Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Resumo

A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

Resumo

A maioria dos processos morfogenéticos no intestino fetal têm sido inferida a partir de lâminas finas de tecidos fixados, oferecendo instantâneos de mudanças ao longo do estágio de desenvolvimento. Informação tridimensional de cortes seriados finos podem ser difíceis de interpretar por causa da dificuldade de reconstrução de cortes seriados perfeitamente e manter a orientação adequada do tecido sobre cortes seriados. Recentes descobertas por Grosse et al., 2011 destacam a importância de três informações dimensional na compreensão morfogênese das vilosidades desenvolvimento do intestino ^1. A reconstrução tridimensional de células intestinais isoladamente marcadas demonstraram que a maioria das células epiteliais intestinais em contato com ambas as superfícies apicais e basais. Por outro lado, a reconstrução tridimensional do citoesqueleto de actina para a superfície apical do epitélio demonstrado que o lúmen intestinal é contínua e que lúmens secundários são um artefacto sectioning. Estes dois pontos, juntamente com a demonstração de migração nuclear interkinetic no epitélio intestinal, definido o epitélio intestinal em desenvolvimento como um epitélio pseudo estratificado e não como se pensava anteriormente ^1. A capacidade de observar o epitélio tridimensionalmente foi seminal para demonstrar este ponto e redefinindo morfogênese epitelial no intestino fetal. Com a evolução da tecnologia de imagem multi-fotão e software de reconstrução tridimensional, a capacidade de visualizar intacta, o desenvolvimento de órgãos está melhorando rapidamente. Dois fótons de excitação permite a penetração mais profunda menos prejudiciais para os tecidos com alta resolução. Dois fótons e reconstrução 3D de todo o intestino do feto de rato em Walton et al., 2012 ajudou a definir o padrão de vilo conseqüência ^2. Aqui nós descrevemos um sistema de cultura de órgão inteiro que permite ex vivo desenvolvimento de vilosidades e extensões desse sistema de cultura para permitiros intestinos para ser tridimensionalmente fotografada durante o seu desenvolvimento.

Introdução

Cada vilosidade intestinal é composta por dois compartimentos principais de tecido: uma camada superficial epitelial e um núcleo mesenquimal. O intestino delgado do camundongo é formado no dia embrionário 10, quando uma folha de endoderme se fecha e sela para formar um tubo de epitélio cercado por células mesenquimais³. Este tubo plano de epitélio sofre rápida proliferação, crescendo tanto em comprimento quanto em circunferência e sofre rearranjos dramáticos envolvendo mudanças dinâmicas na forma da célula¹. Ao mesmo tempo, o mesênquima circundante também passa por muitos processos de desenvolvimento, incluindo a formação do plexo vascular, a dif....

Protocolo

NOTA: Todos os camundongos foram tratados com humanidade usando protocolos aprovados pela Universidade de Michigan Medical School Unidade de Medicina Laboratorial Animal e de acordo com as orientações do Comitê da Universidade de uso e cuidados dos animais.

1. Whole sistemas de órgãos Cultura

1. Preparação de meios de comunicação e placas de cultura
   1. Em uma cultura capuz tecido, remover 5 ml de meio BGJb da garrafa estoque e adicionar 5 ml de Pen / Strep. Prepare um estoque de trabalho de mídia em um tubo de 50 ml, adicionando 1 ml de 5 mg / ml de ácido ascórbico a 49 ml de meio BGJb (com Pen / Strep).
   2. Preparar u....

Resultados

Culturas de explantes de intestino fetal inteiros permite a análise da localização, distribuição e duração das moléculas de sinalização que coordenam o desenvolvimento intestinal, como este sistema permite a manipulação da sinalização com reagentes farmacológicos ou proteínas recombinantes. O sistema de cultura Transwell (Figura 1A, reproduzido a partir de Walton et al., 2012) ² fornece uma interface ar-líquido, o que faz com que seja possível colocar droga ou proteína embebido esfer.......

Discussão

A natureza dinâmica e interações complexas de tecido do intestino desenvolvimento requer visualização 3D para ter uma apreciação plena desses eventos morfogenéticos. Com a evolução da tecnologia de imagem, a capacidade de examinar vilosidades morfogênese em detalhe está a desenvolver / melhorar e, com isso, a compreensão da comunicação espacial e interação durante a organogênese é bastante reforçada.

Os métodos alternativos para a cultura de intestinos inteiros foram também testados, mas o s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinça de dissecação fina	Ferramentas de Belas Ciências	11254-20	2 pares
de etanol
1x solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco estéril (DPBS)	Gibco	14040-133 Placas de	500 ml
de 6 poços	Costar	3516
Placas de 24 poços	Costar	3524
placas de Petri de 60 x 15 mm	Falcon
Placas Transwell, insertos de 24 mm, membranas de policarbonato de 8,0 mm	Corning Costar	3428	6 inserções por placa
BGJb media	Invitrogen	12591-038	500 ml
PenStrep (10.000U/ml Penicilina; 10.000 mg/ml Estreptomicina)	Gibco	15140
Ácido Ascórbico	Sigma	A0278	fazer 5 mg/ml de estoque, filtro, alíquota e armazenar a -20 & Pipeta
de boca C (montagem de tubo de aspirador Drummond 1-15 polegadas)	Fisher	21-180-10	remova o conjunto do aspirador e substitua-o por um 1.000 µ l ponta da pipeta que atua como um adaptador para conectar uma pipeta Pasteur de vidro de 6 polegadas.
			de pasteur de vidro de 6 polegadas
Tubos Capilares	World Precision Instruments	TW100F-4	agulhas de puxar para 4
% Paraformaldeído	feito em 1 x PBS, pH para 7.3
cultura	Falcon
Tela de aço inoxidável de malha fina	comprada em loja
Membranas de policarbonato	Thomas scientific	4663H25	alternativamente, corte as membranas Corning Costar 3428 dos suportes transwell
Compra instantânea de cola	em loja de ferragens	à base de gel preferencialmente
placas de 35 x 10 mm	Falcon
7% de agarose	Sigma	A9414	prepare w/v em 1x DPBS, aquecendo para dissolver em um banho maria
minuciens	pinos Ferramentas de Belas Ciências	26002-20
Meio livre de vermelho de fenol (DMEM)	Gibco	21063-029
Xilazina (100 mg/ml)	AnaSed	139-236
Matrigel	BD	356231	matriz de membrana basal, fator de crescimento reduzido, sem vermelho de fenol
3-4% agarose	Sigma	A9414	preparar w/v em 1x DPBS, aquecimento para dissolver em banho-maria
Imagem de intestinos
Nome do Material/Equipamento Número de	Catálogo	da Empresa	Comentários/Descrição
vaselina	compra na farmácia		usada para fazer VALAP: partes iguais de vaselina, lanolina, parafina
lanolina	Sigma	L7387	usado para fazer VALAP: partes iguais de vaselina, lanolina, parafina
e parafina	Surgipath	39601006	usado para fazer VALAP: partes iguais de vaselina, lanolina, parafina
70% glicerol em 1 x PBS
Focus clear e Mount Clear	CelExplorer Labs Co.	F101-KIT
Compra de argila de modelagem	na loja
fita
aplicador de algodão, cotonetes
, moldes de plástico, 10mm x 10mm x 5 mm)	Tecido Tek;	4565
lamínulas de
			http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf
Microscópio confocal Leica SP5X	Leica		Usado para conduzir a imagem ao vivo
Suporte Leica DMI 6000	Leica		Usado para conduzir a imagem ao vivo
Meio de montagem aquoso (Prolongar Ouro)	Sondas Moleculares	P36930
Nome do Material/Equipamento Número de	Catálogo	da Empresa	Comentários/Descrição
Placa de 24 poços	Costar	3524
Triton X-100	Sigma	T-8787	usado para fazer Solução de permeabilização: 0,5% Triton X-100 em 1 x PBS
Soro			usado para fazer Solução de bloqueio: 4% Soro de cabra, 0,1% Tween20 em 1x PBS
Tween20	Sigma	Pág. 9416

70%451007Pipetas Placas de 353037de ferragens351008fixosde materiais de arte, dupla face, slides limpeza de laboratório Kimberly Clark 34155 limpeza de tarefa delicada sem fiapos Theiler staging chart  de cabra