Artigo de método

Dissecção e Imunocoloração do Imaginário discos de Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/51792

⸱

20 de setembro de 2014

 , 
1Department of Biology, Indiana University

Neste artigo

Resumo

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As estruturas adultas de Drosophila são derivadas de estruturas semelhantes a sacos chamadas discos imaginais. A análise desses discos fornece informações sobre muitos processos de desenvolvimento, incluindo determinação de tecidos, estabelecimento de limites de compartimentos, proliferação celular, especificação do destino celular e polaridade celular planar. Este protocolo é usado para preparar discos imaginais para microscopia de luz / fluorescente.

Resumo

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Uma parcela significativa do desenvolvimento pós-embrionário na mosca da fruta, Drosophila melanogaster, ocorre dentro de um conjunto de estruturas de saco-como chamados discos imaginais. Estes discos de dar origem a uma elevada percentagem de estruturas de adulto que são encontrados dentro da mosca adulta. Aqui nós descrevemos um protocolo que foi otimizado para recuperar estes discos e prepará-los para a análise com anticorpos, repórteres de transcrição e armadilhas de proteína. Este procedimento é o mais adequado para os tecidos finos como discos imaginais, mas pode ser facilmente modificado para utilização com tecidos mais espessos, tais como o cérebro adulto e ovário de larvas. O protocolo escrito e vídeo que acompanha irá orientar o leitor / espectador através da dissecção de larvas de terceiro estádio, a fixação de tecidos e tratamento de discos imaginais com anticorpos. O protocolo pode ser utilizado para dissecar discos imaginais de jovens larvas de primeiro e segundo instar, bem. A vantagem deste protocolo é de que é relativamente curta e tem seren optimizado para a preservação de alta qualidade do tecido dissecado. Outra vantagem é que o processo de fixação, que é empregue funciona bem com o número esmagadora de anticorpos que reconhecem as proteínas de Drosophila. Em nossa experiência, há um número muito pequeno de anticorpos sensíveis que não funcionam bem com este procedimento. Nessas situações, o remédio parece ser a utilização de um cocktail de fixação alternativo, continuando a seguir as orientações que temos estabelecidos para as etapas de dissecação e incubações de anticorpos.

Introdução

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Por mais de um século, a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido um sistema premier para estudar o desenvolvimento, comportamento e fisiologia. Desenvolvimento na mosca pode ser dividido em duas grandes etapas: embrionárias e pós-embrionárias com muito de este último ter lugar dentro de monocamada epitélios chamados discos imaginais 1-3. Desenhos de discos imaginais foram publicados pela primeira vez em 1864 por August Weismann como parte de sua ampla monografia sobre o desenvolvimento do inseto 1. Estes discos começam a se desenvolver durante a embriogênese, são modelados durante os estágios larvais, sobreviver à histólise maciça dos pupa primeiros, e, finalmente, dar origem a uma elevada percentagem de estruturas adultas que são encontrados dentro da mosca adulta 1-14. Durante o desenvolvimento larval cada disco faz várias decisões críticas sobre o destino, forma e tamanho. Dentro do primeiro e segundo estágios larvais, os discos têm a tarefa de adotar um destino primário, establishing limites dos compartimentos, adotando a forma correta e gerar o número necessário de células 15-16. Durante o terceiro estágio larval e início do estágio de pré-pupa, os discos imaginais continuam a se dividir e são modelados como células adotar seus destinos terminal 16.

Durante o início da história da biologia do desenvolvimento Drosophila, discos imaginais foram estudados quase exclusivamente no contexto do desenvolvimento normal e nos casos limitados em que a perda ou mutante ganho de função era viável. A utilização de Raios-X para induzir a recombinação mitótico permitido para mutações letais para ser analisada em clones de células no interior dos tecidos de larvas e de adultos. Este método tem sido melhorada através da introdução de métodos transgênicos para analisar a perda e ganho de função de mutações em ambos os tecidos larvais e adultas. O número de anticorpos, repórteres de transcrição e de proteínas armadilhas para descrever a paisagem molecular de tipo selvagem e mutantes de tecidos é também constantly crescente. Usando esses marcadores moleculares para analisar a perda e ganho de função clones de células mutante tornou cada vez mais viável para obter uma compreensão em tempo real de como as células mutantes se desviar de seus primos de tipo selvagem durante o desenvolvimento. Para aproveitar de forma adequada essas ferramentas e reagentes é fundamental ter preparações de alta qualidade de discos imaginais que podem ser vistos, fotografados e analisados. O objetivo deste manuscrito é proporcionar um protocolo optimizado para o isolamento e a preparação do complexo de disco olho-antenal (Figura 1A). Também pode ser utilizado com êxito para isolar uma grande variedade de discos adicionais, tais como aqueles que dão origem às asas, pernas halteres, T1-T3 e os órgãos genitais (Figura 1B-E). Este procedimento, com pequenas modificações, foi usado para isolar discos imaginais de Drosophila por quase 80 anos.

Como descrito acima, uma vez que a maioria dos genes são expressos durante multiple fases de desenvolvimento e de uma grande variedade de tecidos, ela é muitas vezes impossível para estudar os efeitos que os mutantes nulos tem em todo o olho, o animal morre muito antes do estágio de larva de terceiro instar. Quatro métodos de ter feito o estudo dos tecidos mais desenvolvidos, como a retina significativamente mais tratável. A primeira é o método flipase (FLP) / flipase Recombinação alvo (FRT) de geração de clones de células mutantes dentro de uma outra forma de tecido tipo selvagem 17-19. Neste exemplo, o tecido mutante é identificado pela ausência de um marcador visual tal como uma Proteína Fluorescente Verde (GFP) e pode ser comparado com o tecido circundante do tipo selvagem, em que está presente a GFP (Figura 2D). A segunda é o método "flp-out" em que um transgene é expresso numa população de células 20. Neste exemplo, os clones de células são identificadas pela presença de GFP e em comparação com o tecido circundante do tipo selvagem que não possui o repórter GFP (Figura2E). A terceira é a Análise mosaico com uma técnica de marcador de células reprimível (MARCM), que combina elementos do clone mutante FLP / FRT e sistemas de expressão flp-out 21. Com este método de um transgene podem ser expressas dentro de uma população de células que são simultaneamente mutante para um locus genético individual. Como os clones flp-out, MARCM clones são identificados pela presença de GFP e comparado com o tecido circundante do tipo selvagem que não possui o marcador GFP (Figura 2F). E, por fim, as construções de genes e de ARNi pode ser expresso em tecidos imaginais sob o controlo de construções de promotor GAL4-específicos. Estes quatro métodos têm aumentado o interesse em estudar discos imaginais desde clones ou padrões mutantes ou sobre-expressão pode ser directamente comparada com o tecido adjacente de tipo selvagem. O método descrito neste procedimento foi desenvolvido para que os pesquisadores que estudam o desenvolvimento pós-embrionário de tecidos adultos em Drosophila,particularmente aquelas derivadas a partir do disco de olho-antenais e será capaz de se obterem tecidos de alta qualidade para a análise. Embora os pesquisadores individuais fizeram pequenas modificações, o cerne deste processo (que descrevemos aqui) se manteve praticamente inalterado. Desde a obtenção de tecido de alta qualidade é fundamental para o estudo dos discos imaginais Esperamos que este protocolo escrito e vídeo que acompanha irá servir como um recurso valioso de ensino.

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Protocolo

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1 Preparação de Larvas

  1. Preencha de 35 mm placa de Petri com tampão dissecção.
  2. Coloque larvas em placa de Petri e permitir-lhes nadar por alguns minutos (etapa de auto-limpeza).
  3. Transferência das larvas para um tanque de tampão numa placa de dissecação dissecção à base de silicone. Esta associação deve situar-se a aresta da placa. A placa de dissecação consiste de uma solução de silicone, que foi vazada e endurecida dentro de uma placa de Petri de vidro.
  4. Usando uma pipeta de pasteur-, colocar um conjunto maior de tampão de dissecção no meio da placa de dissecação.
  5. Usando # 5 fórceps, transferir uma única larva limpo da pequena piscina para a maior piscina de tampão dissecção.

2. Grosso Dissecção de larvas

  1. Enquanto a larva ainda está dentro do grande grupo de tampão de dissecção apertar a larva com a pinça. Um par de pinças devem ser utilizados para agarrar os ganchos na boca, enquanto o outro par de pinças é usado para manter o animal ainda (pegue a larva suavemente a 1/3 do comprimento do corpo).
  2. Prender firmemente o par de fórceps contendo a cutícula perto dos ganchos na boca enquanto rapidamente puxando o resto do corpo de distância com o segundo par de fórceps.
  3. Quando a larva começa a rasgar você vai sentir uma ligeira liberação de tensão. Solte a larva do fórceps e permitir a "coragem" da larva para derramar. Isto permite que os discos imaginais de permanecer na sua conformação normal e os impede de se deformarem.
  4. Com um par de pinças de compreender os ganchos na boca de novo para manter a extremidade da frente da larva no lugar. Usando o outro par de fórceps remover a dois terços inferior das larvas, incluindo os intestinos internos. Nota: um complexo contendo os ganchos na boca, os discos de olho-antenal, hemisférios cerebrais, gânglio ventral, as glândulas salivares, alguns discos de perna, ea cutícula sobrejacente permanecerá.
  5. Com um par de fórceps remover suavemente a cutícula sobrejacente, glândulas salivares, os discos de perna eoutros tecidos. Nota: único tecido que deve permanecer é os ganchos na boca, olho-antenais discos, os hemisférios cerebrais, e gânglio ventral (Figura 3).
  6. Repita os passos de 2,1-2,5 com larvas adicional para 15-20 min. Nota: Os discos imaginais que permanecem no buffer de dissecção por longos períodos de tempo tendem a se degradar e, finalmente, será exibido com menos de espécimes ideais para ser fotografado. Assim, depois de um máximo de 20 min todos os tecidos dissecados deve ser transferido para o fixador de PLP (ver abaixo).

3 Fixação e coloração de tecidos com anticorpos

  1. Usando um Pipetman P-200, transferir os tecidos dissecados para um vidro de relógio contendo frio paraformaldeído-lisina-periodato (PLP) fixador. Limite de volume de tampão de dissecção transferidos para 50 mL para minimizar a diluição do PLP. Certifique-se de cortar a ponta com uma lâmina de barbear para que a abertura da ponta é grande o suficiente para acomodar os tecidos dissecados. Utilizando um par de pinças ouuma agulha de tungsténio assegurar que os tecidos são dissecados completamente submerso na ordem para a fixação adequada para ocorrer. Incubar tecidos dissecados em fixador PLP frio durante 45 min. Esta incubação pode ter lugar à temperatura ambiente sem agitação.
  2. Usando um Pipetman P-200, transferir os tecidos dissecados para tampão de lavagem (RT), utilizando um outro ponta amarela corte durante 45 minutos. Limite de Volume de PLP transferidos para 50 mL para minimizar a diluição do tampão de lavagem. Nota: todos os tecidos dissecados deve ser completamente submerso.
  3. Transferir 20-30 conjuntos de tecido dissecado de 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Nota: se um maior número de complexos de discos oculares-antenais são combinados dentro do tubo, existe uma possibilidade de que o tecido na parte inferior do tubo não serão correctamente exposto para os anticorpos. Para melhores resultados, no máximo, 20-30 complexos disco olho-antenas devem estar presentes em um único tubo. O tecido dissecado vai assentar no fundo do tubo de microcentrífuga. Etapas Portanto, em subseqüentes usi, uma pipeta para retirar e substituir o tampão de lavagem, a solução de bloqueio, e os anticorpos.
  4. Remover o tampão de lavagem e substituir com 100 ul de solução de bloqueio: 10% de soro normal de cabra em tampão de lavagem. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave sobre um tampo de mesa rotador durante 10 min.
  5. Retirar solução de bloqueio e substituir com 100 ul de anticorpos primários que tenha sido apropriadamente diluído em 10% de soro de cabra normal. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave durante 16 horas.
  6. Remover os anticorpos primários e substituir com 750 ul de tampão de lavagem. Colocar os tubos em um nutator e permitir a nutate à TA durante 10 min. Nota: O anticorpo primário pode ser guardado (armazenar a 4 ° C) e depois reutilizado. Reutilizar anticorpos várias vezes pode ajudar na redução da ligação não específica.
  7. Permitir cabeças para assentar no fundo do tubo, em seguida, remover o tampão de lavagem e adicionar 100 uL de anticorpos secundários que tenham sido apropriadamente diluído em 10% de soro normal. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave para 2̵1, 4 h.
  8. Retirar as soluções de anticorpo secundário a partir de tecido e substituir com 500 ul de tampão de lavagem. Permitir que o tecido se depositem no fundo do tubo.
  9. Usando um P-200 e uma ponta amarela corte, transferir todos os tecidos dissecados para uma piscina de tampão de lavagem que tenha sido colocado no prato de dissecação. Enquanto prosseguir com o próximo passo da dissecção fina, o tecido vai incubar em tampão de lavagem. Isto ajuda a remover o excesso de anticorpos secundários.

4. Belas Dissecção da Complexos Disco Eye-antenal e montagem em lâminas

  1. Use um par de pinças para apertar a cutícula pelos ganchos na boca com o lado ventral do complexo virada para baixo. Com um segundo par de fórceps remover os dois lobos cerebrais, fechando a segunda pinça no espaço entre os discos do cérebro e do olho (Figura 3, a seta vermelha) e puxando rapidamente o cérebro longe dos ganchos na boca.
  2. Embora continuando a agarrar os ganchos na boca, belisqueo tecido tão perto quanto possível a ligação entre a secção da antena do disco olho-antenais e os ganchos na boca (Figura 3, seta azul). Nota: os complexos de discos olho-antenas deve ser livre de todo o tecido (Figura 1A). Continuar até que todo o tecido desejado desejado que pode ser colocado em lâminas foi dissecado. Este protocolo pode ser adaptado para isolar asa, haltere, perna e discos imaginais genital (Figura 1B-E).
  3. Adicionar dois pequenos pedaços de papel de seda (tamanho das lamelas) de aproximadamente 3. Além do prato de dissecação. Coloque uma lâmina de vidro sobre o prato - os dois pedaços de papel de tecido deve ser de acordo com as extremidades da corrediça. Isso impedirá que o slide de degola para a base de silicone do prato de dissecação.
  4. Usando um P-20 com uma ponta sem cortes, adicionar 9 ul de um agente anti-branqueamento para o meio da lamela de microscópio de vidro. Isto impede que o branqueamento do tecido quando visualizado com fluorescenteluz.
  5. Usando a mesma ponta sem cortes, reunir todos os discos olho-antenal e adicioná-los à gota de reagente anti-branqueamento. Minimizar a quantidade de tampão de lavagem que é transportado. Tentar limitar a quantidade de solução de lavagem de 10 ul ou menos.
  6. Use uma pinça para separar e espalhar-se os discos de olho-antenal dentro da gota de reagente anti-branqueamento. Permitir que os discos a incubar em reagente anti-branqueamento por vários minutos. Nota: Os discos ficará clara como o tecido absorve o reagente anti-branqueamento.
  7. Usando um pincel fino delicadamente abaixar uma lamela sobre a amostra. Isto evita a formação de bolhas de ar.
  8. Loja desliza a -20 ° C até que esteja pronto para ver os discos imaginais olho-antenais ou outros que utilizam luz ou microscopia fluorescente.

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Resultados

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O método que é descrito acima, de forma fiável produz material de alta qualidade para a análise com sondas in situ, nos repórteres de transcrição, armadilhas de proteínas e anticorpos. Na Figura 1 exibir discos olho-de antena, genitais, asa, haltere e pernas que são rotineiramente recuperados com este método. Estes discos foram tratados com um fluoróforo faloidina-conjugado, que se liga à actina F e, por conseguinte, define cada célula. Se o tecido tiver sido fixado correctamente, então o sulco...

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Discussão

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Embora este procedimento concentrou-se principalmente sobre o isolamento e tratamento subsequente dos discos de olho-antenais e que é passível de ser utilizado para isolar e analisar a asa, haltere, perna e discos genital (Figura 4). A única modificação necessária do protocolo para isolar estes discos (em oposição ao disco olho-antenal) é o método de dissecação grosseira (seção 2 do protocolo). A primeira perna (T1) par torácica é encontrada na anterior da larva e pode ser recuperado, seguindo o protoco...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer a Donald Pronto e Kevin Moisés para ensinar JPK o procedimento de dissecção disco imaginal original. Agradecemos também a Bonnie Weasner para o disco genital na Figura 1B eo disco olho na Figura 2A, Brandon Weasner para a Figura 3, a Bloomington Drosophila da Centro de manchas de moscas e de Estudos do Desenvolvimento Hybridoma Banco de anticorpos. CMS tem sido apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (NIH) GCMS Formação Grant (T32-GM007757), o Frank W. Putnam Research Fellowship, ea Research Fellowship Robert Briggs. JPK é suportado por uma concessão do National Eye Institute (R01 EY014863)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184Dow Corning184 SIL ELAST KIT 0.5 KGUsado para criar base para placa de dissecação
Placa de Petri de Vidro Pryex 150 x 20 mmDow Corning3160-152COUse a tampa para placa de dissecação
#5 Pinça de DissecaçãoTed Pella525A pinça deve ser mantida muito afiada
9 bem vidro de relógioFornecedoresVairousUsado para fixação de complexos de discos imaginários
Frasco Erlenmeyer de 50 mlVários Fornecedores
Barra de Agitação PequenaVários FornecedoresPequeno o suficiente para caber no Frasco Erlenmeyer
Tubos Cônicos de 50 mlVários Fornecedores Tubos
Microfuge de 1,5 mlVários FornecedoresClaro ou Escuro dependendo da aplicação
Rackde MicrofugasVários fornecedores
bancadaVários fornecedores100 μ l volume não deve respingar em baixa configuração
ParaformaldeídoMacron Chemicals2-26555-1Serve como fixador
Fosfato de Sódio MonobásicoSigma Chemical CoS-3139Usado para fazer tampões de dissecação e lavagem
Fosfato de Sódio DibásicoSigma Chemical Co71636Usado para fazer dissecação e lavagem de tampões
LisinaAcros Organics125221000Usado na solução fixadora
Sodium PeriodateSigma Chemical CoS-1878Usado na solução fixadora
Triton X-100EMD ChemicalsMTX1568-1Usado para perfurar discos imaginais
Hidróxido de sódioEM ScienceSX0593-3Usado para dissolver paraformaldeído
100% Normal Goat SerumJackson Laboratories005-000-121Serve como uma solução de bloqueio
Anticorpos PrimáriosVários FornecedoresDiluir em soro de cabra a 10% conforme indicado pelo fabricante
Lamínulas de Vidro 18 x 18 mmFischer Scientific12-542A
Kimwipe TissueVários FornecedoresImpede que as lâminas de vidro adiram à base de silicone
Panit Brush 000Vários FornecedoresUse para abaixar suavemente a lamínula nas amostras
Rotador de Anticorpos Secundários Vários Fornecedores Diluir em soro de cabra a 10% conforme indicado pelo fabricante Sondas Moleculares Vectashield H-1000 Previne o branqueamento de amostras Lâminas de Microscópio Fischer Scientific 48312-003

Referências

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