Construção de vapor Chambers usada para expor Ratos ao álcool durante o equivalente a todos os três trimestres de Desenvolvimento Humano

Resumo

Nós demonstramos a construção de câmaras de vapor de álcool, utilizando materiais facilmente disponíveis que abrigam simultaneamente seis gaiolas de rato. Descrevemos ainda mais a sua utilização em um modelo do rato de exposição fetal ao álcool equivalente a todos os 3 trimestres de gestação humana. Este paradigma expõe animais durante a gestação e pós-natal dias 1-12.

Resumo

A exposição ao álcool durante o desenvolvimento pode resultar em uma constelação de anormalidades morfológicas e comportamentais que são conhecidos coletivamente como Transtornos do Espectro Fetal Álcool (FASDs). No final mais grave do espectro é a Síndrome Alcoólica Fetal (SAF), caracterizada por retardo de crescimento, dysmorphology craniofacial e déficits neurocomportamentais. Os estudos com modelos animais, incluindo os roedores, elucidaram muitos mecanismos celulares e moleculares envolvidas na patofisiologia da FASDs. Administração de etanol para roedores grávidas tem sido utilizado para modelar a exposição humana durante os primeiros e segundo trimestres da gravidez. Terceiro trimestre o consumo de etanol em humanos foi modelado usando roedores neonatais. No entanto, alguns estudos com roedores têm caracterizado o efeito da exposição ao etanol durante o equivalente a todos os três trimestres da gravidez humana, um padrão de exposição que é comum em mulheres grávidas. Aqui, vamos mostrar como construir câmaras de vapor a partir prontamente omateriais btainable que podem acomodar até seis gaiolas mouse padrão. Descrevemos um paradigma de câmara de vapor que pode ser utilizado para modelar a exposição ao etanol, com uma manipulação mínima, durante todos os três trimestres. Os nossos estudos demonstraram que vacas prenhes desenvolveu tolerância metabólica significativa de etanol. No entanto, os ratos neonatal não desenvolveram tolerância metabólica e do número de fetos, peso do feto, placenta peso, número de filhotes / ninhada, número de mortos filhotes / ninhada e peso das crias não foram significativamente afetadas pela exposição ao etanol. Uma vantagem importante deste paradigma é a sua aplicabilidade para estudos com ratinhos geneticamente modificados. Além disso, este paradigma minimiza o manuseio de animais, um grande confundir na pesquisa do alcoolismo fetal.

Introdução

Beber durante a gravidez pode prejudicar o feto, causando alterações persistentes em muitos órgãos e sistemas que diminuem significativamente a qualidade de vida para os indivíduos afetados e suas famílias. Estima-se que aproximadamente 10-30% das mulheres bebem durante a gravidez em os EUA, com 1-8% de beber em padrão binge ^1,2. A gama de efeitos produzidos pela exposição ao etanol durante o desenvolvimento fetal é coletivamente conhecido como transtornos do espectro do álcool fetal (FASDs). Estimativas recentes indicam que FASDs são um importante problema de saúde pública, com uma prevalência tão alta quanto 2-5% em os EUA ^3. O mais grave manifestação de FASDs é Síndrome Alcoólica Fetal (SAF), a qual é caracterizada por retardo de crescimento, anormalidades craniofaciais, e os déficits neurocomportamentais, incluindo dificuldades de aprendizagem. A prevalência da FAS foi estimada em 0,2-0,7% em os EUA ^3. Os tratamentos atualmente disponíveis para FASDs são apenas parcialmente eficazese desenvolvimento de tratamentos mais eficazes é limitado pela má compreensão das bases celulares e moleculares do complexo espectro de transtornos.

Os dados dos defeitos congénitos Nacionais Prevention Study (NBDPS) indicam que as mulheres grávidas mais comumente beber durante o 1 ^º trimestre, antes de ter sido detectado a gravidez, seguido de abstinência durante as fases posteriores de gestação ^2. O NBDPS também descobriram que o segundo padrão mais comum de consumo de etanol durante a gestação envolve beber em todos os trimestres da gravidez ^2. As razões para isso incluem a falta de conhecimento sobre os efeitos potencialmente nocivos da exposição fetal etanol (mesmo em doses baixas), o acesso limitado a cuidados de pré-natal, história positiva para transtornos neuropsiquiátricos e abuso ou dependência de álcool ^4. Curiosamente, o NBDPS relatado que o terceiro padrão mais comum de consumo envolvido abstinência durante a 1 ^{º e 2 º trimestres seguidos de nd consumo durante o 3 º trimestre, quando é frequentemente assumido que o consumo é seguro porque organogênese tem sido quase concluída. No entanto, o 3 º trimestre é um período de alta susceptibilidade a danos no sistema nervoso induzida por etanol, porque este é um período em que circuitos neuronais sofrer profundo refinamento 2. O NBDPS identificou também outros padrões, menos frequentes do consumo de álcool que ocorrem durante a gravidez, incluindo o consumo ao longo do 1 º e 2 º trimestres seguidos de nd abstinência durante o 3 º trimestre 2.}

Numa tentativa de modelar os diferentes padrões de consumo de etanol observados em mulheres grávidas, um número de paradigmas de exposição etanol desenvolvimento têm sido estabelecida utilizando diversas espécies de animais, com ratos e ratinhos, sendo ^5,6 o mais comum. A duração da gestação nesses animais tipicamente lasst cerca de 3 semanas, o que corresponde à 1 ^ª e 2 ^ª trimestres de gravidez humana. Muitos estudos com roedores têm avaliado o impacto de várias doses e padrões de exposição ao etanol durante este período. Exemplos dos métodos frequentemente utilizados para administrar o etanol para ratinhos e ratos fêmeas grávidas incluem a administração através de dietas líquidas ^7,8, adição de etanol para a água potável ^9,10, a ingestão voluntária de soluções adoçadas com sacarina ^11, sonda gástrica ^12, a inalação do vapor ¹³ , e subcutânea ou intraperitoneal ^14. Os resultados destes estudos foram recapitulado vários dos défices observados em humanos com FASDs, demonstrando que a exposição durante as fases iniciais da gravidez é suficiente para danificar os circuitos neuronais em todo o cérebro (revisão em ^6,15).

As experiências com roedores também têm demonstrado que a exposição durante o equivalente a 3 ^ª Trimestre de gravidez humana, o que corresponde aproximadamente aos primeiros 1-2 semanas de vida pós-natal em ratos e camundongos, podem comprometer significativamente o desenvolvimento do cérebro. Exposição durante este período foi modelado através da administração de etanol em ratos ou camundongos neonatais. O etanol tem sido administrada a estes animais, usando uma variedade de métodos, incluindo a alimentação por gastrostomia em animais criados artificialmente ^16-18, intubação intragástrica ^19, a injecção subcutânea ^{de 20,} e a inalação do vapor ^21,22. Estes estudos demonstraram de forma convincente que o crescimento do cérebro jorro é um período de elevada vulnerabilidade para os efeitos no desenvolvimento de etanol ^6.

Como mencionado acima, beber durante todos os trimestres da gravidez é um padrão comum de consumo de etanol em mulheres ^2. No entanto, comparativamente, poucos estudos avaliaram o impacto deste padrão de exposição utilizando modelos animais. Alguns destes estudos tomaram advantage de animais de grande porte, onde o 3 ^rd trimestre equivalente ocorre no útero, em vez de o período neonatal, como no caso de ratazanas e ratos. Estes modelos animais incluem primatas não humanos, ovelhas ^{23,24 25-27.} No entanto, estes modelos animais, não têm sido amplamente utilizados em FASDs pesquisa, em parte, por causa do custo elevado e a necessidade de instalações de cuidados especializados. Roedores têm sido mais comumente usado para caracterizar o efeito da exposição ao etanol tudo trimestre sobre o desenvolvimento fetal ^5. As cobaias foram particularmente vantajosa a este respeito dado o seu amplo desenvolvimento pré-natal e semelhanças na maturação do cérebro ao dos humanos ^28,29. Com cobaias, foi possível caracterizar o efeito da exposição ao etanol, no útero, que inclui o período de desenvolvimento equivalente ao humano ^3o trimestre. O custo relativamente alto destes animais, bem como a duração relativamente longa da gravidez(~ 67 dias), tem limitado o seu uso a poucos laboratórios que trabalham com FASDs pesquisa.

Devido ao seu uso custo-eficácia e ampla na pesquisa biomédica, os pesquisadores usaram ratos para modelar a exposição ao etanol durante todos os trimestres da gravidez. Em estudos iniciais, os ratos foram expostos durante a gravidez através de dietas líquidas, seguido por administração de etanol através de gastrotomia para criados artificialmente recém-nascidos (dia pós-natal (P) 1-10), resultando em níveis de etanol no sangue de pico (BEC) nas barragens de 0,08 g / dl e em que os filhotes de 0,16 g / dl. Este paradigma causou alterações duradouras na mielinização do nervo óptico e redução do número de fibras de glia Bergmann no cerebelo ^30-32. Da mesma forma, Maier e colaboradores usando condições de criação artificiais administrados etanol para barragens de ratos grávidas de forma binge-como via intubação intragástrica seguido por administração neonatal durante parte do 3 ^º trimestre equivalente (P4-9) ^33,34. PEAK BECs maternos e filhote foram de 0,3 g / dl, tanto gestacional dia 20 e P6. Este paradigma exposição todos trimestre resultou em atraso de crescimento, que foi significativamente maior do que a observada nos filhotes expostos durante períodos determinados de gestação ^33. Além disso, os ratos expostos a etanol durante o equivalente para todos os trimestres exibiram uma redução no número de Purkinje do cerebelo e células de grânulos que era maior do que o observado em animais expostos durante outros períodos de ^34. As reduções no número de células do hipocampo também foram relatados com esse paradigma, mas esses efeitos parecem ser principalmente uma conseqüência da exposição durante o 3 ^º trimestre equivalente ^35. Um método que envolve a administração de etanol via intragástrica gavagem para ambas as ratas grávidas e ratinhos neonatais também tem sido usado para modelar toda a exposição trimestre ^36. Este método, o qual originou CEBs de 0,13 g / dl nas barragens (dia 17 de gestação) e 0,24 g / dl em crias de P6, lon induzidaalterações duração g nos níveis de neurotransmissores monoamina no hipocampo e no hipotálamo, e aumento da expressão de DNA metiltransferases e metil CpG proteína 2 de ligação no hipocampo ^37,38. Usando um paradigma de exposição semelhantes (BEC = 0,14-0,2 g / dl em barragens e 0,2 g / dl em crias), Gil-Mohapel et al. ³⁹ detectado um aumento no número de novos neurónios imaturos no giro dentado de ratos adultos que pode representar um mecanismo compensatório a lesão neuronal induzida por etanol ou uma alteração na maturação dos neurónios adultos nascidos. Os investigadores também têm tentado modelar toda a exposição ao etanol trimestre expondo barragens via dietas líquidas ou água potável durante a gravidez e lactação ^9,40. No entanto, a utilidade de expor os filhotes através do leite da mãe é limitado porque normalmente resulta em baixos BECs filhote (por exemplo, ,002-,05 g / dl; ^41,42).

Os ratinhos foram também utilizados extensvamente para caracterizar os efeitos da exposição ao etanol de desenvolvimento. Este modelo animal compartilha muitos dos pontos fortes descritos acima para o modelo animal de ratos, com a vantagem adicional de que muitas linhagens de camundongos geneticamente modificados estão disponíveis ^5. Ratos têm sido usados ​​com sucesso para caracterizar os efeitos do etanol durante o 1 ^º, 2 ^º ou 3 ^º trimestres de gestação ^43,44. No entanto, o impacto de qualquer exposição trimestre nestes animais não foi bem caracterizado por ser tecnicamente mais difícil para expor os ratos durante o equivalente a todos os trimestres da gravidez humana. Por exemplo, a criação e artificial por sonda gástrica, que têm sido utilizados com sucesso em ratos, requerem procedimentos mais especializados em ratos ^45. Ao melhor de nosso conhecimento, apenas um estudo até à data tem tentado estudar o efeito de qualquer exposição etanol trimestre utilizando camundongos; esses animais foram expostos a solução de etanol em água potável during gravidez e lactação ^46. BECs maternas foram 0,07 g / dl e filhote BECs não foram determinadas, mas espera que seja uma fração daqueles em barragens.

Aqui, descrevemos um novo modelo de exposição ao etanol tudo trimestre de ratos onde o álcool é administrada aos dois barragens grávidas e recém-nascidos através de câmaras de inalação de vapor. Câmaras de vapor foram construídos com base em um projeto anterior ^47. Nós fornecemos instruções detalhadas sobre como construir as câmaras de inalação e executar os procedimentos de exposição. Nós também fornecemos informações sobre as CEBs que podem ser alcançados e do impacto da exposição na sobrevivência das crias e crescimento.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade do Novo México de Ciências da Saúde-Centro Animal Care Institucional e Comitê de uso.

1. Montagem de câmara de vapor

1. Corte as folhas de policarbonato com uma serra circular ou quebra-cabeças para as dimensões fornecidas no vídeo para a parte superior, inferior, frontal, traseira, laterais e porta (Figura 1 e Tabela 1).
2. Com uma serra circular ou de serra de vaivém, cortada uma abertura de 8 polegadas de altura por 16 cm de largura no centro do painel da frente.
3. Meça e marque os furos para a dobradiça do piano para o de 18 polegadas por 10 polegadas folha de policarbonato que se tornará a porta da câmara.
4. Na porta, perfurar buracos balcão de pia com um pouco 5/16 broca polegadas, e com um pouco de 3/16 polegadas broca, fazer o furo para os parafusos. Certifique-se para perfurar buracos balcão de pia no interior da porta para as cabeças dos parafusos.
5. Prepare as chapas de policarbonato para a soldagem.
6. Montar front, painéis traseiros e laterais para o painel de fundo usando Weld-on # 16.
7. Vede todas as aberturas entre os painéis com Weld-on # 16.
8. Prenda o painel superior com Weld-on # 16.
9. Use grampos de barras ou livros pesados ​​para manter tudo no lugar, enquanto as soldas curar.
10. Anexar um 1 polegada por uma peça de policarbonato de 12 polegadas para o painel frontal 1 polegada abaixo da abertura para a fixação da dobradiça da porta.
11. Deixe pelo menos 24 horas para Weld-on para a cura.
12. Corte 2 pedaços de tubulação PEX de 12 centímetros de comprimento e 1 pedaço de 1 polegada tubulação PEX longo.
13. Com um pouco de 5/16 perfuração, perfuração de um buraco em cada um dos tubos PEX 12 polegadas a cerca de 1 a 2 polegadas de uma extremidade.
14. Anexar 2 x 12 polegadas tubo PEX a um conector em T 3/8 de polegada, com os orifícios localizados fora do conector.
15. Tapar as extremidades abertas dos tubos PEX com 3/8 de polegada tampões.
16. Fixe a dobradiça de piano para o painel frontal e porta usando 4-40 parafusos e porcas.
17. Usando a porta como um guia, mark os furos necessários para a dobradiça de piano sobre o espaçador 1 polegada no painel frontal da câmara.
18. Com um pouco de 3/16 polegadas broca, faça os furos no painel frontal para a dobradiça piano.
19. Fixe a porta e dobradiça de piano ao painel frontal usando 4-40 parafusos e porcas.
20. Montar os grampos articulados, como mostrado no vídeo com uma anilha e uma porca em cada lado do braço lateral.
21. Mark e broca de 3/16 polegada buracos para a alternância grampos no painel frontal e anexar alternância braçadeiras com 4-40 parafusos e porcas.
22. Adiciona-se 3/8 de polegada selos bulbo de borracha para o interior da porta.
23. Com uma perfuração da broca de 5/8 de polegada, fazer um furo no centro do painel de topo para o orifício de entrada.
24. Faça um furo de 1/2 polegada de fundo / centro do painel de volta para a porta de saída.
25. Montar a porta de saída, empurrando a parte com rosca de 3/8 de polegada na parede por meio de adaptadores, através da parede de trás da câmara de vapor, no furo de passagem de saída. Prenda a porca dainterior da câmara para manter no lugar.
26. Retire a cobertura protetora de chapas de policarbonato.
27. Anexar o pedaço de tubo PEX 1 polegada para o conector em T e forçar o tubo PEX, através do orifício na parte superior da câmara a partir do interior.
28. Encaixe de 3/8 de polegada de cotovelo 90 para o topo do tubo PEX uma polegada a partir do exterior.
    NOTA: Faça um furo de 1/2 polegada na porta e inserir um septos selo 1/2 polegada para o buraco.
29. Repita os passos 1-22 para o ar apenas controlar câmara.

2. Rack e Assembléia Air Entrega

1. Se colocar as câmaras no carrinho / cremalheira mencionado na lista de materiais, montar o carrinho de acordo com as instruções do fabricante.
2. Com nozes peças e parafusos, coloque um pedaço de policarbonato para o rack para manter os reguladores de fluxo de ar.
3. Em qualquer lugar do pedaço de policarbonato, marca e broca de 3/4 polegada buracos para os reguladores de fluxo de ar e anexar os reguladores com as porcasfornecida.
4. Encaixe de 3/8 polegadas através da parede do adaptador para as portas de entrada e de saída dos reguladores de fluxo de ar.
5. Monte o frasco de etanol com a pedra de aeração, # 8 rolha e liberação rápida na linha de conectores.
6. Usando 3/8 de polegada tubagem TYGON, ligar os reguladores de fluxo para a bomba de ar e um balão de etanol, como mostrado na Figura 1.
7. Para o ar de câmara única, prender a porta de saída do regulador de fluxo de ar para a entrada de 3/8 de polegada de cotovelo 90 com um tubo TYGON 3/8 de polegada, conforme mostrado na Figura 1.

Representação Figura 1. Esquemática da configuração das câmaras de vapor. Um conector em T é ligado a uma bomba de ar de baixo ruído. Um dos lados do conector T está diretamente ligado a um regulador de fluxo de ar para a única câmara de vapor do ar. Os outros side é dividida outra vez e ligado a dois reguladores de fluxo de ar diferentes, uma para o ar e uma para o etanol. A câmara de ar está diretamente ligado ao regulador, como mostrado. Para a câmara de vapor de etanol, um regulador de fluxo de ar está ligado à pedra arejador imerso em etanol líquido no frasco de filtração. A porta de braço lateral do balão do filtro está ligado com a saída do regulador de ar, tal como indicado. O vapor de etanol fundiu e o ar é então ligado à entrada da câmara de vapor de etanol. Os tubos de saída (não mostrados) estão ligados a uma saída de ventilação na sala.

3. Teste Vapor Chambers e ajuste os níveis de etanol

1. Adicionar 600 ml de etanol prova 190 para o balão de filtração, inserir a pedra de arejamento, e ligar a entrada do tubo para o braço lateral do balão.
2. Feche as portas da câmara e ligue a bomba de ar.
3. Ajustar os reguladores de fluxo de ar de modo a que cerca de metade da quantidade de ar que flui através do álcool líquido, o ar é misturado com. Ajustt o ar apenas o fluxo de ar para o escoamento combinado de álcool e ar da câmara de etanol.
4. Permitir que as câmaras a equilibrar durante pelo menos 30 min antes de se medir a concentração de etanol do ar.
5. Medir a concentração de etanol do ar por meio da extração de 5 ml de ar com uma agulha de 18G e uma seringa de 60 ml através do septo. Diluir essa amostra com ar ambiente puxando o êmbolo de volta para 60 ml (01:12 diluição). Medir o nível de álcool do ar usando um bafômetro, de acordo com as instruções do fabricante. A diluição do ar da câmara é necessário para alcançar o nível de vapor de álcool dentro da faixa de detecção do bafômetro.
   NOTA: Se utilizando diferentes níveis de exposição do álcool a diluição pode ter de ser ajustada.
6. Como ponto de partida, ajuste os reguladores de fluxo de ar conforme necessário para atingir uma concentração de álcool no ar de aproximadamente 4,5-5 g / dl (g de álcool vaporizado por dl de ar).

4. Criação de Animais

1. Fêmeas casa grupo C578BL / 6 ratinhos (2-3 meses de idade) durante pelo menos uma semana para sincronizar os ciclos ovarianos.
2. Individualmente abrigar machos C57BL / 6 (2-5 meses de idade) por pelo menos 2 semanas.
3. Após a sincronização, coloque uma única fêmea com um único macho para 5 dias para permitir o acasalamento.
4. Após o acasalamento, os machos e remover individualmente fêmeas casa e colocá-los em câmaras.

5. Pré e pós-natal Etanol Vapor exposição

1. Expor vacas prenhes ao vapor de etanol, durante 4 horas por dia começando às 10 horas, durante o ciclo de luz (luzes acesas a partir de seis horas - seis horas), exceto o dia do nascimento para evitar a morte filhote.
2. Pesar barragens no dia gestacional (G) 5, G13-G14, G18 e G20-para monitorar a gravidez; cama foi alterado nos dias em que as fêmeas foram pesadas para minimizar o manuseio.
3. Cada dia substituir o alimento para os grupos de etanol expostos para evitar o consumo de peletes com qualquer etanol absorvido nelas.
4. No dia danascimento não expor os animais. Após o nascimento expor as barragens e os filhotes de 4 horas por dia começando às 10 horas a partir de P1-P12.
5. Pesar os filhotes no P2, P8, P12, P25 e; e mudar de cama em P8 e P12 para minimizar a manipulação adicional.
6. Imediatamente após a última exposição (P12), transfira as gaiolas a um animal sala habitação standard.

Resultados

Figura 2A mostra que ambos os ratos grávidas e filhos neonatal foram expostos a concentrações de vapor de etanol relativamente estáveis ​​nas câmaras. Estas variaram entre 4-6 g / dl. Figura 2B mostra as CEBs obtidos nas ratas grávidas como uma função do tempo. CEBs foram medidos usando uma enzima álcool desidrogenase padrão baseado ensaio ^48. No G5, BEC rapidamente aumentou para ~ 60 mM de 2 horas após o início da exposição e atingiu um pico no final do período de exposição ...

Discussão

Aqui, descrevemos em detalhes os métodos para a construção de câmaras de inalação de vapor. Os materiais e as ferramentas necessárias para a construção das câmaras estão prontamente disponíveis a partir de uma série de fornecedores comerciais e os passos para a construção das câmaras são relativamente simples. O sistema que nós descrevemos aqui não contém válvulas de retenção em linha para evitar o refluxo e mixagem. Não fomos capazes de medir qualquer etanol detectáveis ​​no ar apenas câmaras sugerindo que não temos qu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Policarbonato 1/4" transparente 48" x 24"	McMaster-Carr	8574K23	10
Espuma Vedação de bulbo de borracha 3/8"w x 7/32"h	McMaster-Carr	93085K67	10 pés
Solda #16	McMaster-Carr	7515A11	3
Dobradiça de piano 12" de comprimento	McMaster-Carr	1658A11	2 x 1 ft
Grampos de alavanca de retenção padrão	McMaster-Carr	5126A26	8
Tubo PEX 1/2"	McMaster-Carr	51275K88	10 pés
Conector de tubo em T farpado (Preto) Pacote 10	McMaster-Carr	5463K608	1
Encaixe de plugue farpado (Preto) Pacote 10	McMaster-Carr	5462K79	1
Encaixe de tubo de cotovelo farpado (Preto) Pacote 10	McMaster-Carr	5463K596	1
Adaptadores de parede de 3/8", tubo para tubo roscado	McMaster-Carr	5463K851	1
Phillips Parafuso de máquina 4-40	McMaster-Carr	91772A112	1
Parafuso de máquina porca sextavada 4-40	McMaster-Carr	90480A005	1
Medidor de vazão de montagem em painel 2-20	McMaster-Carr	41945K76	3
FRASCO, FILTRO 1.000 ml 6/PACOTE	VWR	89001-800	algarismo
Precision Seal Septa	VWR	89084-490	1
VWR Tampa de Borracha Preta #8 1-furo	VWR	59581-367	1
TUBO TYGON R3603 3/8X9/16 50'VWR		89068-556	1
TUBO TYGON R3603 1/4X11/16 50'VWR		89068-502	1
Pedra Aerator P2120	VWR	32573-007	1
3/8" T-connectors Pk de 20	VWR	46600-060	1
Seccionadores VWR cônicos Pk de 10	VWR	46600-110	1
/8 Mangueira Barb acoplamento em linha com válvula	Colder Products Company	HFCD17612	1
Bomba de ar de capacidade média	LMI Fabricantes	DB60L	1
Prateleira de arame Nexelate 36"W X 24"D X 63"H	Industrial global	T9A990135	1
Conjunto de (4) Rodas de Poliuretano de 5"	industrial	T9A500591	1

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