x)	Invitrogen	15240-062	Um suplemento contendo penicilina (10.000 U/ml), estreptomicina (10.000 μ g/ml) e anfotericina B (25 μ g/ml) que é adicionado ao meio S2 da Schneider para evitar contaminação bacteriana e fúngica.
Lamínulas de vidro, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Óleo de halocarbono 700	Sigma-Aldrich	H8898	Um óleo inerte de alta viscosidade que é claro e incolor.
Par de suportes de alfinetes niquelados, 17 cm de comprimento	Ferramentas Fine Science	26018-17
Par de Pinças Dumont #5	Ferramentas Fine Science	11252-20
Agulha/sonda de dissecação com cabo de plástico	Fisher Scientific	08-965-A
Filtro de seringa, 0.22 μ m tamanho do poro	Seringa Fisher Scientific	09-719A
, 5 ml	BD Biosciences	309646
Pipeta de transferência de plástico Fisher	Scientific	S30467-1
Paraformaldeído, 32% EM-grade	Microscopia Eletrônica Sciences	15714	CUIDADO: O formaldeído é tóxico; deve ser manuseado em um exaustor. Siga as diretrizes da MSDS para um manuseio seguro.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dicloridrato)	Invitrogen	D1306	Um corante que marca o DNA e é excitado pela luz UV.