Um novo modelo de Mild Traumatic Brain Injury para ratos jovens

Resumo

A técnica de queda de peso modificada é um procedimento fácil e econômico usado para a indução de lesão cerebral traumática leve em ratos juvenis. Esta nova técnica produz sintomatologia clinicamente relevante que avançará no estudo de lesão cerebral traumática leve (mTBI) e concussão.

Resumo

Apesar das evidências crescentes de que a infância representa um período de grande risco para lesão cerebral traumática leve (mTBI) de concussões relacionadas ao esporte, acidentes com veículos motorizados e quedas, um modelo animal confiável de mTBI não havia sido desenvolvido anteriormente para este importante aspecto do desenvolvimento. A técnica modificada de queda de peso emprega um impacto de relance na cabeça de um roedor que se move livremente, transmitindo aceleração, desaceleração e forças rotacionais sobre o cérebro. Quando aplicada a ratos jovens, essa técnica modificada de queda de peso induziu resultados comportamentais clinicamente relevantes que eram representativos da sintomatologia pós-concussão. A técnica é um procedimento de aplicação rápida com uma taxa de mortalidade extremamente baixa, tornando-a ideal para estudos terapêuticos de alto rendimento. Além disso, como o procedimento envolve uma lesão leve na cabeça fechada, ele pode ser facilmente usado para estudos de lesões cerebrais repetitivas. Devido à natureza simplista desta técnica e à biomecânica clinicamente relevante da fisiopatologia da lesão, a técnica de queda de peso modificada fornece aos pesquisadores um modelo confiável de mTBI que pode ser usado em uma ampla variedade de estudos comportamentais, moleculares e genéticos.

Introdução

Embora existam muitos métodos amplamente utilizados para a geração de moderada a grave lesão traumática do cérebro (TBI), muito poucas técnicas foram desenvolvidas para induzir leve, fechado ferimentos na cabeça em roedores. Devido ao fato de que leve traumatismo cranioencefálico (mTBI) é três vezes mais comum do que a lesão cerebral moderada e grave combinado ^1, é necessário um modelo confiável de mTBI para facilitar a investigação sobre fisiopatologia, os resultados neurobiológicos e comportamentais, e estratégias terapêuticas. Por exemplo, em parte devido às limitações dos modelos animais atuais ^2, na última década, houve mais de 200 falhou ensaios clínicos de medicamentos para o tratamento de TBI ^3. Quando os sistemas de modelagem são gerados para estudos de investigação de translação, a aplicabilidade dos resultados dependem da validade do modelo implementado. Para o estudo da mTBI / concussão, um modelo animal de confiança não apenas imitar a biomecânica forças responsável pela etiologia da lesão, mas também induzir sintomas consistentes com os relatados pela população clinicamente relevante. Além disso, porque as crianças estão em risco particularmente elevado para mTBI, sistemas de modelagem óptimos seria aplicável aos roedores jovens e jovens, em adição aos seus equivalentes adultos.

Análises biomecânicas das circunstâncias em que os atletas sofreram mTBIs ou lesões cerebrais concussivas indicam que os fatores preditivos mais críticos para lesão são aceleração cabeça rápido e impactos de alta velocidade ^4. A maioria dos modelos de roedores actualmente utilizados para a indução de TCE permitir pouco ou nenhum movimento da cabeça ⁵ (para revisão ver ^2). O modelo descrito aqui, proporciona um impacto de alta velocidade para a cabeça de um rato juvenil fisicamente desenfreada que é acompanhada por uma rotação de 180 ° e de queda livre que se aplica forças de aceleração / desaceleração de cabeça e no corpo do sujeito. Taqui são dois principais vantagens associadas a esta técnica de queda de peso modificado para a indução de mTBI. Primeiro, o modelo produz concussiva clinicamente relevante como sintomatologia sem causar qualquer dano evidente para o cérebro (para uma descrição completa de resultados comportamentais ver ^6). Também consistente com os relatórios clínicos da síndrome pós-concussão, esta técnica peso-drop modificado produz resultados heterogêneos. Embora os efeitos da mTBI são significativos, há uma variação substancial entre os roedores que passaram por um mTBI quando examinado em várias medidas de resultado. Em segundo lugar, o método permite o estudo de ⁷ mTBI repetitivo. Como a maioria dos modelos de TCE existentes provocado tais ferimentos graves, muitas vezes é difícil para induzir uma segunda lesão, e quase impossível estudar TBI repetitivo, sem grandes danos a todo o córtex.

Portanto, a razão primária para a utilização da técnica de queda de peso modificado para a inducção de mTBI é produzir uma lesão que representa mais de perto a fisiopatologia e sintomatologia de concussão e repetitivo TBI nas populações juvenis. Com o aumento da incidência de mTBI relacionado a esportes, quedas e acidentes automobilísticos, especialmente durante a infância, este modelo de roedor única de mTBI fornece aos pesquisadores uma ferramenta valiosa para o estudo de concussão-like lesão cerebral que pode ser facilmente aplicada a multiple-hit paradigmas.

Protocolo

Nota: Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Conselho Canadense de cuidados com animais e foram aprovados pela Universidade de Calgary, Comitê de Ética Animal Care.

1. Criação e Preparação animal

1. Encomende ratas prenhes de fornecedores de animais de laboratório padrão ou filhotes da raça em casa de acordo com protocolos de reprodução padrão.
2. Casa todos os animais com acesso ad libitum a comida e água, em um rato quarto habitação temperatura controlada (21 ° C), que é mantido em uma luz 12:12 hr: ciclo escuro.
3. Quando os filhotes chegar dia pós-natal 21 (P21), desmamar filhotes de suas mães e casa em grupos do mesmo sexo de 3 ou 4.

2. Defina-up de Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) Apparatus

1. Antes do início do procedimento, pesos moinho para a massa desejado (por exemplo, 150 g). Fixe firmemente um anel de metal para a extremidade superior do peso permitindo que a linha de pesca para ser fifixada para o peso.
2. Pontuação folha de estanho com uma lâmina afiada. Certifique-se de que a folha de estanho teve suporta o peso do corpo do rato mas não irá interferir com a aceleração do rato após impacto da cabeça com o peso.
3. Fita da folha de estanho marcado para o estágio em forma de U feito de plástico transparente (38 x 27 x 27 ^cm3), que contém uma esponja de recolha (38 x 25 x 15 cm ³⁾ (Figura 1), de modo que é esticada.
4. Coloque a fase de plástico em forma de U na posição correcta por baixo do tubo de guia feita de plástico transparente.
5. Segure o tubo guia de plástico (2,2 cm de diâmetro x 1,5 m) no lugar com um suporte de tripé e posicionar o tubo guia de modo que é de 3,5 cm acima da folha de estanho marcou.
6. Coloque a linha de pesca, através do anel de metal para assegurar que o peso da parte inferior do peso pendura livremente 2,5 centímetros acima da folha de estanho marcado.
7. Fixe firmemente a linha de pesca para o suporte de fixação.
   NOTA: Amarrar o peso para o clamp suporte a uma altura de 2,5 cm acima da folha de estanho evita re-hits enquanto o rato está caindo do impacto para a esponja de coleção).
8. Puxe o peso para cima através do tubo guia de plástico com a linha de pesca e mantê-lo no lugar com um pino de chave allen em 1,0 m.

3. Indução de mTBI

1. Quando os ratos atingir P30 movimento gaiolas dentro da sala processual.
2. Coloque ratos em uma câmara de isoflurano e levemente anestesiar o rato até que ele não responde a uma pata ou cauda pitada.
3. Coloque rapidamente o rato peito para baixo sobre o papel alumínio marcou com a cabeça diretamente no caminho do peso cair. Veja a Figura 2. Se o rato começa a se mover ou wake-up antes de poder ser colocado no papel alumínio marcou, voltar para a câmara de isoflurano até que não responde a uma pata ou cauda pitada e começar de novo.
4. Puxe o pino chave Allen, permitindo que o peso a cair verticalmente através do tubo guia de plástico e bata no rato na cabeça. The rato serão submetidos a uma rápida rotação e terra 180 ° na posição supina.
5. Remover imediatamente o rato a partir da esponja coleção e aplicar lidocaína tópica para a cabeça do rato com um aplicador de algodão Pontas.
6. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma gaiola limpa, que é aquecida por defini-lo em cima de uma almofada de aquecimento disponíveis comercialmente.
7. Usando um cronômetro ou timer digital adquirir o "time-to-right". Tempo para a direita é o tempo que o rato para acordar da anestesia e virar a partir da posição deitada para a posição prona ou comece a caminhar.
8. Retorne o rato para sua gaiola de casa depois de ter recuperado o comportamento normal (aparência, andar, explorar, etc.).
9. Repita os passos de 3,2-3,8 para cada rato adicional exigindo uma mTBI.
10. Repita o procedimento no mesmo rato em vários pontos de tempo para experiências MTBI repetitivas.

4. A indução da lesão Sham

1. Levemente Anesthetize o rato com isoflurano até que ele não responde a uma pata ou cauda pitada.
2. Coloque rapidamente o rato peito para baixo sobre o papel alumínio marcou com a cabeça diretamente no caminho do peso cair.
3. Retire o rato da folha de estanho sem puxar o pino de chave allen do tubo guia de plástico e aplique lidocaína tópica para a cabeça do rato com um aplicador de algodão Pontas.
4. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma gaiola limpa, que é aquecida por defini-lo em cima de uma almofada de aquecimento disponíveis comercialmente.
5. Use um cronômetro ou timer digital para adquirir o "time-to-right".
6. Retorne o rato para sua gaiola de casa depois de ter recuperado o comportamento normal (aparência, andar, explorar, etc.).

5. Verificação de mTBI com o teste de caminhada de feixe ⁸

1. 24 h após a indução do mTBI ou animais sham lesão de retorno para o quarto processual.
2. Transfira os ratos a uma gaiola exploração limpoe colocá-home-gaiola do rato na extremidade mais estreita dos 165 centímetros afuniladas feixe de modo que a parte aberta da gaiola de casa enfrenta a extremidade mais estreita do feixe.
   NOTA: O feixe cônico é de 165 cm de comprimento. A plataforma central do feixe tem uma largura de 6 cm na extremidade larga e 1,75 cm na parte mais estreita. O feixe de centro tem bordas (2 cm de largura e 2 cm abaixo da viga central) que fornecem segurança quando deslizamentos pé do rato. Coloque enchimento de espuma abaixo do feixe para reduzir o risco de lesões nos ratos que podem cair fora do feixe durante o teste.
3. Coloque uma câmara de vídeo na ponta mais larga do feixe e da posição afunilada / aumentar a câmara de vídeo para assegurar que o investigador observar o vídeo pode ver claramente os movimentos do rato por todo o comprimento da viga afunilada.
4. Coloque o rato na grande final do feixe cônico e incentivá-la a atravessar o feixe de sua gaiola de casa. Quando o rato cruza o feixe cônico, deixar o rato em sua gaiola de casa por pelo menos 60 segundos para reinForce o local de destino. Esta experimentação é # 1 e não incluídos na análise.
5. Ligue a câmera de vídeo e permitir que o rato para concluir a tarefa feixe-walking 4 vezes adicionais (mantendo os períodos de reforço 60 seg na gaiola). Uma vez que o rato tenha completado todos os ensaios, o retorno do rato para sua gaiola de casa.
6. Para marcar, registrar o número de perna-pé deslizamentos traseiras que ocorrem eo tempo / duração para atravessar o feixe, para cada prova individual. Use esses dados para calcular o número médio de pernas traseiras pé-deslizamentos e tempo para atravessar o feixe para cada rato.

Resultados

A técnica de peso-gota modificado descrito acima é um método fiável para a indução de uma lesão cerebral traumática leve (mTBI) em ratos juvenis. Utilizando um peso impacto de 150 g, esta técnica tem sido aplicada com sucesso em ratos jovens que vão 50-120 g. Além disso, o procedimento pode ser facilmente repetido nos mesmos animais para o estudo de mTBI repetitivo. Embora os animais que passam por uma única exposição mTBI um aumento do tempo para a direita (Figura 3) e aparecem surpreendeu ao acordar, eles rapidamente retomar suas atividades normais e são visualmente indistinguíveis de animais feridos por simulação. Tendo em conta que a lesão é leve, lidocaína tópica que elimina qualquer dor associada com o impacto de olhar, é o único analgésico necessário. Isso é importante para a investigação como medicamentos para a dor são conhecidos por interferir com os processos inflamatórios e recuperação típicas. Devido à falta de sintomatologia evidente, a tarefa é um feixe de passeio fiável paraol que pode ser utilizado para validar a indução da mTBI. É importante notar, que nem todos os animais que experimentam uma mTBI exibirão défices na tarefa viga curta, mas como um grupo, os ratos juvenis com uma mTBI demonstrar significativamente mais traseiras da perna do pé-deslizamentos quando em comparação com ratos jovens com uma lesão simulada (Figura 4).

Outra característica chave desta técnica peso-gota modificado é a falta de contenção aplicada ao rato juvenil durante a indução da lesão. Ao entregar um golpe de raspão na cabeça seguido de rápida aceleração e desaceleração de rotação, este modelo representa mais de perto as forças biomecânicas atribuídos a mTBI e concussão. Quando este procedimento é aplicado a ratos jovens ou ratos adultos, as taxas de mortalidade são extremamente baixos (7/202 animais juvenis ~ taxa de mortalidade de 3,4%), e fratura de crânio e hemorragia intracraniana são excepcionalmente raros ^6,7. Além disso, o modelo produz sy clinicamente relevantemptomology. Roedores jovens que experimentaram um único mTBI demonstrou déficits de equilíbrio e motor comportamentos, juntamente com déficits de função executiva, o aumento de comportamentos de tipo depressivo, e interações sociais alterados ^6,9. Da mesma forma, camundongos adultos também apresentam equilíbrio e coordenação déficits leves que recuperar com o tempo ^7. Finalmente, a indução de mTBI usando este modelo requer anestesia mínima e não envolve preparação cirúrgica ou se esconder debaixo do crânio. Os resultados, portanto, não são distorcidos por efeitos inflamatórios ou imunológicos confusão desencadeada pela cirurgia ou anestesia. Além disso, o tempo de recuperação rápida e falta de feridas abertas permite o início de paradigmas de ensaio adicionais para ocorrer pouco depois de experimentar o mTBI roedores.

Figura 1: > C artoon representação da forma de U fase de plástico e esponja de recolha com todas as dimensões relevantes. Uma distância de 10 cm deve ser mantida entre a esponja de recolha e o início da fase de plástico para assegurar o rato juvenil tem tempo suficiente para completar os 180 rotação °.

Figura 2: (A) representação fotográfica da plataforma a indução da lesão. O rato juvenil é colocado no peito para baixo sobre o papel alumínio marcou de modo que a cabeça está diretamente abaixo do peso em queda. (B) Vista lateral da plataforma de indução da lesão. (C) demonstração fotográfica do peso usado na indução do mTBI .

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Figura 3: Representação gráfica das diferenças médias de tempo para a direita entre ratos jovens que experimentaram um único mTBI e ratos jovens que sofreram uma lesão sham (* p <0,01) Os ratos que receberam uma exposição mTBI um aumento significativo no. duração de tempo necessária para endireitar-se a partir da posição supina.

Figura 4: Representação gráfica do número médio de perna-pé deslizamentos traseiras expostas na tarefa Walking Beam por ratos jovens que experimentaram um único mTBI e ratos jovens que sofreram uma lesão sham (* p <0,05).

Discussão

Sistemas de modelagem confiáveis são necessários para cultivar efetivamente a pesquisa científica básica que tenha validade translacional significativa. Em resposta ao aumento das ocorrências e da mídia popular, a investigação de mTBI e concussão tornou-se uma prioridade em muitas disciplinas. No entanto, apesar do aumento da pesquisa, houve apenas melhorias incrementais nas estratégias terapêuticas e nas opções de tratamento ³. Essa falta de progresso pode ser parcialmente devido a uma discrepância entre os sistemas de modelagem empregados e a etiologia real da lesão. A maioria dos estudos utilizou modelos de roedores que não conseguiram reproduzir as forças biomecânicas importantes e a sintomatologia pós-lesão apropriada. A definição humana atual de mTBI especifica que a lesão resulta de forças de aceleração e desaceleração associadas a um trauma contuso ¹⁰. A técnica de queda de peso modificada descrita aqui é, portanto, um modelo ideal para o estudo de mTBI e concussão, pois usa um impacto de relance para causar rápida aceleração rotacional e desaceleração na cabeça de um animal desenfreado, imitando as forças biomecânicas identificadas em lesões relacionadas ao esporte e acidentes automobilísticos. Além disso, esse modelo é facilmente adaptado para examinar o mTBI repetitivo, um fenômeno que está emergindo como um sério problema médico e socioeconômico. Estudos indicam que roedores podem ser expostos a uma série de 10 mTBIs distintos com mortalidade mínima ⁷. Finalmente, o método é barato e pode ser realizado rapidamente, permitindo o exame de alto rendimento de muitos compostos terapêuticos e regimes de tratamento.

Assim como em qualquer técnica de procedimento, certos aspectos do protocolo são particularmente importantes para a geração de resultados confiáveis. Primeiro, a folha de estanho precisa ser pontuada de forma eficaz. Se a folha de estanho não for devidamente marcada, a força transmitida pelo peso durante o impacto do relance não será suficiente para impulsionar o rato juvenil através da folha de estanho para a esponja de coleta. Nessas situações, o rato permanecerá na posição inicial (peito para baixo na folha de estanho) e o mTBI resultará do trauma contuso do peso que impacta a cabeça estacionária, não da aceleração rotacional e desaceleração desejadas. Em segundo lugar, durante a indução do mTBI e da lesão simulada, o nível de anestésico aplicado a cada rato deve ser consistente. Devido ao fato de que o tempo para a direita é usado como marcador de mTBI, o pesquisador deve tentar garantir que os animais que recebem um mTBI e os animais que recebem uma lesão simulada sejam expostos a níveis semelhantes de anestésico. Uma grande vantagem dessa técnica em relação a muitos outros procedimentos de TCE é o baixo nível e duração da anestesiologia. No entanto, o rato juvenil não precisa responder a um beliscão no dedo do pé ou na cauda para garantir que não acorde no palco antes que a lesão seja induzida. Finalmente, para manter uma etiologia consistente da lesão, o posicionamento da cabeça do rato é particularmente importante. Idealmente, o peso deve impactar o centro da superfície dorsal da cabeça. Deve-se tomar cuidado para evitar posicionar o caminho do peso muito próximo à porção caudal/posterior da cabeça, pois o impacto do tronco encefálico e do cerebelo está associado ao aumento da mortalidade e da atividade convulsiva.

Com base na fisiopatologia biomecânica da indução de lesões e nos resultados comportamentais examinados, a técnica modificada de queda de peso parece ser um modelo confiável para a investigação de mTBI pediátrico e concussão. Embora estudos preliminares deste novo modelo tenham avaliado algumas mudanças moleculares e estruturais básicas ⁷ estudos futuros serão necessários para verificar como o cérebro responde a um mTBI com essa etiologia de lesão. Uma análise aprofundada das mudanças neuroanatômicas e biológicas que ocorrem no nível celular e epigenético aumentaria a validade do modelo e a aplicabilidade translacional. Além de estimular a geração de terapias farmacológicas direcionadas, entender as alterações fisiopatológicas que ocorrem no cérebro em resposta ao mTBI e à concussão também direcionaria a pesquisa relacionada a biomarcadores clínicos que têm a capacidade de prever resultados após a lesão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pesos de Latão	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Precisa ter um laço de metal preso à base
Alluminum Foil	Alcan		Disponível na maioria dos supermercados
Fita			Disponível comercialmente
		de Plástico em Forma de U	Construído por Suporte de
Grampo	Sigma-Aldrich	Z190357
Tubo Guia de Plástico			Pode ser construído ou comprado em uma loja de ferragens
Pescador de Linha de Pesca	10lb		Comprado de um varejista de artigos esportivos
Isoflurano	Parceiros Farmacêuticos do Canadá	DIN 02237518	Inalação Anestésico
Lidocaína Tópica (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotonetes			disponíveis comercialmente
Almofada de Aquecimento - 3 configurações de			Disponível comercialmente
Cronômetro	Sportline	L303	Comprado de um varejista de artigos esportivos
Câmera de vídeo	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Machos e fêmeas encomendados aos Laboratórios Charles River e filhotes criados internamente
Balance Beam			Construído pelo Laboratório

de Mascaramento Suporte de Laboratório calor