Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito.
Artigo de método
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Fluorophores individuais podem ser localizados com precisão nanométrica usando FIONA. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado, e como a realização de experimentos Fiona é descrito.
Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy. Aqui um resumo da técnica FIONA é relatado e exemplos de pesquisas que têm sido realizados utilizando FIONA são descritas resumidamente. Em primeiro lugar, como configurar o equipamento necessário para experimentos de FIONA, ou seja, um total de microscopia de fluorescência de reflexão interna (TIRFM), com detalhes sobre o alinhamento da ótica, é descrito. Em seguida, como para realizar uma experiência simples fIONA em localizar moléculas imobilizadas com Cy3 de ADN individuais utilizando os protocolos apropriados, seguindo-se a utilização de fIONA para medir o tamanho do passo de 36 nm, de um único motor de miosina Va truncado marcado com um quantum dot, é ilustrado. Por fim, o esforço recente para estender a aplicação da FIONA para amostras espessas é relatado. Mostra-se que, utilizando uma objectiva de imersão em água e pontos quânticos embebido profundamente em sol-gel e córneas do olho de coelho (>200 mm), a precisão da localização 2-3 nm pode ser atingida.
Por volta de 1882, Ernst Abbe descobriu que a resolução de um microscópio de luz visível é ~ λ / 2NA, ou ~ 200 nm (onde λ é o comprimento de onda e NA é a abertura numérica) 1,2. Por conseguinte, qualquer objecto mais pequeno do que esta dimensão que aparecem como uma mancha de difracção limitada, no microscópio óptico. No entanto, é possível determinar o centro do ponto, isto é, a localização do objecto, com uma precisão muito superior 3. Imagens de fluorescência com uma precisão de um nanômetro (Fiona) é uma técnica simples, mas útil para localizar fluorophores individuais com precisão nanométrica no plano xy 4. A precisão da locali....
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Declaração de Ética: O tecido da córnea de coelhos foi coletado de acordo com a Universidade de Illinois Institutional Animal Care e Uso diretrizes.
Configuração 1 TIRFM
NOTA: Utilizar óculos de laser de segurança o tempo todo.
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A configuração típica TIRFM tipo objetivo é mostrado na Figura 3. Primeiro, amostra Cy3-DNA imobilizado na superfície foi fotografada. Uma imagem típica é mostrada na Figura 4a. A imagem foi feita com tempo de exposição de 0,5 seg, com ganho EM = 50 e sensibilidade CCD = 12,13 para a câmera. A função de espalhamento-ponto (PSF) de uma única molécula de DNA com Cy3 é mostrado na Figura 4b (a partir do local indicado pela seta da Figura 4-A), onde a barra.......
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Fiona é uma técnica para localizar a posição de um emissor fluorescente (fluoróforo orgânico ou quantum dot) com precisão nanométrica e resolução temporal de até 1 ms 4 a 8. Quando os fótons suficientes são coletados, esta técnica permite determinar a posição de um emissor fluorescente com muito mais precisão do que o limite de difração (~ 200 nm) e, portanto, esta técnica abre uma maneira de observar o que não tem sido visto com microscopia óptica convencional / tradicional 4 - 8. Desde sua invenç.......
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Este trabalho foi financiado pelo NIH Grants 068.625, Subsídios NSF 1063188 e Centro de Física de células vivas 0822613. agradecimentos especiais vão para o Dr. Marina Marjanovic no Instituto Beckman para Ciência Avançada e Tecnologia para o dom de olhos de coelhos.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fita dupla face | 3M | ~75 µ câmera EMCCD de m de espessura | |
| Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | ||
| Limpador ultrassônico | Branson | 2510 | |
| Conjunto de filtros de fluorescência | Chroma | 49016 | |
| Tampão de polimerização de actina | Citoesqueleto | BSA02 | |
| Biotina G-actina | Citoesqueleto | AB07 | |
| G-actina | Citoesqueleto | AKL95 | |
| Tampão de actina geral | Citoesqueleto | BSA01 | |
| (com driver) | Electro-Optical Products Corp. | SH-10-MP | |
| IDL | Exelis Visual Information Solutions | ||
| Neutravidin | Fisher Scientific | PI-31000 | |
| Lamínula | Fisherbrand | 22X30-1.5 | 0.16-0.19 mm de espessura |
| Lâmina | de microscópio Gold Seal Microslides | 30103X1 | 0.93-1.05 mm de espessura |
| Limpador de plasma | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Prato de fundo de vidro | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Cy3-DNA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio | |
| Fluorescent beads | Invitrogen | T-7280 | |
| Qdot 605-estreptavidina | Invitrogen | Q10101MP | |
| Qdot605 | Invitrogen | Q21301MP | |
| Qdot705 | Invitrogen | Q22021MP | |
| Qdot705 Kit de Conjugação de Anticorpo | Invitrogen | Q22061MP | |
| MATLAB | MathWorks | ||
| Mesa óptica | Newport Corp | RS4000 Series | |
| 60X Objetiva | Nikon | Plan Apo VC 60x WI | |
| 100X Objetiva | Olympus | PlanApo 100X/1.45 Objetiva de Óleo ∞/0.17 | |
| 60X Objetiva | Microscópio invertido Olympus | UPlanApo 60X/1.20W | |
| Olympus | IX71/IX70/IX81 | ||
| Origin | OriginLab | ||
| Anti-FLAG anticorpo | Sigma Aldrich | F7425-.2MG | |
| ATP | Sigma Aldrich | A7699 | |
| BME | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BSA-biotina | Sigma Aldrich | A8549-10MG | |
| CK | Sigma Aldrich | C3755 | Creatina Fosfoquinase do músculo de coelho |
| CP | Sigma Aldrich | P1937 | Fosfocreatina di (tris) sal |
| DTT | Sigma Aldrich | 43815 | DL-Dithiothreitol |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | Etilenoglicol-bis (2-aminoetiléter) -N, N, N ′, N ′ ácido -tetracético |
| HCl | Sigma Aldrich | 93363-500G | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| PCA | Sigma Aldrich | 03930590 | Ácido protocatecuico |
| PCD | Sigma Aldrich | P8279 | Protocatecuato-3,4-dioxigenase |
| TMOS | Sigma Aldrich | 341436-25G | Tetrametil ortosilicato |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 93363 | |
| Trolox | Sigma Aldrich | 238813 | 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxilico ácido |
| 1" de diâmetro dielétrico espelhos dielétricos de banda larga com montagens | Thorlabs | BB1-E02, KM100 | Quantidade: 2 |
| ½ ” postes de diâmetro | Thorlabs | TR4 | Quantidade ≥ 6 |
| expansores de feixe 10X | Thorlabs | BE10M-A | |
| Lente de 2" de diâmetro f = 300 mm com montagem | Thorlabs | LA1256-A, lente TIR LMR2 | |
| Alvo de alinhamento fluorescente | Thorlabs | ||
| Óculos de segurança a laser | Thorlabs | ) LG3 | |
| ND | Thorlabs | FW1AND | |
| Thorlabs | BP209-VIS | ||
| Diafragma de íris pós-montado | Thorlabs | ID25 | Quantidade: 2 |
| Interferômetros de cisalhamento | Thorlabs | SI100 | |
| XYZ, ½ ” viagem | Thorlabs | T12XYZ | |
| Laser | World Star Technologies | TECGL-30 | 532 nm, 30 mW |
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