É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares

11.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/51810

⸱

8 de junho de 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

Neste artigo

Resumo

A diferenciação de células precursoras em osteoclastos é regulada por citocinas e fatores de crescimento. Aqui, uma nova técnica de transferência de genes para diferenciação de osteoclastos in vivo e protocolos de cultura de células para diferenciar células precursoras em osteoclastos in vitro como um método para estudar os efeitos das citocinas na osteoclastogênese são descritos.

Resumo

A diferenciação e ativação dos osteoclastos desempenham um papel fundamental no desenvolvimento de doenças musculoesqueléticas, pois essas células estão envolvidas principalmente na reabsorção óssea. Os osteoclastos podem ser gerados in vitro a partir de células precursoras de monócitos/macrófagos na presença de certas citocinas, que promovem a sobrevivência e a diferenciação. Aqui, são demonstradas técnicas in vivo e in vitro, que permitem aos cientistas estudar diferentes contribuições de citocinas para a diferenciação, sinalização e ativação dos osteoclastos. O sistema de transferência de genes de entrega de DNA em minicírculo fornece um método alternativo para estabelecer um modelo relacionado à osteoporose é particularmente útil para estudar a eficácia de vários inibidores farmacológicos in vivo. Da mesma forma, protocolos de cultura in vitro para a produção de osteoclastos a partir de células precursoras humanas na presença de citocinas específicas permitem que os cientistas estudem a osteoclastogênese em células humanas para aplicações translacionais. Combinadas, essas técnicas têm o potencial de acelerar os esforços de descoberta de medicamentos para terapias direcionadas específicas para osteoclastos, o que pode beneficiar milhões de pacientes com osteoporose e artrite em todo o mundo.

Introdução

Doenças músculo-esqueléticas afectam milhões de pessoas nos Estados Unidos e apresentar conseqüências graves para os sistemas nacionais e locais de saúde 1. Estes distúrbios são caracterizados por perda de massa óssea e da função articular que requerem tratamento extensivo e longos períodos de recuperação. Vulgarmente, um aumento relativo no número e / ou actividade dos osteoclastos, as células especializadas para reabsorver osso, na osteoporose e artrite observadas é 2. Sob condições fisiológicas, o número e a actividade dos osteoclastos é regulada pelo activador do receptor do factor nuclear κ-B ligando (RANKL), o qual é produzido por osteoblastos. A osteoprotegerina (OPG), um receptor de engodo para RANKL também é produzido por osteoblastos três modelos animais in vivo que envolvem a sobre-expressão sistémica de sRANKL, ou deleção de OPG são muito valiosas na pesquisa de osteoporose.; No entanto, estes métodos requerem a geração de ratinhos transgénicos 4,5. Aqui, uma nova alternativaMétodo de overexpressing sRANKL para o estudo de desordens relacionadas com musculoesqueléticas é descrito. Especificamente, minicírculo (MC) a tecnologia de DNA e métodos de entrega hidrodinâmicas foram utilizadas para conseguir a transferência do gene de sRANKL in vivo e sobre-expressar rato sRANKL sistemicamente 6.

Este método também é complementar a outros modelos in vivo de osteoporose, tais como a modulação hormonal de osteoclastos seguintes ovariectomia 7 e a intervenção dietética com uma dieta pobre em cálcio 8. Estes modelos são muito úteis para estudar os diferentes aspectos de distúrbios osteomusculares relacionados ao porém eles necessitam de procedimentos cirúrgicos e pode demorar até vários meses, a um custo significativo 9. Ovariectomizadas (OVX) modelo de roedor é um modelo animal experimental em que a remoção dos ovários leva à deficiência de estrogênio imitando assim osteoporose pós-menopausa humana 10. Human osteoporose pós-menopausa, uma condição em que o estrogênio Deficiparência leva ao aumento do risco de fraturas ósseas e osteoporose afeta cerca de oito milhões de mulheres nos Estados Unidos. Embora o modelo de OVX é útil para a osteoporose pós-menopausa que oferece vantagens limitadas em estudar a osteoporose em geral. Estrogen suprime a perda óssea, induzindo a inibição de osteoclastos e osteoblastos apoptose, portanto, na sua ausência de um aumento da actividade dos osteoclastos é observada 10-12. A relação de desequilíbrio RANKL-OPG que favorece a reabsorção óssea também é observada 13. No entanto, a deficiência de estrogénio, in vivo, também é acompanhada por uma diminuição dos níveis de factor de crescimento transformante β (TGF β), o aumento da interleucina-7 (IL-7) e de TNF, IL-1 e IL-6, 14,15. Como estas citocinas conhecidas funções moduladores de remodelação óssea independente da via de RANKL, é impossível atribuir qualquer activação dos osteoclastos unicamente ao eixo RANKL-RANK. O modelo descrito neste trabalho permite aos pesquisadores estudar em vivo eixo RANKL-RANK na osteoclastogênese e perda óssea sem citocinas pró-inflamatórias em comparação com modelos de roedores OVX.

Além disso, técnicas in vitro osteoclastogênese são ferramentas essenciais para estudar a ativação dos osteoclastos para potenciais tratamentos terapêuticos de doenças músculo-esqueléticas. Estudos anteriores também mostraram que a cultura de medula óssea do rato macrófagos derivados (BMMs) com o mouse macrófagos fator estimulador de colônias (M-CSF) e mouse sRANKL pode levar a diferenciação de osteoclastos 3,16,17. Aqui, os protocolos de produção de células semelhantes a osteoclastos multinucleadas da medula óssea de rato, bem como a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) in vitro, 18 encontram-se descritos. Os ensaios baseados em células necessárias para definir um osteoclasto terminalmente diferenciadas e totalmente funcional madura também são descritas resumidamente. Estas técnicas in vitro complementar o romance em abordagem vivo e servem como pinstrumentos de investigação owerful para estudar a diferenciação dos osteoclastos e ativação. Utilizando estes sistemas, os cientistas são capazes de gerar os osteoclastos in vivo e in vitro e definir os estímulos e sinais necessários para a sua proliferação e activação, assim como testar a eficácia dos inibidores farmacológicos e biológicos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Entrega hidrodinâmica de sRANKL DNA MC

  1. Entrega hidrodinâmica via mouse cauda Veia
    1. Pesar o mouse antes da injeção veia da cauda. Diluir sRANKL ou proteína fluorescente verde (GFP) de MC em solução de Ringer (pré-aquecer a 37 ° C) em um volume total de ~ 10% do peso do corpo do rato.
    2. Aqueça o rato em uma gaiola por 10 min antes da injeção, a fim de dilatar os vasos sanguíneos e fazer nervuras laterais (VEs) visíveis. Monitorar o mouse com cuidado para evitar a desidratação e hipertermia.
    3. Assim que os VEs estão dilatados e visíveis, transferir o mouse para o limitador e insira a ficha longe o suficiente para o barril para conter o movimento. Monitorar o mouse para a atividade normal, como respirar. Ajuste a ficha do limitador, se necessário.
    4. Desinfectar a zona da injecção de 3/4 a partir da ponta da cauda com um algodão embebido em álcool. Use uma agulha G 27-30 para mouse injeção veia da cauda. Segure a cauda firmemente com uma mão e inserir a agulha emna veia da cauda. Aplique pressão na seringa e completar a injeção dentro de 5-7 seg.
    5. Retire a agulha da veia da cauda e aplicar pressão com uma bola de algodão no local da injeção para parar o sangramento. Monitorar o mouse por 15-30 min, em seguida, transferir o mouse de volta ao viveiro uma vez que a taxa de respiração é reduzida para a taxa normal.
  2. A confirmação da sistêmica Rato sRANKL Expressão e Quantificação de Rato Serum TRACP5b Mensagem Gene Transferência
    1. Aqueça o rato em uma gaiola por 5-10 min, a fim de dilatar os vasos sanguíneos e fazer LVs visível. Monitorar o mouse com cuidado para evitar a desidratação e hipertermia.
    2. Fazer uma pequena incisão com uma lâmina de cauda do rato num sítio uma frente a partir da ponta da cauda.
    3. Colete aproximadamente 100 mL de sangue em tubos de separação de soro.
    4. Incubar os tubos de separação de soro à temperatura ambiente durante 30 min.
    5. Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 5 minutos e recolher soro. Store soro de -80 ° C para posterior análise.
    6. Realizar sRANKL ELISA e ensaio do rato TRACP5b soro em amostras de soro usando um kit comercial disponível.

2. Geração in vitro de osteoclastos de rato BMMs

  1. O isolamento e cultura de BMMs
    1. Isolamento da tíbia e os ossos do fêmur: Eutanásia o mouse doador com CO2, e desinfectar as pernas com etanol 70%. Dissecar a partir do osso púbico até o osso calcâneo, para remover o fêmur ea tíbia ossos intactos.
    2. Retirar a pele e músculo cuidadosamente sem danificar o osso. Coloque fémur e tíbia processada em uma placa de Petri contendo tampão de fosfato salina (PBS).
    3. Remoção de medula óssea: Corte a ponta de um lado do fêmur e da tíbia ossos e expulsar da medula óssea em um tubo de 50 ml utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 25 G, carregado com α-MEM contendo 1% de penicilina / estreptomicina (Osteoclasto Meio de Cultura / OCM).
    4. Processo de medula óssea: Misturar e transferir a suspensão de medula óssea para um novo tubo de 50 ml por passagem através de um filtro de células de 70 mM de nylon. Centrifugar as células a 300 x g e re-suspensão em α-MEM contendo 1% de penicilina / estreptomicina e 10% de SBF (meio de cultura de osteoclastos / OCM (+)).
  2. Culturas de macrófagos
    1. Contar as células usando um hemocitômetro ou contador automático de células.
    2. Placa 1 x 10 6 culas por po para uma placa de 6 poços ou 3 x 10 5 células de lamelas de vidro (5 mm) ou fatias de dentina colocadas em placa de 96 poços e incuba-se a 37 ° C.
    3. Aspirar todo o meio contendo células não aderentes e as células incubar a 37 ° C com nova OCM (+) contendo 25 ng / ml de rato M-CSF durante 48 horas.
    4. Aspirar todos os meios e incubar as células a 37 ° C, com fresco OCM (+) mídia contendo 25 ng / ml rato M-CSF, e 30 ng / ml sRANKL mouse para iniciar a osteoclastogênese. Reabastecer media a cada 3 dias, conforme necessário.
    5. Cultivar célulasdurante aproximadamente 6-8 dias, para formar células gigantes multi-nucleares capazes de reabsorção óssea. Assim que as células multinucleadas aparecer, execute TRAP (fosfatase ácida tartarato resistente) coloração utilizando um kit comercial disponível, e quando totalmente amadurecido, realizar ensaios funcionais. Visualize anéis F-actina em lamelas usando mancha phalloidin e imagem das células aderidas à dentina fatias por microscopia eletrônica de varredura (SEM), como descrito anteriormente 19.

3. Geração in vitro de osteoclastos a partir de PBMC humanas

  1. Isolamento de PBMC Humano
    1. Adicionar 10 ml de pré-aquecido de Histopaque-1077 para um tubo de 50 ml.
    2. Filtro de leucócitos vazio obtido a partir do banco de sangue com PBS estéril para um tubo de 50 mL (proporção de 1:1 de sangue com PBS). Camada do sangue diluído sobre a solução histopaque muito lentamente, certificando-se de que o sangue não se mistura com o histopaque.
    3. Centrifugar as amostras a 1000 xg durante 20 min a 18 ° C. Seguiring centrifugação, cuidadosamente isolar a camada buffy coat branco que contém as células brancas do sangue e transferir para um novo tubo de 50 ml.
    4. Dilui-se as células com PBS e centrifugar novamente a 650 xg durante 5 min para recolher as células.
    5. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em OCM (-) media e contagem de células utilizando contador de células.
  2. Chapeamento e cultivando PBMCs
    1. Ressuspender as células em OCM (+) e meios de placa de 8 x 10 6 células / ml por poço numa placa de 6 poços ou de 1 x 10 6 células / ml por poço em placas de 96 poços. Células da placa em lamelas de vidro (5 mm), tal como exigido para imagiologia por imunofluorescência, bem como em fatias de osso adequadas para ensaios de reabsorção óssea, como previamente descrito 20.
    2. Alterar meios de cultura, repondo as células com M-CSF humano a cada 2-3 dias ou quando necessário. Em seguida, avance para o passo de diferenciação no dia 5 pela adição de 30 ng / ml de sRANKL humano junto com 25 ng ml M-CSF humano / no OCM (+) de mídia para iniciar osteoclastogenesé.
    3. Cultivar células em, aproximadamente, 14 a 21 dias para formar células gigantes multi-nucleares. Assim que as células multinucleadas aparecer, estas células podem então ser marcados de TRAP, e quando totalmente amadurecido, ensaios funcionais podem ser realizadas. Anéis de F-actina pode ser visualizado em lamelas utilizando faloidina mancha. A morfologia das células pode ser examinado em células ligadas à dentina fatias por SEM.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Aqui, uma técnica de transferência de gene novo para a diferenciação de osteoclastos in vivo e os protocolos de cultura de células para a diferenciação de células precursoras em osteoclastos in vitro, como um método para estudar os efeitos das citocinas em osteoclastogénese são descritos. Na Figura 1, os resultados representativos de transferência de gene bem sucedida da GFP e rato sRANKL MC em ratinhos são mostrados. Na Figura 2, as imagens representativas de medula ó...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Condições músculo-esqueléticas são as principais causas de morbidade e incapacidade e são compostas de mais de 150 doenças e síndromes; afetando cerca de 90 milhões de americanos hoje. Inflamação das articulações e destruição óssea são características predominantes de doenças músculo-esqueléticas, incluindo artrite e osteoporose. A osteoporose é uma condição que enfraquece a integridade óssea, muitas vezes levando a fraturas do osso. A artrite é uma doença crônica, debilitante doença caracterizada pela inflamação das ar...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

A pesquisa foi parcialmente apoiada pelas bolsas de pesquisa do NIH R01 AR062173 e SHC 250862 para a IEA. ES é o destinatário da bolsa de pré-doutorado NIH T32 CTSC.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
alpha-MEMLife Technologies 12561-056
M-CSF humanoMiltenyi Biotec130-096-492
Mouse M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
Humano RANK-Ligand - solúvelMiltenyi Biotec130-094-631
Mouse RANK-Ligand - solúvelMiltenyi Biotec130-094-076
Tailveiner Restrainer para camundongosBraintreeTV-150
TRANCE/RANK L/TNFSF11 R& D systemsMTR00
Kit de Fosfatase Ácida, Leucócitos (TRAP)Sigma387A
Ensaio MouseTRAP sistemas de imunodiagnósticoSB-TR103
Kit ELISA Quantikine para Mouse STD

Referências

  1. Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
  2. Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
  3. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
  4. Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
  5. Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
  6. Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
  7. Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
  8. Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
  9. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
  10. Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
  11. Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
  12. Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
  13. Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
  14. Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
  15. Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
  16. Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
  17. Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
  18. Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
  19. Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
  20. Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
  21. Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
  22. Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
  23. Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
  24. Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
  25. Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
  26. Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
  27. Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
  28. Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
  29. Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
  30. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
  31. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  32. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
  33. Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
  34. Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
  35. Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Diferencia o de OsteoclastosEntrega Hidrodin mica de GenesModelo de Osteoclastos In VivoGera o de Osteoclastos In VitroMacr fagos da Medula sseaOsteoclastos de PBMC HumanoMinic rculo do Ligante RANKSuplementa o de MCSFC lulas TRAP PositivasForma o do Anel de Actina F
A Novel In vivo Técnica Gene Transferência e In vitro Ensaios baseados em células para o Estudo da perda óssea em Distúrbios Osteomusculares
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.