Artigo de método

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/51792

⸱

20 de setembro de 2014

 , 
1Department of Biology, Indiana University

Neste artigo

Resumo

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As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Resumo

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Uma parcela significativa do desenvolvimento pós-embrionário na mosca da fruta, Drosophila melanogaster, ocorre dentro de um conjunto de estruturas de saco-como chamados discos imaginais. Estes discos de dar origem a uma elevada percentagem de estruturas de adulto que são encontrados dentro da mosca adulta. Aqui nós descrevemos um protocolo que foi otimizado para recuperar estes discos e prepará-los para a análise com anticorpos, repórteres de transcrição e armadilhas de proteína. Este procedimento é o mais adequado para os tecidos finos como discos imaginais, mas pode ser facilmente modificado para utilização com tecidos mais espessos, tais como o cérebro adulto e ovário de larvas. O protocolo escrito e vídeo que acompanha irá orientar o leitor / espectador através da dissecção de larvas de terceiro estádio, a fixação de tecidos e tratamento de discos imaginais com anticorpos. O protocolo pode ser utilizado para dissecar discos imaginais de jovens larvas de primeiro e segundo instar, bem. A vantagem deste protocolo é de que é relativamente curta e tem seren optimizado para a preservação de alta qualidade do tecido dissecado. Outra vantagem é que o processo de fixação, que é empregue funciona bem com o número esmagadora de anticorpos que reconhecem as proteínas de Drosophila. Em nossa experiência, há um número muito pequeno de anticorpos sensíveis que não funcionam bem com este procedimento. Nessas situações, o remédio parece ser a utilização de um cocktail de fixação alternativo, continuando a seguir as orientações que temos estabelecidos para as etapas de dissecação e incubações de anticorpos.

Introdução

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Por mais de um século, a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido um sistema premier para estudar o desenvolvimento, comportamento e fisiologia. Desenvolvimento na mosca pode ser dividido em duas grandes etapas: embrionárias e pós-embrionárias com muito de este último ter lugar dentro de monocamada epitélios chamados discos imaginais 1-3. Desenhos de discos imaginais foram publicados pela primeira vez em 1864 por August Weismann como parte de sua ampla monografia sobre o desenvolvimento do inseto 1. Estes discos começam a se desenvolver durante a embriogênese, são modelados durante os estágios larvais, sobrev....

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Protocolo

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1 Preparação de Larvas

  1. Preencha de 35 mm placa de Petri com tampão dissecção.
  2. Coloque larvas em placa de Petri e permitir-lhes nadar por alguns minutos (etapa de auto-limpeza).
  3. Transferência das larvas para um tanque de tampão numa placa de dissecação dissecção à base de silicone. Esta associação deve situar-se a aresta da placa. A placa de dissecação consiste de uma solução de silicone, que foi vazada e endurecida dentro de uma placa de Petri de vidro.
  4. Usando uma pipeta de pasteur-, colocar um conjunto maior de tampão de dissecção no meio da placa de dissecação.
  5. Usando # 5 fórceps, transferir uma única larva limpo d....

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Resultados

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O método que é descrito acima, de forma fiável produz material de alta qualidade para a análise com sondas in situ, nos repórteres de transcrição, armadilhas de proteínas e anticorpos. Na Figura 1 exibir discos olho-de antena, genitais, asa, haltere e pernas que são rotineiramente recuperados com este método. Estes discos foram tratados com um fluoróforo faloidina-conjugado, que se liga à actina F e, por conseguinte, define cada célula. Se o tecido tiver sido fixado correctamente, então o sulco.......

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Discussão

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Embora este procedimento concentrou-se principalmente sobre o isolamento e tratamento subsequente dos discos de olho-antenais e que é passível de ser utilizado para isolar e analisar a asa, haltere, perna e discos genital (Figura 4). A única modificação necessária do protocolo para isolar estes discos (em oposição ao disco olho-antenal) é o método de dissecação grosseira (seção 2 do protocolo). A primeira perna (T1) par torácica é encontrada na anterior da larva e pode ser recuperado, seguindo o protoco.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer a Donald Pronto e Kevin Moisés para ensinar JPK o procedimento de dissecção disco imaginal original. Agradecemos também a Bonnie Weasner para o disco genital na Figura 1B eo disco olho na Figura 2A, Brandon Weasner para a Figura 3, a Bloomington Drosophila da Centro de manchas de moscas e de Estudos do Desenvolvimento Hybridoma Banco de anticorpos. CMS tem sido apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (NIH) GCMS Formação Grant (T32-GM007757), o Frank W. Putnam Research Fellowship, ea Research Fellowship Robert Briggs. JPK é suportado por uma concessão do National Eye Institute (....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184Dow Corning184 SIL ELAST KIT 0.5 KGUsado para criar base para placa de dissecação
Placa de Petri de Vidro Pryex 150 x 20 mmDow Corning3160-152COUse a tampa para placa de dissecação
#5 Pinça de DissecaçãoTed Pella525A pinça deve ser mantida muito afiada
9 bem vidro de relógioFornecedoresVairousUsado para fixação de complexos de discos imaginários
Frasco Erlenmeyer de 50 mlVários Fornecedores
Barra de Agitação PequenaVários FornecedoresPequeno o suficiente para caber no Frasco Erlenmeyer
Tubos Cônicos de 50 mlVários Fornecedores Tubos
Microfuge de 1,5 mlVários FornecedoresClaro ou Escuro dependendo da aplicação
Rackde MicrofugasVários fornecedores
bancadaVários fornecedores100 μ l volume não deve respingar em baixa configuração
ParaformaldeídoMacron Chemicals2-26555-1Serve como fixador
Fosfato de Sódio MonobásicoSigma Chemical CoS-3139Usado para fazer tampões de dissecação e lavagem
Fosfato de Sódio DibásicoSigma Chemical Co71636Usado para fazer dissecação e lavagem de tampões
LisinaAcros Organics125221000Usado na solução fixadora
Sodium PeriodateSigma Chemical CoS-1878Usado na solução fixadora
Triton X-100EMD ChemicalsMTX1568-1Usado para perfurar discos imaginais
Hidróxido de sódioEM ScienceSX0593-3Usado para dissolver paraformaldeído
100% Normal Goat SerumJackson Laboratories005-000-121Serve como uma solução de bloqueio
Anticorpos PrimáriosVários FornecedoresDiluir em soro de cabra a 10% conforme indicado pelo fabricante
Lamínulas de Vidro 18 x 18 mmFischer Scientific12-542A
Kimwipe TissueVários FornecedoresImpede que as lâminas de vidro adiram à base de silicone
Panit Brush 000Vários FornecedoresUse para abaixar suavemente a lamínula nas amostras
Rotador de Anticorpos Secundários Vários Fornecedores Diluir em soro de cabra a 10% conforme indicado pelo fabricante Sondas Moleculares Vectashield H-1000 Previne o branqueamento de amostras Lâminas de Microscópio Fischer Scientific 48312-003

Referências

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  1. Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
  2. Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).

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