In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

Resumo

Após a exposição a estressores ambientais específicos, o nematóide Caenorhabditis elegans sofre extensa plasticidade fenotípica para entrar em um estágio juvenil 'dauer' resistente ao estresse. Apresentamos métodos para a indução controlada e imagem da neuroplasticidade durante o dauer.

Resumo

Os mecanismos que controlam a plasticidade fenotípica induzida por estresse em animais são muitas vezes complexas e difíceis de estudar in vivo. Um exemplo clássico de plasticidade induzida por estresse é a fase de Dauer C. elegans. Dauers estão numa fase de desenvolvimento larvar alternativa formada em condições de baixas concentrações de alimentos de bactérias e concentrações elevadas de uma feromona dauer. Dauers exibir extensa plasticidade do desenvolvimento e comportamental. Por exemplo, um conjunto de quatro quadrante interno-labial (IL2Q) neurônios passam por extensa remodelação reversível durante a formação Dauer. Utilizando a entrada de potenciais vias de regulação dauer bem conhecido, um método previamente estabelecido para a produção de dauer bruto feromona de culturas em larga escala de nematóides líquido é demonstrada. Com este método, uma concentração de 50.000 - 75.000 nemátodos / ml de líquido de cultura é suficiente para produzir uma altamente potente feromona dauer bruto. A potência de feromonas em bruto é determined por um bioensaio de resposta à dose. Por fim, os métodos utilizados para in vivo de lapso de tempo de imagem dos IL2Qs durante a formação Dauer são descritos.

Introdução

Plasticidade fenotípica, inclusive plasticidade do desenvolvimento e comportamental, é importante para as adaptações a condições ambientais adversas e é considerada uma força motriz na evolução ^1. C. elegans é um organismo modelo frequentemente utilizado para estudos em desenvolvimento e neurobiologia. Sob condições ideais, C. elegans, desenvolvido em quatro fases larvares antes de entrar na fase adulta reprodutiva. No entanto, em condições de baixa disponibilidade de alimentos e altas densidades populacionais, C. elegans pode sofrer uma chave de desenvolvimento e entrar em um estágio Dauer longa vida e estresse resistente ^2....

Protocolo

1. Crude Dauer Feromônio Produção

1. Crescer OP50 E. coli a partir de uma única colónia O / N a 37 ° C, agitando, em 100 ml de caldo LB a 200 rpm. NOTA: Este cultura D / N pode ser feito com antecedência e guardadas a 4 ° C.
2. Crescer N2 C. elegans em junho 15-20 cm placas de Petri contendo ágar NGM (ver receita na Tabela 1) inoculadas com 50 ul de E. OP50 coli até que as bactérias está quase esgotada ^19.
3. Faça 5x 250 ml de S mídia (ver receita na Tabela 1) em 1 L frascos Erlenmeyer de ^19. NOTA: Esta solução pode ser feita com antecedência.
4. Crescer uma cultura de OP50 E. ....

Resultados

A produção de resultados Dauer bruto feromônio em um líquido amarelo (Figura 1) que é tanto calor e frio estável. Alíquotas de feromona bruto são armazenadas a -20 ° C indefinidamente sem qualquer perda na actividade óbvia. Após a produção da feromona, um único bioensaio de dose-resposta é suficiente para uma estimativa da potência. No entanto, para a maioria das experiências, é necessário repetir o bioensaio de 2 - 3 vezes e ter uma média de cada experimento. Os resultados representativos de dois ensai.......

Discussão

Um exame de neuroplasticidade específicos de dauer e outras alterações morfológicas associadas à Dauer requer controlada e fiável a formação de dauers quer através de mutação genética (mutantes ou seja, daf-c) ou por exposição de animais de tipo selvagem de feromona. Enquanto a utilização de uma mutação genética para induzir dauers é conveniente, pode confundir os resultados. Assim, os dados coletados com mutações daf-C deve ser posteriormente confirmada com tipo selvagem animais induzidos a entrar na .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
N2 C. elegans Bristol cepa	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	A pedido do laboratório
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	A pedido do laboratório
JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Placas de Petri	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM ágar	Vários		3 g de NaCl, 17 g de ágar, 2,5 g de peptona em 975 ml H2O autoclavado resfriado a 55° C seguido de 1 ml de colesterol 5 mg/ml em etanol, 25 ml de tampão 1 M KPO4 (pH 6,0), 1 ml de CaCl2, 1 ml de M MgSO4
S	Vários		meios S consistem em solução basal S (1,46 g de NaCl, 0,25 g de K2HPO4, 1,5 g de KH2PO4, 0,25 ml de colesterol 5 mg/ml em etanol e H2O a 250 ml. Autoclavado.) À solução basal S adicionar 2,5 ml de citrato de potássio pH 6,0 (2 g de ácido cítrico mono-hidratado, 29,4 g de citrato tripotássico mono-hidratado, H2O a 100 ml, autoclavado), 2,5 ml de solução de metais traços (1,86 g de EDTA dissódico, 0,69 g de FeSO4  &touro; 7 H2O, 0,2 g MnCl2• 4 H2O, 0,29 g ZnSO4  &touro; 7 H2O, 0,025 g CuSO4  &touro; 5 H2O, H2O a 1 L. Autoclavado e armazenado no escuro), 0,75 ml de 1 M CaCl2 e 0,75 ml de 1 M MgSO4.
Placas de feromônio Dauer para ensaio dose-resposta	Various		Mix 0,085 g de ágar nobre, 0,5 ml de NaCl 0,513 M e 5 µ l de 5 mg/ml de colesterol dissolvido em etanol em cada um dos 6 tubos de cultura de 15 ml. Adicione feromônio bruto suficiente a cada tubo para criar uma faixa de concentrações. Adicione H2O para trazer o volume para 4.725 ml.  Ferva em um bico de Bunsen até que o ágar se dissolva e depois deixe esfriar a 55 ° C. Adicione 125 ° C. l 1 M KPO4 tampão (pH 6,0), 50 µ l 0,1 M CaCl2, 50 µ l 0,1 M MgSO4 e 50 µ l de 5 mg/ml de sulfato de estreptomicina para cada tubo.  Despeje o conteúdo de cada tubo em uma placa de Petri de 35 mm de diâmetro. Deixe o ágar-ágar solidificar em temperatura ambiente durante a noite (se for mais, armazene em recipiente fechado para evitar secagem excessiva).
Grânulos de microesferas de 0,1 mícron	Polysciences Inc.	00876-15
Tampão M9	Mistura diversa		3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Esterilizar por autoclavagem

SchroederSchroeder