In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

Resumo

Após a exposição a estressores ambientais específicos, o nematóide Caenorhabditis elegans sofre extensa plasticidade fenotípica para entrar em um estágio juvenil 'dauer' resistente ao estresse. Apresentamos métodos para a indução controlada e imagem da neuroplasticidade durante o dauer.

Resumo

Os mecanismos que controlam a plasticidade fenotípica induzida por estresse em animais são muitas vezes complexas e difíceis de estudar in vivo. Um exemplo clássico de plasticidade induzida por estresse é a fase de Dauer C. elegans. Dauers estão numa fase de desenvolvimento larvar alternativa formada em condições de baixas concentrações de alimentos de bactérias e concentrações elevadas de uma feromona dauer. Dauers exibir extensa plasticidade do desenvolvimento e comportamental. Por exemplo, um conjunto de quatro quadrante interno-labial (IL2Q) neurônios passam por extensa remodelação reversível durante a formação Dauer. Utilizando a entrada de potenciais vias de regulação dauer bem conhecido, um método previamente estabelecido para a produção de dauer bruto feromona de culturas em larga escala de nematóides líquido é demonstrada. Com este método, uma concentração de 50.000 - 75.000 nemátodos / ml de líquido de cultura é suficiente para produzir uma altamente potente feromona dauer bruto. A potência de feromonas em bruto é determined por um bioensaio de resposta à dose. Por fim, os métodos utilizados para in vivo de lapso de tempo de imagem dos IL2Qs durante a formação Dauer são descritos.

Introdução

Plasticidade fenotípica, inclusive plasticidade do desenvolvimento e comportamental, é importante para as adaptações a condições ambientais adversas e é considerada uma força motriz na evolução ^1. C. elegans é um organismo modelo frequentemente utilizado para estudos em desenvolvimento e neurobiologia. Sob condições ideais, C. elegans, desenvolvido em quatro fases larvares antes de entrar na fase adulta reprodutiva. No entanto, em condições de baixa disponibilidade de alimentos e altas densidades populacionais, C. elegans pode sofrer uma chave de desenvolvimento e entrar em um estágio Dauer longa vida e estresse resistente ^2. Dauers exibir várias diferenças morfológicas e comportamentais de não-dauers que provavelmente medeiam esta resistência ao estresse. Os estímulos ambientais e vias genéticas que regulam a entrada Dauer têm sido amplamente descrito ^{3, 4, 5, 6, 7.} Contudo, os mecanismos moleculares que controlam alterações fenotípicas individuais que ocorrem dformação Dauer urante são menos conhecidas.

O exame de fenótipos específicos de Dauer requer a produção de animais dauer. Isto pode ser realizado de três maneiras: 1) colheita de uma cultura de C. fome elegans, 2) Utilização de formação dauer constitutiva (daf-c) mutantes, 3) indução da formação, através de feromonas dauer purificado. É relativamente simples para escolher dauers de uma placa com um padrão NGM C. população elegans que esgotou a sua bacteriana-abastecimento alimentar. Nas nossas mãos, uma placa NGM padrão originalmente semeada com 50 ul de OP50 Escherichia coli, deixou-se crescer durante 3 dias e em seguida inoculados com 3 - hermafroditas 4 adultos mantida a 25 ° C irá esgotar a fonte de alimento dentro de uma semana e produzem vários milhares dauers dentro de 3 dias adicionais (além de inúmeras não-dauers famintas). No entanto, este método não é satisfatório para os processos de exame que ocorrem durante a muda em dAuer. É difícil determinar qual dos vários milhares de animais em um prato típico faminto estão entrando em Dauer. Além disso, o uso de uma placa de fome oferece qualquer possibilidade de sincronização. A utilização de mutantes daf-c permite a sincronização e a geração segura de dauers. No entanto, não há qualquer garantia de que uma mutação daf-c em particular não irá afectar outros fenótipos específicos de Dauer sozinho ou em combinação com outras mutações.

A presença de um feromônio dauer estava implícito pela primeira vez por Cassada e Russell e mais tarde demonstrado por Dourado e Riddle. A feromona dauer já foi caracterizada quimicamente ^{2, 8, 9, 10.} A feromona purificado é constituído por uma mistura complexa de ascarosides, que em diferentes formas de regular a ambos os processos comportamentais e de desenvolvimento ^{9, 11.} Utilização de um extracto bruto de feromonas dauer permite a indução controlada fiável do dauers sincronizados num fundo de tipo selvagem.

O sistema nervoso e as células gliais associadas sofrer remodelação durante Dauer larva formação ^{12, 13, 14.} Algumas dessas mudanças são irreversíveis, como a remodelação das células da glia durante Dauer ^{13, 14.} Porém outros eventos de remodelação são reversíveis após um retorno à favorável condições ambientais. Por exemplo, um conjunto de quatro neurônios IL2Q sofrer remodelação neuronal rápida e reversível durante a formação Dauer incluindo: arborização dendrito, a transferência do único dendrítica de neurônios e axônios multidendritic remodelação ^12. Os métodos aqui permitem a imagiologia in vivo de confiança de neuroplasticidade induzida pelo stress num modelo de organismo. Os métodos apresentados para a produção e teste de feromona dauer bruto são descritos anteriormente e compilada a partir de várias fontes de ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocolo

1. Crude Dauer Feromônio Produção

1. Crescer OP50 E. coli a partir de uma única colónia O / N a 37 ° C, agitando, em 100 ml de caldo LB a 200 rpm. NOTA: Este cultura D / N pode ser feito com antecedência e guardadas a 4 ° C.
2. Crescer N2 C. elegans em junho 15-20 cm placas de Petri contendo ágar NGM (ver receita na Tabela 1) inoculadas com 50 ul de E. OP50 coli até que as bactérias está quase esgotada ^19.
3. Faça 5x 250 ml de S mídia (ver receita na Tabela 1) em 1 L frascos Erlenmeyer de ^19. NOTA: Esta solução pode ser feita com antecedência.
4. Crescer uma cultura de OP50 E. coli em 4 L de caldo LB S / N por meio da inoculação de 1 ml de OP50 em E. coli e agitação a 37 ° C durante 16 horas.
5. Lave os nematóides das placas (passo 1.2) com 1 ml de solução S basal (ver receita na Tabela 1) e nematóides de transferência de 4-5 placas em cada um dos quatro frascos de 1 L de Erlenmeyer com os meios de comunicação S preparada no passo 1.3 (4 5 placaspara cada frasco) ^19.
6. Centrifuga-se o passo de OP50 1,4 a 650 xg durante 10 min e remover o sobrenadante. Ressuspender cada sedimento bacteriano em 10 ml de solução de S basal. Transferir quantidades iguais de bactérias em suspensão para cada frasco de nematóides.
7. Colocar os frascos num agitador orbital, à temperatura ambiente (20 - 25 ° C) e 100 - 150 rpm durante 4-5 dias, até que a solução começa a limpar, indicando uma exaustão de alimentos.
8. Uma vez que a comida está esgotado, crescer outra cultura O / N de OP50 E. coli em 4x 1 L de caldo de LB. Centrifuga-se as bactérias a 650 xg durante 10 min e adicionar uma pelete a partir de um balão para cada um dos frascos S media com nematóides. Devolver os frascos S de mídia para o agitador orbital, como no passo 1.7, por mais 3-4 dias até que o alimento está esgotado novamente.
9. Tomar um ~ alíquota de 1 ml de solução de cada frasco e estimar a concentração de nemátodos por sub-amostragem de 1 ul de cada alíquota de 1 ml e a contagem do número de nemátodos. NOTA: Opopulação do nematóide deve ser 50.000 - 75.000 nematóides / ml. A esta concentração, a maior parte dos nemátodes são dauers.
10. Descarte qualquer frascos contaminados. NOTA: Contaminação frequentemente se manifesta como hifas fúngicas visto durante a etapa 1.9.
11. Nemátodos de centrifugar a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C. Desprezar o pelete nemátodo e reter o sobrenadante. Alternativamente, consulte a discussão para o uso desses animais para fazer um feromônio de baixa potência.
12. Filtrar o sobrenadante com # 1 filtro de papel Whatman. NOTA: uma garrafa térmica vai acelerar este processo.
13. Além disso filtrar o sobrenadante através de unidades de filtração de 0,45 um vácuo estéril. NOTA: O filtrado pode ser mantido O / N a 4 ° C ou prosseguir para 1,14.
14. Adicionar-se o filtrado para uma proveta de 2 L com uma barra de agitação. Coloque em um exaustor em uma placa de aquecimento mexa. Deixe ferver, mexendo e evaporar a cerca de 200 ml. Transferir a solução para um copo de 500 ml. Prosseguir a ebulição até cerca de 50 ml são lepés NOTA: Cuidados devem ser tomados durante este passo como é possível que a solução para transbordar. A cor dos finais de 50 ml é um castanho escuro. Em qualquer altura durante o processo de cozimento, o calor pode ser desligado e o filtrado foi armazenado O / N à temperatura ambiente ou a 4 ° C.
15. Deixar arrefecer e centrifugar durante 5 minutos a 1000 x g. Verter o sobrenadante para uma proveta de 100 ml e descartar o sedimento.
16. Ferva o sobrenadante até uma crosta marrom. Retire do fogo e quebrar a crosta com uma espátula. Adicionar suficiente de etanol prova 200 para cobrir a casca. Cobrir o copo com Parafilm e deixe descansar O / N à temperatura ambiente. Deitar fora o etanol em um copo limpo e colocado para o lado. Adicionar etanol fresco para cobrir a casca. Repita extrações O / N 3 vezes. Reúnem-se os extratos.
17. Usar uma bomba de vácuo para secar os extractos de etanol. Se uma bomba de vácuo não está disponível, adicionar o extracto de etanol para um recipiente limpo e quente a 50 ° C com agitação numa hotte. NOTA: Uma vez que o etanol tenha evaporado um resíduo pegajoso de lcor marrom ight deve permanecer. Se o aquecimento é usado, deve ser tomado cuidado para não queimar a solução por meio de aquecimento por muito tempo.
18. Dissolve-se resíduo em 10 ml de água destilada estéril. Filtro de esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 um e armazenar a -20 ° C em alíquotas de 1 ml. NOTA: 1 ml de água é utilizada para dissolver o resíduo, para cada 100 ml de cultura inicial de nemátodos líquido. Por exemplo, se um dos frascos de cultura líquido é rejeitado devido a contaminação, em seguida, ajustar a quantidade de água utilizada para dissolver o resíduo.

2 Determinação do Feromônio Dose Response

1. Prepare dauer feromona fazendo 6x 5 ml de meio de agar com NGM Noble, sem peptona, e suplementado com 50 ug / ml de sulfato de estreptomicina e uma gama de dauer feromona (ver receita na Tabela 1) ^{4, 19.} Misturar os componentes num 13x100 mm tubo de cultura de vidro, ferver mais um bico de Bunsen, em seguida, despeje em 3 centímetros placas de Petri.
2. Pesar amtubo icrocentrifuge. Adicionar 1 ml de cultura O / N do E. coli OP50 para o tubo e centrifuga-se a 17.000 x g ~ em um tubo de microcentrífuga. Remover todo o sobrenadante. Pesa-se o tubo de novo e determinar o peso do sedimento de bactérias. Ressuspender o sedimento com tampão M9 (ver receita na Tabela 1) para uma concentração final de 4% ^(w / _v). Aliquota de 10 ul da suspensão bacteriana sobre o centro de cada placa ⁴ de feromonas. Placas de loja O / N à temperatura ambiente.
3. Escolha 10-15 grávidas N2 do tipo selvagem hermafroditas, um dia após a muda até a idade adulta para as placas de feromônio ^4. Armazenar as placas a 25 ° C durante 3-4 horas.
4. Escolha fora de todos os hermafroditas adultos. Registre o número de ovos postos por cada placa. Selar as placas com parafilme e regresso a 25 ° C durante 3 dias ^17.
5. Contagem da percentagem de dauers (Figura 2). Nota: Para ambos os métodos, é importante notar que dauers (e, em menor extenda não dauers) vai subir as paredes e na tampa de placas de Petri. Por isso, é importante examinar todas as superfícies do prato para nematóides.
6. Ajustar os dados a uma curva de dose-resposta e calcular a concentração de _EC90 de feromona (feromona suficiente para induzir 90% de animais para formar dauers) como mostrado na Figura 3 Nota:. Nós normalmente utilizam um modelo de regressão logística para estimar a CE ₉₀ , mas diferentes pacotes de software de estatística pode ter métodos alternativos que produzem estimativas similares.

3 Imagens ao vivo de Dauer IL2 Neurônios

1. Prepare pratos Dauer feromônio como no protocolo 2, utilizando o valor de EC ₉₀ determinou na etapa 2.6.
2. Induzir dauers usando os métodos no protocolo 2 com uma cepa carregando um IL2 repórter transgene integrado (myIs13 [P _klp-6 :: GFP], myIs14 [P _klp-6 :: GFP], myIs16 [P _KLP-6 :: tdTomato] ou qIs56 [P _lag-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} NOTA: Se q Is56 é usada, a expressão de GFP não será visível nos IL2Qs até várias horas para a muda Dauer e alguns dos eventos de remodelação iniciais não será visível. Além disso, enquanto o sinal de fluorescência a partir do _{desfasamento P-2} :: transgene GFP em última análise, é mais brilhante nos IL2s durante dauer que os _{P-6 klp} repórteres fluorescentes, o _{desfasamento P-2} :: transgene gfp também fracamente expressa nos músculos da cabeça que pode mascarar os ramos IL2 finas.
3. Após a postura dos ovos, remover os hermafroditas adultos, selar as placas com parafilme e incubar durante 34 horas a 25 ° C ^17. NOTA: O período de tempo para a muda Dauer varia ligeiramente entre os indivíduos. O período mais rápido de dendrito arborização começa 4-5 horas após o início da muda Dauer (39-44pós h a 25 ° C) ^12, que estabelece-ovo.
4. O dia antes da imagem, formam uma solução de 10% ^(w / _v) de agarose em tampão M9 com dauer feromona para a concentração _EC90. Alíquota de aproximadamente 100 mL de agarose numa lâmina de microscópio e rapidamente, mas com cuidado, coloque outro slide na parte superior para criar uma superfície plana agarose. Após a agarose solidificou, enrole os slides em saran wrap e armazenar em uma câmara de umidade (caixa ponteira com papel-toalha molhada).
5. Após o período de incubação 34 h, examinar as placas de feromônio para nematóides que pararam de bombeamento da faringe. Lâminas separadas de tal forma que apenas uma superfície de uma lâmina de agarose tem nele. Escolher um ou mais nematóides numa almofada de agarose a 10% e 1 μ l de 0,1 micron esferas de poliestireno de ^22. NOTA: Com uma população bem sincronizados, a maioria dos nematóides sobre a placa será entrar na muda de L2D de dauer. No entanto, pode haver variação entre indivíduos. Por isso, é importante observar características adicionais (oclusão do estoma, a remodelação da faringe) para estimar a quantidade de tempo que os animais tenham sido dentro da muda Dauer (ver resultados representativos, por exemplo).
6. Determinar a orientação (esquerda / direita, dorsal / ventral) do nematóide. Capturar imagens Z-stack de um dendrito IL2Q em 100x com a menor intensidade de fluorescência possível a cada 15 minutos ou quando necessário para o experimento específico. Continue a captura de imagens até que o nematóide se separou da cutícula L2D e imobilização é impossível ou se o animal se recupera de Dauer (faringe começa bombeamento). Quando não imaginando ativamente, coloque o slide em uma câmara de umidade. NOTA: Nós usamos um microscópio de epifluorescência com uma motorizada contraste fase e de interferência diferencial (DIC) óptica.

Resultados

A produção de resultados Dauer bruto feromônio em um líquido amarelo (Figura 1) que é tanto calor e frio estável. Alíquotas de feromona bruto são armazenadas a -20 ° C indefinidamente sem qualquer perda na actividade óbvia. Após a produção da feromona, um único bioensaio de dose-resposta é suficiente para uma estimativa da potência. No entanto, para a maioria das experiências, é necessário repetir o bioensaio de 2 - 3 vezes e ter uma média de cada experimento. Os resultados representativos de dois ensai...

Discussão

Um exame de neuroplasticidade específicos de dauer e outras alterações morfológicas associadas à Dauer requer controlada e fiável a formação de dauers quer através de mutação genética (mutantes ou seja, daf-c) ou por exposição de animais de tipo selvagem de feromona. Enquanto a utilização de uma mutação genética para induzir dauers é conveniente, pode confundir os resultados. Assim, os dados coletados com mutações daf-C deve ser posteriormente confirmada com tipo selvagem animais induzidos a entrar na ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
N2 C. elegans Bristol cepa	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	A pedido do laboratório
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	A pedido do laboratório
JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Placas de Petri	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM ágar	Vários		3 g de NaCl, 17 g de ágar, 2,5 g de peptona em 975 ml H2O autoclavado resfriado a 55° C seguido de 1 ml de colesterol 5 mg/ml em etanol, 25 ml de tampão 1 M KPO4 (pH 6,0), 1 ml de CaCl2, 1 ml de M MgSO4
S	Vários		meios S consistem em solução basal S (1,46 g de NaCl, 0,25 g de K2HPO4, 1,5 g de KH2PO4, 0,25 ml de colesterol 5 mg/ml em etanol e H2O a 250 ml. Autoclavado.) À solução basal S adicionar 2,5 ml de citrato de potássio pH 6,0 (2 g de ácido cítrico mono-hidratado, 29,4 g de citrato tripotássico mono-hidratado, H2O a 100 ml, autoclavado), 2,5 ml de solução de metais traços (1,86 g de EDTA dissódico, 0,69 g de FeSO4  &touro; 7 H2O, 0,2 g MnCl2• 4 H2O, 0,29 g ZnSO4  &touro; 7 H2O, 0,025 g CuSO4  &touro; 5 H2O, H2O a 1 L. Autoclavado e armazenado no escuro), 0,75 ml de 1 M CaCl2 e 0,75 ml de 1 M MgSO4.
Placas de feromônio Dauer para ensaio dose-resposta	Various		Mix 0,085 g de ágar nobre, 0,5 ml de NaCl 0,513 M e 5 µ l de 5 mg/ml de colesterol dissolvido em etanol em cada um dos 6 tubos de cultura de 15 ml. Adicione feromônio bruto suficiente a cada tubo para criar uma faixa de concentrações. Adicione H2O para trazer o volume para 4.725 ml.  Ferva em um bico de Bunsen até que o ágar se dissolva e depois deixe esfriar a 55 ° C. Adicione 125 ° C. l 1 M KPO4 tampão (pH 6,0), 50 µ l 0,1 M CaCl2, 50 µ l 0,1 M MgSO4 e 50 µ l de 5 mg/ml de sulfato de estreptomicina para cada tubo.  Despeje o conteúdo de cada tubo em uma placa de Petri de 35 mm de diâmetro. Deixe o ágar-ágar solidificar em temperatura ambiente durante a noite (se for mais, armazene em recipiente fechado para evitar secagem excessiva).
Grânulos de microesferas de 0,1 mícron	Polysciences Inc.	00876-15
Tampão M9	Mistura diversa		3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Esterilizar por autoclavagem

SchroederSchroeder