Artigo de método

Modelagem astrocitoma Patogênese In Vitro E In Vivo Usando Cortical astrócitos ou células-tronco neurais de condicional, Geneticamente Modificadas Ratos

DOI:

10.3791/51763

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12 de agosto de 2014

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Astrócitos fenotipicamente selvagens e células-tronco neurais colhidas de camundongos modificados com alelos oncogênicos condicionais floxed e transformados por meio de recombinação viral mediada por Cre podem ser usados para modelar a patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo por injeção ortotópica de células transformadas em cérebros de irmãos de ninhada singênicos e imunocompetentes.

Resumo

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Os modelos atuais de astrocitoma são limitados em sua capacidade de definir os papéis das mutações oncogênicas em tipos específicos de células cerebrais durante a patogênese da doença e sua utilidade para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. A fim de projetar um sistema modelo melhor para essas aplicações, astrócitos corticais de tipo fenotipicamente selvagem e células-tronco neurais (NSC) de camundongos geneticamente modificados condicionais (GEM) que abrigam várias combinações de alelos oncogênicos floxed foram colhidos e cultivados em cultura. A recombinação genética foi induzida in vitro usando recombinação mediada por Cre adenoviral, resultando na expressão de oncogenes mutantes e deleção de genes supressores de tumor. As consequências fenotípicas dessas mutações foram definidas medindo a proliferação, transformação e resposta a drogas in vitro. Modelos de aloenxerto ortotópico, em que as células transformadas são injetadas estereotáticamente no cérebro de irmãos de ninhada singênicos imunocompetentes, foram desenvolvidos para definir o papel das mutações oncogênicas e do tipo de célula na tumorigênese in vivo. Ao contrário da maioria dos xenoenxertos de linha celular de glioblastoma humano estabelecidos, a injeção de astrócitos corticais derivados de GEM transformados nos cérebros de irmãos de ninhada imunocompetentes produziu astrocitomas, incluindo o subtipo mais agressivo, glioblastoma, que recapitulou as características histopatológicas dos astrocitomas humanos, incluindo invasão difusa do parênquima cerebral normal. A imagem de bioluminescência de aloenxertos ortotópicos de astrócitos transformados projetados para expressar luciferase foi utilizada para monitorar o crescimento do tumor in vivo ao longo do tempo. Assim, modelos de astrocitoma usando astrócitos e NSC colhidos de GEM com alelos oncogênicos condicionais fornecem um sistema integrado para estudar a genética e a biologia celular da patogênese do astrocitoma in vitro e in vivo e podem ser úteis no desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos para essas doenças devastadoras.

Introdução

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Astrocitomas são o tumor cerebral primário mais comum e glioblastoma (GBM), a IV astrocitoma grau, é o subtipo mais comum e agressivo, com uma sobrevida média de 12-15 meses 1,2. Invasão de astrocitomas difusos, particularmente GBM, opõe-se a ressecção cirúrgica completa, limita a eficácia de terapias adjuvantes, e inevitavelmente leva a recorrência pós-tratamento 3. Inicialmente, os pacientes apresentam, quer com de novo (primário) GBM ou com astrocitoma grau menor que inevitavelmente progride para GBM (secundário) 4. GBM é genomicamente heterogêneo e caracterizado por mutações que se excluem mutuamente e que co-ocorrem em genes que governam três principais vias de sinalização: o G 1 / S (Rb) checkpoint do ciclo celular, receptor tirosina quinase (RTK), e TP53 vias 5-7. GBM é composta por quatro subtipos do genoma com perfis de expressão distintos que se assemelham a diferentes tipos de células do cérebro, sugerindo que o GBM subtipo é influciada por sua célula de origem 6,8,9. Modelos astrocitoma melhores são necessários para definir o papel de combinações específicas de mutações em determinados tipos de células durante astrocitoma patogênese. Aproveitando esses modelos para o desenvolvimento de drogas mais eficientes pré-clínico, em última instância ajudar a melhorar os resultados dos pacientes. Astrocitoma modelos atuais incluem linhas celulares estabelecidas humanos, paciente derivado xenotransplantes (PDX), astrócitos humanos normais geneticamente modificados e de células-tronco neurais (NSC) e camundongos geneticamente modificados (GEM) 10-14. Nós desenvolvemos uma alternativa, GEM não germinativa (nGEM) modelo 15 utilizando células cerebrais primários - astrócitos corticais e NSC - colhidas GEM abrigando várias combinações de alelos oncogênicos floxed. O objectivo foi o de gerar modelos astrocitoma com células geneticamente definidas que poderia ser fenotipicamente caracterizadas tanto in vitro como in vivo e potencialmente utilizados para o desenvolvimento pré-clínico de drogas em icamundongos mmune-competentes.

Linhagens de células humanas estabelecidas são o modelo mais comumente usado de patogênese astrocitoma e resposta à droga in vitro e in vivo. Eles são tecnicamente simples, amplamente disponível, e definiram cinética e tumorigenicity sobre xeno ortotópico em ratos imunodeficientes 10,11,16-18 . Suas desvantagens incluem a incapacidade de gerar linhagens celulares estabelecidas de astrocitomas de baixo grau, limitando estudo apenas para astrocitomas de alto grau; falta de uma célula de origem definido; a presença de anormalidades genômicas complexas, muitas vezes com perfis genômicos que diferem acentuadamente a partir da amostra original do doente; e susceptibilidade à fenotípica e genotípica de deriva durante a cultura de série no soro 11,17,19-22. As conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas individuais em linhas de células humanas estabelecidas GBM pode ser mascarado pela multidão de anomalias que estão realmente presentes, que muitas vezes impede elucdação das conseqüências diretas genótipo-fenótipo.

PDX são gerados através da passagem subcutânea de células astrocitoma isolado do paciente em ratos imunodeficientes ou através de sua cultura como esferóides não aderentes em definido, meio sem soro antes da injeção ortotópico em cérebros de ratos imunodeficientes 12,23. PDX manter com maior precisão a paisagem genómico de astrocitomas humanos, mas semelhante às linhas de células humanas estabelecidas, o efeito de mutações oncogénicas fenotípica individuais pode ser mascarado pela sua complexidade genómico 19,24. Para definir as conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas específicas, particularmente em resposta a novas terapias, painéis de linhas de células humanas estabelecidas ou PDX são freqüentemente utilizados para estabelecer correlações genótipo-fenótipo, mostrar generalização, e minimizar a probabilidade de efeitos específicos de linha celular. Enquanto PDX recapitular com precisão as características histopatológicas de astrocitoma humano, including invasão, xenotransplantes ortotópico de linhas de células humanas estabelecidas geralmente não 21,23,25. Além disso, os astrócitos humanos normais e NSC foram geneticamente modificadas com mutações oncogênicas definidas para modelar astrocitoma tumorigênese in vitro e in vivo 13,14,26. Estas células não possuem a complexidade genómico de linhas celulares humanas estabelecidas e PDX e recapitulam precisão histopatologia astrocitoma humano, mas requerem xeno em roedores imunodeficientes in vivo. Como todos os modelos de células humanas exigem hospedeiros roedores imunodeficientes para evitar a rejeição de xenotransplante imunomediada, estes modelos não recapitular as interações tumor-estroma nativas de um sistema singênico e falta de um sistema imunológico intacto, limitando a investigação pré-clínica de alvo-estroma e imunomoduladores terapias 10,11.

GEM exame autorização das conseqüências fenotípicas de combinações pré-determinadas de muta oncogênicoções in vivo durante a tumorigênese situ. Considerando GEM não condicional têm mutações em todos os tecidos ao longo do desenvolvimento, GEM condicional têm floxed alelos oncogênicos que permitem a segmentação de mutações, restringindo recombinação Cre-mediada para tipos específicos de células através do uso de celulares promotores específicos do tipo 10,11,15,18. Condicional GEM astrocitoma foram utilizados para elucidar os papéis funcionais de mutações oncogénicas em tipos de células distintos dentro de um cérebro intacta 11. A utilidade em pré-clínico da gliomagênese situ utilizando GEM condicional é limitada por um certo número de factores, incluindo 1) a ausência de uma correlação in vitro, 2) dificuldade em gerar grandes grupos de ratinhos com genótipos complexos, 3) de comprimento de latência para o desenvolvimento de tumor in situ , 4) e estocástica progressão tumoral. Porque in situ tumorigenesis carece de um modelo correspondente in vitro, testes de drogas in vitro não pode ser realizada wmodelos condicionais convencionais om jóia. Em contraste com outros tipos de câncer, os modelos GEM condicionais de astrocitoma raramente são induzidas por simples mutações oncogênicas 11. Assim, esquemas de melhoramento complexas são necessárias para gerar GEM condicional com múltiplas mutações oncogênicas. Além disso, a iniciação astrocitoma ocorre com penetrância variável depois de um longo período de latência nesses modelos, enquanto a progressão para astrocitomas de alto grau geralmente ocorre de forma não-uniforme, estocástica e, finalmente, dá origem a tumores com paisagens genômicas complexas e cinética de crescimento rápido 27, 28. A penetrância variável e natureza estocástica de progressão maligna em modelos GEM condicional exige que os ratos individuais ser rastreada por radiografia para detectar a presença e localização de astrocitomas de alto grau antes de sua inclusão em estudos pré-clínicos de drogas. Tomados em conjunto, estas limitações impedir a geração e ensaios dos grandes grupos de GEM condicional necessário para prtestes de drogas eClinical.

O sistema GEM RCAS-tva, que utiliza retrovirais aviária (RCAS) vectores para infectar GEM manipuladas para expressar o receptor viral (TVA) em tipos de células neurais específicos, tem sido extensivamente utilizado para modelar astrocitoma tumorigénese 11. Em contraste com a GEM condicional, este sistema modelo permite a introdução de múltiplas mutações oncogénicas em tipos de células específicas, sem a necessidade de sistemas complexos de reprodução. No entanto, é limitado por uma penetrância variável, o requisito para a divisão activa de células para alcançar a integração virai, e a inserção dos transgenes aleatoriamente no genoma do hospedeiro 29.

Modelos não-germinativas GEM (nGEM), que utilizam células colhidas de GEM, estão se tornando cada vez mais importante, porque eles superar muitas das limitações de outros sistemas modelo 15. O papel do tipo de célula e de iniciar as mutações que ocorrem simultaneamente em astrocitoma patogénese são de difícil dissuadirmina usando linhas celulares estabelecidas humanas ou GBM PDX porque são derivados a partir de tumores em fase terminal que se acumularam extensas mutações genéticas em tipos de células não definidas durante o curso da progressão maligna. Em contraste, todos os graus de astrocitomas pode ser modelada utilizando nGEM definido por induzir mutações genéticas dentro tipos de células cerebrais específicas purificadas 11,30. Assim, a influência de mutações genéticas específicas e tipo de células em fenótipos celulares e moleculares pode ser determinada in vitro e in vivo. Semelhante às linhas de células humanas estabelecidas GBM, em testes in vitro inicial de droga usando nGEM pode ser usado para dar prioridade drogas para os ensaios in vivo, utilizando as mesmas células. Tumorigénese in vivo pode ser determinada por aloenxerto células nGEM ortotopicamente nos cérebros de ninhada singeneicos imunocompetentes 30. Estes modelos de aloenxerto ortotópico, pois, permitir testes in vivo, não só de um citotóxico convencionalnd terapias-alvo, mas imunomoduladores e de terapias alvo-estroma também. Finalmente, o papel do microambiente no início e progressão do tumor pode ser determinada por comparação dos resultados entre nGEM e modelos GEM convencionais utilizando as mesmas mutações nos mesmos tipos de células.

Nós e outros desenvolveram astrocitoma nGEM usando células primárias - astrócitos, NSC, ou células precursoras de oligodendrócitos (OPC) - colhidas GEM 30-34. A lógica por trás do desenvolvimento de um astrocitoma nGEM era criar um modelo para determinar as conseqüências fenotípicas de mutações oncogênicas em tipos específicos de células que poderiam ser usados ​​para testes de drogas pré-clínicos in vitro e in vivo em animais imunocompetentes. Colhemos astrócitos fenotipicamente WT corticais e NSC de não-Cre expressar, GEM condicional mantida em um> 94% C57 / Bl6 fundo com caminho RB floxed - Rb1 loxP / loxP, ou TgGZT121 - e floxed RTK / RAS / PI3K - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP - genes em várias combinações 35-39. Nós induzida recombinação genética in vitro utilizando vetores de adenovírus que codificam Cre recombinase. Porque colheitas astrócitos corticais contêm uma mistura de tipos de células, foram utilizados os vectores Ad5GFAPCre ou transgenes oncogénicos dominantes, tais como TgGZT 121 dirigido a partir do promotor GFAP humana, para enriquecer para GFAP + astrócitos corticais nestas culturas. Definimos as consequências fenotípicas de G 1 / S (RB), MAPK, e mutações PI3K em astrócitos corticais e NSC in vitro e in vivo. MAPK e PI3K-ativado via G1 / S-defeituosos astrócitos molecularmente imitou GBM humano proneural e, após a injeção ortotópico, tumores formados em um local pré-definido com cinética de crescimento uniforme, latências curtas, eo histopatológicosal marcas de GBM humano 30. Monitorização longitudinal do crescimento do tumor in vivo ajuda de testes pré-clínicos de drogas através da normalização de coortes de tratamento e análise quantitativa do crescimento do tumor, em resposta ao tratamento com 40. Determinou-se a cinética de crescimento do tumor por imagem de bioluminescência longitudinal de camundongos injetados com luciferase expressando astrócitos corticais. Portanto, os astrócitos corticais e NSC derivados GEM condicional fornecer um sistema modelo tratável para a definição de repercussão funcional de mutações associadas à astrocitoma e um sistema modelo potencial para o desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

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Protocolo

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Todos os estudos com animais foram aprovados pela Universidade da Carolina do Norte Animal Care Institucional e Comitê de Uso.

1 A cultura Cortical astrócitos de Neonatal Ratos

  1. Preparação
    1. Amassar 2-3 tecidos tarefa delicada e colocar no fundo de um balão que continha 70% de etanol. Coloque tesouras de dissecação, pinças curvas e 2 pares de micro fórceps direto para este frasco. Os tecidos são usados ​​para evitar entortar os micro fórceps.
    2. Adicionar 1 ml de HBSS a 60 milímetros uma cultura de tecidos de. Prepara-se uma placa separada para cada animal e manter pratos sobre gelo.
    3. Anestesiar animais por regulamentos institucionais.
    4. Quente 7 ml de DMEM com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina (DMEM completo) para cada animal de um banho de água a 37 C °. NOTA: Para 5 ratos, os passos 1.1.1-1.1.4 terá ~ 15 min.
  2. Tissue Colheita
    1. Sacrifício rato neonatal (dia 1-3) por institutiregulamentos onal.
    2. Retirar as tesouras de dissecção a partir de etanol, para permitir que eles escorrer, e fazer um corte sagital na pele sobre o crânio a partir da medula espinal para o nariz.
    3. Fazer um corte no crânio ao longo da sutura sagital, a partir da medula espinal e estendendo-se além dos bulbos olfactivos. Ter o cuidado de manter as pontas de tesoura, perto da superfície interior do crânio para minimizar danos no tecido cerebral.
    4. Usando uma pinça curva, descascar delicadamente cada hemisfério do crânio lateralmente longe do cérebro.
    5. Usando micro fórceps retas, aperte suavemente a parte dorsal de cada hemisfério cortical e coloque-o no prato de cultura de tecidos contendo HBSS. Tome cuidado para evitar o cerebelo e bulbo olfatório. Não tome qualquer tecido abaixo do corpo caloso.
    6. Usando um microscópio de dissecação e 2 pares de micro pinça, retire cuidadosamente as meninges de cada hemisfério cortical. Retorne o prato de cultura de tecidos para gelo até começar homogenizatio tecidon.
    7. Repita os passos 1.2.1 através de 1.2.6 para cada animal adicional. NOTA: Para 5 ratos, os passos 1.2.1-1.2.7 terá ~ 30 min.
  3. Homogeneização Tissue
    1. Usando uma lâmina de barbear limpa, finamente corte os hemisférios corticais e mover a placa para uma câmara de cultura de tecidos.
    2. Transfira o tecido cortado em um estéril tubo de 15 ml. Lava-se a placa com 1 ml de HBSS frio de gelo e transferido para o tubo contendo o tecido.
    3. Espere até que o tecido assenta no fundo do tubo, em seguida, remover o excesso de HBSS cuidadosamente usando uma pipeta.
    4. Adicionar 2 ml de temperatura ambiente de tripsina / EDTA. Pipeta ~ 10x com uma pipeta de 1 ml para dissociar mais células.
    5. Incubar a suspensão de células a 37 ° C durante 15 - 20 min. Misturar cuidadosamente por inversão a cada 5 min.
    6. Adicionar 3 ml de DMEM completo para inibir a tripsina. Pipeta ~ 10x com uma pipeta de 1 ml para misturar a solução.
    7. Centrifugar a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    8. Removero sobrenadante com uma pipeta de 1 ml. Não aspire o meio porque o pellet pode estar solto.
    9. Ressuspender o sedimento em 4 ml de 37 ° C completar DMEM. Transferência da suspensão de células para um balão de 75 centímetros de parafuso superior de cultura de tecidos. NOTA: Para 5 ratos, os passos 1.3.1-1.3.9 terá ~ 50 min.
    10. Aproximadamente 16 horas após a colheita dos astrócitos, lavar o frasco com 4 ml de HBSS a 37 ° C, em seguida, adicionar 4 ml de 37 ° C completar DMEM. Manter os astrócitos corticais a 37 ° C em 5% de CO 2. NOTA: O passo de lavagem é importante para a remoção das células não aderentes e os detritos a partir do prato de cultura.
    11. Quando a cultura é de ~ 95% confluentes, agitar durante a noite a 37 ° C em 5% de CO2, retirar o meio contendo as células isoladas, em seguida lavar o frasco com 4 ml de HBSS a 37 ° C. Adicionar 4 ml de 37 ° C completar DMEM e manter as células a 37 ° C em 5% de CO 2. NOTA: Este passo é importante para enriquecer a cultura de astrócitos corticais, como a contaminação microglia ecélulas progenitoras de oligodendrócito separar com este procedimento e são removidos a partir da cultura 41.
    12. Repita os passos 1.3.1-1.3.11 para cada animal.
  4. A indução de recombinação genética
    1. 24 horas após a conclusão da etapa 1.3.11, substituir o meio com 2 ml de 37 ° C completar DMEM. Adicionar 1 ml de 37 ° C, contendo uma SCM ul de> 10 10 pfu / ml de Ad5CMVCre ou Ad5GFAPCre. Incubar durante 6 horas a 32 ° C em 5% de CO2 .CAUTION: precauções de segurança Use BSL2 ao manusear adenovírus recombinante.
    2. Remover os vírus contendo meio e adicionar 37 ° C DMEM completo sem vírus para os astrócitos do córtex. CUIDADO: Use as precauções de segurança ao manusear BSL2 adenovírus recombinantes e descartar a mídia que contém o vírus por regulamentos institucionais. NOTA: Para 5 culturas de astrócitos, as etapas 1.4.1 - 1.4.3 terá ~ 15 min excluindo a incubação de 6 horas.
    3. Expandir culturas de astrócitos corticais para emvitro e in vivo caracterização. NOTA: Determinar a presença de mutações na sequência Cre-recombinação por PCR com primers específicos para o gene recombinado ou por imunomanchas, quer para a proteína mutada ou as suas consequências específicas de sinalização. O tempo necessário para a estabilização fenotípica das culturas de astrócitos corticais após recombinação Cre será dependente das mutações utilizados e deve ser determinado empiricamente (Figura 2).

2. A cultura Neural Stem Cells de Neonatal Ratos

  1. Preparação
    1. Antes de iniciar a dissecção, preparar 4 ml de solução de digestão por cérebro adicionando 3,1 mg de papaína e 1,3 mg de cisteína e 4 ml de meio de dissociação - 98 mM de Na 2 SO 4, 30 mM de K 2 SO 4, MgCl 5,8 mM, 2, 0,25 mM de CaCl2 , HEPES 1 mM (a partir de 1 M de HEPES pH 7,4 estoque) glicose 20 mM, 0,001% de vermelho de fenol, e NaOH a 0,125 mM. A adição de papaínae cisteína ao meio dissociação vai virar o amarelo solução.
    2. Incubar a 37 ° C em banho-maria durante 15 min. Misturar por inversão periódica.
    3. Adicionar NaOH 0,1 M gota a gota, até que a solução digestão retorna à luz de cor vermelha.
    4. Num capuz de cultura de tecidos, estéril de filtração a solução de digestão usando um filtro de seringa (0,22 um de tamanho de poro). Manter a solução em gelo a digestão.
    5. Preparar 50 ml de Células Estaminais Médio (SCM) por mistura de 44,5 ml de Meio Basal NSC, NSC suplemento de 5 ml, 0,5 ml de penicilina-estreptomicina, 50 mL de 0,2% de heparina, 10 ul de 100 ug / ml de EGF, e 10 ul a 100 ug / ml bFGF. SCM é estável durante uma semana, quando armazenados a 4 ° C.
    6. Prepare HBSS completo (cHBSS) por mistura de 50 ml de HBSS 10x, 1,25 ml de 1 M de HEPES (pH 7,4), 15 ml de 1 M de D-glucose, 5 ml de 100 mM de CaCl2, 5 ml de 100 mM de MgSO 4, e 2 ml de 1 M de NaHCO3. Levar o volume total a 500 ml com ddH 2 O.
    7. Filtro de esterilizar cHBSS sagacidadeha 0,2 m poros do filtro tamanho e armazenar a 4 ° C.
    8. Amassar 2-3 tecidos tarefa delicada e colocar no fundo de um balão que continha 70% de etanol. Coloque tesouras de dissecação, pinças curvas, e 2 pares de micro fórceps direto para este frasco. Os tecidos são usados ​​para evitar entortar os micro fórceps. NOTA: Para 5 ratos, os passos 2.1.1-2.1.8 terá ~ 45 min.
  2. Tissue Colheita
    1. Sacrifício neonatal (dia 1-3) camundongos por regulamentos institucionais.
    2. Retirar as tesouras de dissecção a partir de etanol a 70%, para permitir que eles escorrer, e fazer um corte sagital na pele sobre o crânio a partir da medula espinal para o nariz.
    3. Fazer um corte no crânio ao longo da sutura sagital, a partir da medula espinal e estendendo-se além dos bulbos olfactivos. Ter o cuidado de manter as pontas de tesoura, perto da superfície interior do crânio para minimizar danos no tecido cerebral.
    4. Usando uma pinça curva, descascar delicadamente cada hemisfério do crânio lateralmente para longe docérebro.
    5. Remova cuidadosamente todo o cérebro e colocar em gelo cHBSS frio.
    6. Usando um microscópio de dissecção, retire cuidadosamente meninges do cérebro com ferramentas de dissecação multa.
    7. Coloque o cérebro na superfície inferior e remover cerebelo / hindbrain e bulbo olfatório / córtex frontal com vertical (coronal) corta com um bisturi tamanho 11.
    8. Gire o cérebro restante, 90 ° para colocá-lo na parte caudal, gerando, assim, uma visão coronal do cérebro. Localize os ventrículos laterais.
    9. Cortar uma secção cúbica contendo a zona subventricular (SVZ).
    10. Transferir SVZ contendo tecido de um tecido 60 milímetros prato de cultura fresca com gelo cHBSS frio e tritura com tecido de tamanho 11 bisturi.
    11. Transferir o tecido moído para um tubo de 15 mL estéril. Colocar o tubo em gelo.
    12. Lava-se a placa de Petri com 1-2 ml de gelo cHBSS frio. Transferir a solução de lavagem para o tubo contendo o tecido.
    13. Repita os passos 2.2.1-2.2.12 com neonata adicionall camundongos se necessário. Transferir todos os tubos de 15 ml para um capuz de cultura de tecidos para o restante do protocolo. NOTA: Para 5 ratos, os passos 2.2.1 - 2.2.13 terá ~ 45 min.
  3. Homogeneização Tissue
    1. Coloque a solução de digestão (preparado no passo 2.1.1) em um banho de água a 37 C ° durante 5 min. Além disso, quente SCM 2 ml por cérebro em um banho de água a 37 ° C.
    2. Remover o sobrenadante cuidadosamente do tecido moído com uma pipeta de 1 ml. Não aspirar.
    3. Adicionar solução de digestão 2 ml a 37 ° C por 15 ml tubo e misture cuidadosamente por inversão.
    4. Incubar a 37 ° C em banho-maria durante 15 min. Misture por inversão a cada 5 min.
    5. Adicionar mais 2 ml de solução de 37 ° C a digestão para cada tubo e repita o passo 2.3.4.
    6. Permitir que as células se depositam no fundo do tubo, por gravidade, em seguida, remover o sobrenadante a partir do tecido digerido utilizando uma pipeta de 1 ml.
    7. Adicionar 2 ml de 10 mM E-64 diluído em cHBSS e mistura-se cuidadosamente por inversão.
    8. Incubar durante 3 minutos à temperatura ambiente.
    9. Permitir que as células se depositam no fundo do tubo, por gravidade, em seguida, remover o sobrenadante a partir do tecido digerido.
    10. Adicionar 1 ml de 37 ° C cHBSS e homogeneizar com uma ponta de pipeta de 1 ml (~ 20 golpes). Evite injetar bolhas de ar durante a homogeneização do tecido.
    11. Passar o homogeneizado de tecido através de um filtro de células 40 um de tamanho de poro, e depois enxaguar o filtro com 5 ml de 37 ° C cHBSS.
    12. Centrifuga-se o tecido homogeneizado a 125 x g durante 5 min.
    13. Retirar 95% de sobrenadante com uma pipeta de 1 ml, sem perturbar o sedimento celular. Pellet celular cuidadosamente ressuspender em 200 ul de 37 ° C com uma pipeta de SCM ponta 200 ul.
    14. Adicionar 1,8 ml de 37 ° C SCM e transferir a suspensão de células para um poço de uma placa de 6 poços estéril. NOTA: Para 5 ratos, os passos 2.3.1-2.3.14 terá ~ 75 min.
  4. Neural Stem Cell Cultura
    1. Reabastecer o meio depois de 3 dias, adicionando mais 2 ml 37 °C SCM.
    2. Após 7 dias, transferir os neurospheres para um tubo de 15 ml e deixar os neurospheres resolver pela força da gravidade para> 5 min.
    3. Remover o sobrenadante e adicionar 2 ml 37 ° C SCM.
    4. Transferir as neuroesferas para um novo poço de uma placa de 6 poços.
    5. Adicionar 2 ml de 37 ° C a cada 3-4 dias SCM, e mudar completamente meio cada 7 dias.
    6. Se neuroesferas são> 100 um de diâmetro, dissociar cuidadosamente com solução de dissociação de células estaminais e replate NSC à densidade celular desejada.
  5. A indução de recombinação genética
    1. Adicionar 1 ml de 37 ° C, contendo 1 ul SCM> 10 10 pfu / ml de Ad5CMVCre ou Ad5GFAPCre para o 2 ml de SCM actualmente nas células. CUIDADO: Use as precauções de segurança ao manusear BSL2 adenovírus recombinante.
    2. Incuba-se durante 6 horas a 32 ° C em 5% de CO 2.
    3. Transferir SCM com neurospheres em um tubo de 15 ml e deixe esferas resolver pela força da gravidade para 5 min.
    4. Retirar o sobrenadante em primeiro lugar com uma pipeta de 1 ml, em seguida, com uma pipeta de 200 uL. CUIDADO: Use as precauções de segurança ao manusear BSL2 adenovírus recombinantes e descartar a mídia que contém o vírus por regulamentos institucionais.
    5. Adicionar 2 ml de 37 ° C SCM sem vírus para o NSC, em seguida, transferir para uma placa de 6 poços. NOTA: Para 5 culturas NSC, passos 2.5.1-2.5.5 terá ~ 15 min excluindo a incubação de 6 horas.
    6. No dia seguinte, repetir os passos 2.5.1-2.5.5, seguido por neuroesfera passaging quando necessário. As esferas podem agora ser ampliado para 2-3 passagens antes de caracterização in vitro e injeção ortotópico no cérebro do rato in vivo. NOTA: Determinar a presença de mutações na sequência Cre-recombinação por PCR com primers específicos para o gene recombinado ou por imunomanchas, quer para a proteína mutada ou as suas consequências específicas de sinalização. O tempo necessário para a estabilização fenotípica das culturas NSC após recombinação Cre-se ser dependentesobre as mutações utilizados e deve ser determinado empiricamente (Figuras 2 e 3).

3. injeção ortotópico de células recombinadas no cérebro de Destinatário Iimmunocompetent Ratos

  1. Preparação de 5% metil celulose
    1. Dissolve-se 5 g de 15 cPs metil-celulose em água destilada para um volume final de 50 ml em 100 ml de tampão de parafuso garrafa. Adicionar o pó lentamente enquanto se agitava a 4 ° C para evitar aglomeração. Pode levar-se a 24 horas de agitação a 4 ° C durante toda a celulose de metilo, para introduzir solução.
    2. Pesar o frasco e registrar o peso.
    3. Autoclave a solução de metilcelulose a 5%. Uma vez autoclavado, a metil-celulose irá tornar-se um gel semi-sólido.
    4. Pesa-se o frasco e calcular o peso perdido durante a autoclavagem.
    5. Assepticamente adicionar 1 ml de água estéril para cada grama de peso perdida.
    6. Coloque sobre o gelo e adicione 50 ml de gelo frias 2x DMEM.
    7. Misturar durante a noite utilizando um agitador magnético, a 4 ° C. Use uma técnica estéril para dividir a solução de metilcelulose a 5% em 20 ml de partes alíquotas. Armazenar alíquotas a 4 ° C por até seis meses ou até que o 2x DMEM expira. NOTA: Preparação de solução de metil-celulose a 5% em passos 3.1.1-3.1.7 terá ~ 2,5 dias.
  2. Preparação de Cortical astrócitos para Injeção
    1. Astrócitos corticais colheita, quando ~ 90% confluentes.
    2. Para a colheita, aspirado de DMEM completo e lava-se as placas com um volume igual de 37 ° C HBSS.
    3. Adicionar tripsina suficiente para cobrir a chapa. Incline e toque no prato até que as células começam a destacar.
    4. Inactivar a tripsina com um volume igual de 37 ° C completar DMEM.
    5. Transferir as células para um tubo de 50 ml e lava-se a placa com o mesmo volume de 37 ° C em DMEM completo usado 3.2.4.
    6. Transferência de mídia de lavagem para o tubo contendo células. Centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    7. Aspirar supernatant células e ressuspender em 1 ml de 37 ° C completar DMEM.
    8. Contagem de suspensão de células utilizando um hemocitómetro ou outro marcador de células apropriado para determinar o número de células / ul.
    9. Transferir o número desejado de células para um novo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    10. Ressuspender as células em 800 mL de 37 ° C completar DMEM. Determinar o volume do sedimento de células (o volume total de suspensão de células - 800 ul). NOTA: É essencial para alcançar uma concentração de células precisa injectável. Assim, o volume do sedimento celular deve ser determinada nessa fase, a fim de calcular o volume de 5% de celulose de metilo, para adicionar no passo 3.2.12.
    11. Transferir as células para um tubo esterilizado de microcentrífuga de 1,5 ml e depois centrifugar a 200 xg durante 3 min.
    12. Aspirar o sobrenadante do pellet celular e ressuspender os astrócitos corticais no volume adequado de gelado 5% de celulose de metilo (volume total desejado - volume dea pelete de células) para se obter o número desejado de células / mL.
    13. Colocar as células em gelo até injecção.
    14. Coloque uma seringa de vidro de 250 mL em um Antigen dispensador de repetição em seguida, coloque um contundente 18 G agulha na seringa.
    15. Retirar o êmbolo devagar com a agulha na suspensão de astrócitos cortical; haverá uma bolha de ar acima das células que devem ser removidas, uma vez que as bolhas de ar irá comprimir e reduzir o volume realmente injectada no cérebro.
    16. Manter a ponta da agulha imediatamente a suspensão acima dos astrócitos cortical e empurrar o êmbolo para dentro rapidamente. A bolha de ar se movem mais rapidamente do que a suspensão de células e será principalmente expulso.
    17. Repetir o passo 3.2.16 até que todas as bolhas de ar são removidas da agulha.
    18. Encha a seringa para cerca de ~ 200 mL, em seguida, mantenha a agulha para cima e puxar o êmbolo para trás até que ele pare. Pequenas bolhas de ar podem ser removidos, mantendo a ponta da agulha para cima e empurrando o êmbolo se rapidamente em cerca de 50 ul então lentamente retirando a plena capacidade.
    19. Mantenha a ponta de pé e repita o passo 3.2.18 4-5x.
    20. Descarte a agulha de calibre 18 e encaixar uma agulha 27 G na seringa.
    21. Pressione o botão no dispenser antigénios até que o fluido é expelido a partir da agulha. NOTA: Para obter uma linha de células de astrócitos, as etapas 3.2.1-3.2.21 terá ~ 60 min.
  3. Preparação do NSC para Injeção
    1. Quando neurospheres forem> 100 m de diâmetro, a transferência para tubos de 15 ml e deixar os neurospheres resolver pela força da gravidade para> 5 min.
    2. Remover o sobrenadante e se dissociam as neuroesferas com um reagente de dissociação suave, tal como solução de dissociação de células estaminais ou Accutase de acordo com as instruções do fabricante ou com 0,05% de tripsina-EDTA como descrito 42.
    3. Inibir os reagentes de dissociação de acordo com as instruções do fabricante, sem expor o NSC soro. Centrifugar a 100 xg por 5 min.
    4. Aspirar o sobrenadante, em seguida, voltar a suspender as células em 1 ml de 37 ° C cHBSS para gerar uma suspensão de célula única.
    5. Contar as células utilizando um hemocitómetro ou outro marcador de células apropriado para determinar o número de células / ul.
    6. Transferir o número desejado de NSC para um novo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 100 xg por 5 min.
    7. Ressuspender as células em 800 ul de 37 ° C HBSS. Determinar o volume do sedimento de células (o volume total de suspensão de células - 800 ul). NOTA: É essencial para alcançar uma concentração de células precisa injectável. Assim, o volume do sedimento celular deve ser determinada nessa fase, a fim de calcular o volume de 5% de celulose de metilo, para adicionar no passo 3.3.9.
    8. Transferência das células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril e depois centrifugar a 100 xg durante 5 min.
    9. Aspirar o sobrenadante e acabar de preparar as células para injeção ortotópico como em 3.2.12-3.2.21. NOTA: Para obter uma linha celular NSC, passos 3.3.1-3.3.9 terá ~ 60 min.
  4. Preparação do mouse para Injeção
    1. Anestesiar o animal receptor por meio de uma injecção IP de 250 mg / kg de Avertin (2,2,2 tribromoetanol) ou 100 mg / kg de cetamina, mais 10 mg / kg de xilazina, por orientações IACUC institucional. NOTA: aqui utilizados são ratos em 3-6 meses de idade como anfitriões aloenxerto. Ratos em idades diferentes podem ser utilizados para investigar o impacto microambiental da idade do desenvolvimento cerebral na tumorigênese.
    2. Raspar o couro cabeludo sobre o local da incisão com cortadores ou tesouras.
    3. Esteriliza-se o local cirúrgico com 3 cotonetes alternados de etanol a 70% e betadine.
    4. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar qualquer dano devido à perda de piscar reflexo.
    5. Avaliar profundidade da anestesia por interdigital (tep pitada) de reflexo. NOTA: Para 5 ratos, os passos 3.4.1-3.4.5 terá ~ 15 min.
  5. Implantação Ortotópico
    1. Prenda o animal no quadro estereotáxico.
    2. Makum e uma incisão ao longo da sutura sagital de aproximadamente 0,5 cm de comprimento entre os olhos e ouvidos.
    3. Localize o ponto de intersecção das suturas coronal e sagital (bregma), bem como a intersecção das suturas lambdóide e sagital (lambda). Certifique-se de que a Bregma e Lambda estão no mesmo plano horizontal.
    4. Introduzir a seringa que contém a suspensão celular e repetindo antigénio dispensador para a moldura estereotáxica sobre a cabeça. Traga a ponta da agulha 27 G em contacto com bregma. Esta é a origem que irá ser utilizado para a manipulação de coordenadas tridimensionais.
    5. Levante a agulha um pouco fora da superfície do crânio e mover 2 mm lateral e um milímetro rostral do Bregma.
    6. Abaixe a agulha com cuidado através do crânio para seu mm ventral de Bregma destino 4. NOTA: Nós utilizamos estas coordenadas estereotáxica para atingir os gânglios basais. Diferentes coordenadas estereotáxica pode ser utilizada para investigar o impacto de diferentes microambientalregiões do cérebro na tumorigênese.
    7. Injectar 5 ul da suspensão de células através da activação do dispensador de repetição do antigénio uma vez. Deixar a agulha no lugar durante 2 minutos para permitir que a pressão intracraniana para equilibrar.
    8. Retirar a agulha lentamente ao longo de um período de 30 seg. Utilize um cotonete para aplicar pressão sobre qualquer sangramento que possa ocorrer.
    9. Aproximar as bordas da ferida e fechar a incisão com cola de tecido. Administrar 20 ul de lidocaína por via subcutânea no local da incisão. NOTA: Para 5 ratos, os passos 3.5.1-3.5.9 terá ~ 50 min. A UNC IACUC aprovou o uso pós-operatório de anestesia local apenas. Consulta com IACUC institucional local é recomendado em relação aos requisitos para uso de analgésicos no pós-operatório após este procedimento.
  6. Cuidados pós-cirúrgicos
    1. Coloque os animais em um ambiente limpo, quente gaiola para se recuperar. Os animais não devem ser colocados diretamente na cama, como pode ocorrer aspiração acidental.
    2. Observe oanimais para a retomada de um comportamento normal, como aliciamento, alimentação e defecação. NOTA: Retomada do comportamento normal pode demorar ~ 60 min.

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Resultados

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Foi desenvolvido um sistema de modelo nGEM com astrócitos corticais e NSC colhidas de abrigar GEM neonatal floxed alelos oncogênicos condicional que pode ser fenotipicamente caracterizados in vitro e in vivo (Figura 1). A fim de investigar os efeitos de mutações oncogénicas especificamente em astrócitos do córtex in vitro, que é crítico para o primeiro enriquecimento em astrócitos. Colheitas de astrócitos corticais conter uma mistura de microglia, astrócitos, oligodendrócitos, neurónio...

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Discussão

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Os passos mais críticos para assegurar a colheita e a cultura de astrócitos do córtex são 1) adequada para excisar o córtex sem tomar tecido abaixo do corpo caloso, 2) para remover as meninges, 3) para dissociar completamente as células, e 4) para o enriquecimento para a GFAP + astrócitos. Embora utilizando mecânica (agitação), e genética (restrição de recombinação genética com um vector Ad5GFAPCre ou utilização de um transgene transformadora dominante (TgGZT 121) sob o controlo do promoto...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM é um Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. Este trabalho foi apoiado, em parte, por doações ao CRM da Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Departamento de Defesa (W81XWH-09-2-0042) e Fundo de Pesquisa do Câncer da Universidade da Carolina do Norte (UCRF). Os autores gostariam de agradecer a Daniel Roth pela assistência na criação de ratos. Os autores também gostariam de agradecer a Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette e Susannah Krom pela assistência na cultura de tecidos e imunofluorescência.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
O Meio de Águia Modificado (DMEM) (1X) da DulbeccoInvitrogen11995065DMEM também pode ser adquirido de outros fornecedores, incluindo GIBCOSigma e Cellgro
Fetal Bovine Serum, RegularCellgro35-010-CV
Penicilina-EstreptomicinaInvitrogen15140122
Tesoura de Dissecação de Ponta AfiadaFisher Scientific08-395
Pinça de Polegar de Cartilagem, CurvadaFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Estilo 1 Pinça de Joalheiro, Fina, 4Miltex17-301
Etanol (200 provas)Lâminas de Barbear Decon Labs2710
VWR55411-050
Solução de Sal Balanceada Hanks (HBSS) (1x), líquidoInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), Fenol VermelhoInvitrogen12605-010Outras soluções de tripsina também são adequadas para astrócitos corticais e cultura
Prato de Cultura, 60 x 15 mmTubos Thomas Scientific9380H77
15 ml BDBiosciences352096
Tubos de 50 mlBD Biosciences352070
Estoque de adenovírusTransferência de genes Vector Core, U. IowaAd5CMVCreStore em 5 µ l alíquotas a -80 °C. Perigoso. Use as precauções de segurança Bsl2
Sulfato de sódio (Na2SO4) Sigma-Aldrich238597
Sulfato de potássio (K2SO4)Sigma-Aldrich221325
Cloreto de magnésio (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Cloreto de cálcio (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
HEPES salde potássioSigma-AldrichH0527
D-(+)- GlicoseSigma-AldrichG8270 
Vermelho de FenolSigma-AldrichP3532
Hidróxido de Sódio (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainWorthingtonLS003127
L-Cisteína-HClSigma-AldrichC1276
(0.22 µ m tamanho dos poros)MilliporeSLGP033NS
Kit de proliferação Neurocult, mouseStemcell Technologies5702Este kit contém o suplemento NeuroCult NSC Basal Medium e NeuroCult NSC necessário para a cultura NSC
0,2% Solução de heparinaStemcell Technologies7980
EGF InvitrogenPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Sulfato de magnésio (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132Faça estoque de 10 mM em DMSO, armazene a -20 ° C
Placas de 6 poçosFisher Scientific07-200-83
Filtro de células (40 µ tamanho do poro m)Corning352340
Solução de dissociação de células-troncoStemcell Technologies5707Alternativamente, use soluções enzimáticas suaves como Accutase
Metilcelulose 15cP Sigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-BPara fazer solução de metilcelulose a 5%
1,7 ml Snap Cap Tubo de MicrocentrífugaCorning3620
Seringa Hamilton, 250 µ l LT sem agulhaFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Hamilton  83700
Agulhas descartáveis de 18 GFisher ScientificNC9015638
27 ga 1/2" agulha de ponta luerFisher Scientific14-826-48
2,2,2-Tribromoetanol (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BetadineFisher ScientificNC9386574
Puralube Pomada OftálmicaFisher Scientific
Quadro Estereotáxico Modelo 900Kopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 Adesivo de tecido 
Lidocaína ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQuo One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
Proteína Ácida Anti-Glial Anti-Glial de Coelho Policlonal (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerPara in vivo
imagem D-Luciferina - Substrato Bioluminescente de Sal K+PerkinElmer122796Para in vivo imagem de bioluminescência
Kit de imagem EdUInvitrogenC10340
MSCV Luciferase PGK-hygroAddgene18782
Filtro de seringa Dispensador de Antígeno NC9689910

Referências

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