Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

Resumo

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Resumo

O timo é um órgão vital para o desenvolvimento de linfócitos T. De células do estroma do timo, as células epiteliais do timo (TEC) são particularmente crucial em vários estágios de desenvolvimento de células T: compromisso de células T, de seleção positiva e negativa de seleção. No entanto, a função de TEC no timo permanece incompletamente compreendida. No artigo, nós fornecemos um método para isolar subconjuntos TEC de timo fresco rato usando uma combinação de ruptura mecânica e digestão enzimática. O método permite que as células do estroma de timo e de timócitos de ser eficientemente libertado a partir de células de células e ligações célula-matriz extracelular e para formar uma suspensão de célula única. Utilizando as células isoladas, multiparamétrica de citometria de fluxo pode ser aplicado para a identificação e caracterização de TEC e células dendríticas. Porque TEC são uma população rara de células no timo, que também descrevem uma forma eficaz para enriquecer e purificar a TEC, esgotando os timócitos, o tipo de célula mais abundante no timo. Folloala o enriquecimento, a selecção de células de tempo pode ser reduzida de forma que a perda de viabilidade das células pode ser minimizada durante a purificação de TEC. As células purificadas são adequados para diversas análises a jusante como o Real Time-PCR, Western blot e perfil de expressão gênica. O protocolo irá promover a investigação da função do TCE e, assim como o desenvolvimento de reconstituição in vitro de células T.

Introdução

No início do desenvolvimento das células T, de medula óssea hematopoiéticas derivadas de células progenitoras pluripotentes são recrutados para o córtex do timo, submetido a compromisso de linhagem T e tornar-se precursores de células T ^1. No córtex, precursoras de células T CD4 e CD8 duplo negativos (DN) timócitos expandir e diferenciar em imaturo CD4 e CD8 duplo positivo (DP) timócitos, formando uma grande piscina de progenitores com receptores de células T altamente variável ^1. Apenas um seleto subconjunto MHC-restrito de células DP vai se tornar único positivos (SP) timócitos CD4 ou CD8, migram para a medula do timo, e se diferenciar em célu....

Protocolo

Neste estudo, os adultos - foram usados ​​(6 8 semanas) do sexo feminino C57BL / 6. Ratos foram adquiridos no Instituto Nacional do Câncer e mantidos sob condições específicas livres de patógenos. A Universidade do Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional Minnesota (IACUC) aprovou toda a experimentação animal.

1 Preparação de Instrumentos e amortecedores

1. Preparar a solução de enzima (meio RPMI 1640 com 0.05% [w / v] de Liberase TH e 100 U / ml de DNase I), tampão rico em albumina (1X PBS, [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 + livre],} com 0,5% de soro de bovino albumina e 2 mM de ácido etilenodiamino tetra-acético [EDT....

Resultados

Usando este protocolo, um órgão timo foi removido a partir de um rato adulto (Secção 2) e uma suspensão de células do timo, foi preparado como descrito no ponto 3 a suspensão de células obtida consistiu de timócitos, células de estroma derivadas de hematopoiéticas e células estromais não hematopoiéticas. CD45 é um marcador de pan-hematopoiético expressos em ambos os timócitos e células do estroma hematopoiético, tais como macrófagos e células dendríticas. Em contraste, os TEC não são de origem hematopoiética e não expre.......

Discussão

No protocolo, os passos críticos são a preparação de células do estroma do timo (ponto 3) e o enriquecimento da TEC (Seção 4). É altamente recomendável que a solução enzimática fresca é preparada de cada vez e que o tecido é tratado o mais rapidamente possível. Para timos reunidas, optimizar o volume da solução de enzimas é necessária, dependendo do número de timos. Se qualquer resíduo de tecido é deixado após o processamento, a adição de mais solução enzimática e extensão do tempo de incubação poderia aumentar a produç.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-mouse EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-mouse MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-mouse Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Citômetro de fluxo	BD Biosciences	LSRFortessa
Classificador de células de fluxo	BD Biosciences	Tubos FACSAria
FACS	BD Biosciences	352052
Software de análise de citometria de fluxo	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varia de acordo com o fluorocromo e YY varia de acordo com o tamanho do frasco.