Obter imagens de microscopia eletrônica de transmissão de alta qualidade é um desafio, especialmente no caso de células vegetais, que possuem grandes vacúolos cheios de água e espaços aerados abundantes. O congelamento de alta pressão em tandem e a substituição rápida por congelamento reduzem muito o tempo de preparação de amostras de plantas para TEM, ao mesmo tempo em que produzem amostras com excelente preservação ultraestrutural.
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Artigo de método
Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma vez que a microscopia eletrônica de transmissão de 1940 (TEM) tem vindo a fornecer os biólogos com imagens ultra-alta resolução de materiais biológicos. No entanto, por causa de protocolos trabalhosas e demoradas, que também exigem experiência na preparação de amostras, sem efeitos artificiais, TEM não é considerado uma técnica de fácil utilização. Preparação de amostras para TEM tradicional usado fixadores químicos para preservar estruturas celulares. Congelamento de alta pressão é o criofixação de amostras biológicas sob pressões elevadas para produzir velocidades de arrefecimento muito rápido, restringindo, assim, a formação de gelo, o que é prejudicial para a integridade da ultra-estrutura celular. Congelamento de alta pressão e congelamento de substituição é o método de escolha para produzir a morfologia mais alta qualidade em seções de resina para TEM. Estes métodos minimizar os artefatos normalmente associadas com o processamento convencional para TEM de seções finas. Após criofixação a água congelada nas amostras é substituído por líquidosolvente orgânico a temperaturas baixas, de um processo chamado de substituição congelamento. Substituição por congelação é tipicamente levada a cabo ao longo de vários dias em dedicado, equipamento dispendioso. Uma inovação recente permite que o processo seja concluído em três horas, em vez dos habituais dois dias. Isso normalmente é seguida por vários dias de preparação da amostra, que inclui infiltração e inclusão em resinas epóxi antes do corte. Aqui apresentamos um protocolo que combina congelamento de alta pressão e rápida substituição de congelamento que permite fixação amostra da planta a ser realizado em poucas horas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para trabalhar com outros tecidos ou organismos. Tecidos de plantas são de interesse especial devido à presença de espaços gaseificadas e vacúolos cheios de água, que possam impedir o congelamento livre de gelo de água. Além disso, o processo de fixação química é especialmente longa em plantas devido às paredes celulares que impedem a penetração dos produtos químicos para dentro dos tecidos profundos. Tecidos de plantas são, por conseguinte, particcularmente difícil, mas este protocolo é confiável e produz amostras de alta qualidade.
Introdução
Nosso conhecimento da ultra-estrutura celular vem principalmente de microscopia eletrônica, que pode resolver detalhes da ordem de alguns nanômetros 1. Apesar de ser tão poderosa na resolução TEM não é considerado user-friendly, como a preparação da amostra requer protocolos laboriosos demorado e, e exige algum conhecimento do praticante. Fixação tradicional das amostras foi combinado o uso de aldeídos e tetróxido de ósmio antes de processamento adicional, que inclui a desidratação, a incorporação em resina e, em seguida, o corte para produzir cortes ultra-finos que são depois coradas com metais pesados. No entanto, é sabido que a fixação química pode produzir artefactos, incluindo a agregação da proteína e a perda de lípidos 1, e muda-se para membranas que, em última instância afectam vários compartimentos celulares 2. Esses artefatos são em grande parte atribuída à baixa taxa de fixação e desidratação à temperatura ambiente 3, 4, 5.
criofixação por alta pressão congelamento (HPF) evita a maioria dos artefatos causados por fixação química. O princípio de criofixação é que baixa o ponto de congelação da água por 20 graus, retarda a nucleação e crescimento de cristais de gelo e aumenta a viscosidade da água, em uma amostra biológica de modo a que os constituintes celulares são essencialmente imobilizada 6, 7. HPF diminui um temperatura da amostra com a de azoto líquido, sob uma pressão muito elevada (210 MPa ou 2100 bar), em milissegundos. Quando feito corretamente HPF impede a formação de grandes cristais de gelo que podem causar grandes danos à ultra-estrutura celular. HPF pode ser utilizado para fixar as amostras de espessura de 100-200 uM para concentrações típicas de solutos biológicos 7. Existem inúmeros comentários sobre a física e os princípios subjacentes HPF, por exemplo, 1, 7, 8.
Após HPF, as amostras são incubadas a uma temperatura baixa (-78,5 ° C a -90 &# 176; C) na presença de solventes orgânicos líquidos contendo fixadores químicos como o tetróxido de ósmio, geralmente durante alguns dias. A esta temperatura baixa, a água na amostra é substituída pelo solvente orgânico, tipicamente acetona ou metanol a 1, 9. Assim, este processo é chamado de substituição congelamento (FS). A amostra é, em seguida, aqueceu-se gradualmente e, durante esse tempo é fixo, geralmente com tetróxido de ósmio e acetato de uranilo 9. A reticulação a baixas temperaturas tem a vantagem de fixar moléculas que são imobilizadas 1. FS, por conseguinte, produz amostras de qualidade superior em comparação com as fixadas por fixação química convencional à temperatura ambiente, em particular, que resulta em melhor preservação ultraestrutural, melhor preservação da antigenicidade e perda de componentes celulares não ligadas 10, 11 reduzida.
A maioria dos FS é realizada durante períodos de tempo longos, tipicamente até vários dias. Isto é particularmente true para as plantas amostras 12, 13, 14. Um protocolo recente desenvolvido por McDonald e Webb reduz grandemente o tempo de FS de alguns dias a algumas horas e 15. Em seu procedimento rápido congelamento de substituição (QFS), FS é realizada ao longo de 3 horas, enquanto nos FS super-rápidas (SQFS) amostras são processadas em 90 minutos. A qualidade das amostras produzidas por estes métodos é comparável aos produzidos por protocolos tradicionais FS. Adotamos o protocolo QFS para processamento posterior de amostras de plantas depois de HPF. Isto tem provado para salvar não apenas tempo, mas também dinheiro, como QFS e SQFS usar equipamentos de laboratório comum, em vez das caras máquinas FS disponíveis no mercado.
Tecidos vegetais são frequentemente muito difícil de se preparar para TEM. Em média, as células vegetais são maiores do que a utilização de células bacterianas ou animais. A presença da cutícula cerosa hidrofóbico, paredes celulares espessas, de grandes vacúolos cheios de água contendo ácidos orgânicos, hidrolases e fenólico compounds que podem ocupar cerca de 90% do volume total da célula 16, e a presença de espaços gaseificadas diminui severamente a condutividade de calor do sistema 17. Além disso, no caso de plantas, a espessura da amostra quase sempre superior a 20 um, o limite para a utilização da fixação química. A estas espessuras, a baixa condutividade térmica da água impede uma taxa de congelamento mais de -10.000 ° C / s no centro da amostra. Essa taxa é necessária para evitar a formação de gelo hexagonal prejudicial (cristais de gelo com uma menor densidade e maior do que 10 a 15 nm) 8. Juntos, estes apresentam desafios para ambos congelação adequada da amostra e FS subsequentes. No entanto, criofixação é o melhor método para a fixação de amostras de plantas. Aqui, um protocolo de HPF-QFS de amostras de tecido de plantas é apresentada. Centra-se na Arabidopsis thaliana espécies modelo, mas também tem sido usado com Nicotiana benthamiana. Os resultados demonstram que os típicos HPF-QFS produz samples de qualidade comparável às tradicionais HPF-FS em uma fração do tempo. Com ajustes apropriados, este protocolo pode também ser utilizado para outras amostras biológicas relativamente espessas.
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Protocolo
NOTA: O procedimento QFS requer extremo cuidado e cautela por parte do utilizador e destacamos estas precauções de segurança aqui como Precauções e Notas, onde aplicáveis.
1.Preparation para HPF Run
- Antes de iniciar a preparação da amostra, ligar o congelador de alta pressão, seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: A unidade HPF utilizado neste protocolo é um Wohlwend Compact 02 unidade (Figura 1A), e leva cerca de uma a uma hora e meia de procedimento de inicialização antes HPF funciona pode começar.- Ligar o Wohlwend Compact 02 Alta Pressão Freezer.
- Ligue o instrumento, girando a chave principal de "0" para "1".
- Solte o ar comprimido para a máquina.
- Libertar azoto líquido para a máquina.
- Pressione o botão "SYSTEM secar".
- Após 30 minutos, pressione o botão "SYSTEM botão novamente secar ".
- Pressione o botão "ON / OFF" para ligar o instrumento.
- Pressione o botão "NITROGENADA".
- Deixe a máquina esfriar por 20 minutos, mesmo que o "drive in" botão já se iluminou.
- O "drive in" botão acende-se.
- Pressione o "drive in" botão.
- Pressione o botão "AUTO".
- O "sistema de READY" botão acende-se.
- Colocar a sonda de temperatura e pressão na câmara de pressão e bloqueá-lo com o pino.
- Pressione o botão "JATO AUTO". Este passo verifica se o aumento de pressão e diminuição da temperatura são como desejado; essencialmente um ensaio. Quedas acentuadas de temperatura e fortes aumentos na pressão são esperados (Figura 1B).
- Realizar mais dois ciclos do JET.
- Ligar o Wohlwend Compact 02 Alta Pressão Freezer.
2 Preparação para ReceiviAmostras congeladas ng
- Encha uma caixa térmica contendo titulares cryovial com nitrogênio líquido (ver Advertências de segurança), de modo que os titulares estão completamente cobertos (Figura 1C).
NOTA: Use EPI incluindo cryogloves e óculos de proteção ao manusear nitrogênio líquido. - Inserir o número apropriado de frascos contendo o meio de FS dentro dos suportes de tubos de alumínio em azoto líquido (Figura 1C). Com este protocolo de até quatro discos, contendo cada um uma única amostra pode ser colocada num frasco de congelação.
NOTA: Os frascos devem ser rotulados com um instrumento afiado como um escriba com ponta de diamante e lápis muito macio.- Para fixador durante QFS usar 1% OsO 4 e 0,1% acetato de uranila em acetona 9. Preparar a solução em grande volume, dispensar alíquotas de 1,5 ml em criotubos e armazenamento congeladas em azoto líquido.
NOTA: Siga Avisos de segurança para lidar com OsO 4 e acetato de uranila.
NOTA: OSO4 e acetato de uranila são produtos químicos perigosos e devem ser manuseados na capa fume enquanto estiver usando equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo sapatos-toed fechado, jaleco e luvas.
NOTA: As criotubos utilizados para conter amostras para QFS deve ter um anel de vedação de disco para assegurar que os tubos de permanecer selada durante QFS para evitar fugas de OsO4.
- Para fixador durante QFS usar 1% OsO 4 e 0,1% acetato de uranila em acetona 9. Preparar a solução em grande volume, dispensar alíquotas de 1,5 ml em criotubos e armazenamento congeladas em azoto líquido.
- Prepare levedura pasta misturando fermento de padeiro com um volume aproximadamente igual de 10% de metanol com um palito ou outro instrumento até que a massa esteja lisa. A pasta de levedura actua como um agente crioprotector extracelular e é utilizado para preencher o espaço em torno da amostra no suporte de amostras. A quantidade de pasta depende do número de amostras; para 10 amostras ou menos o colar (1 ml) pode ser misturado em um tubo de microcentrífuga.
Congelamento 3 de alta pressão de Amostras
- Remover uma folha (ou outro tecido) de interesse a partir da planta e gentilmente colocá-lo em um pedaço de dental cera ou outra superfície de corte. Usar um perfurador de 2,0 mm ou tamanho desejado para cortar uma amostra para fora da folha. Pega da amostra suavemente com um par de pinças e trabalhar tão rapidamente quanto possível.
- Trabalhando sob um microscópio de dissecação, coloque o disco de folha no lado de 0.2 mm de Tipo A transportadora amostra e cobrir completamente em levedura colar. Certifique-se de que o disco está completamente cheia e a pasta está nivelada com o bordo do suporte, por meio de alisamento para a pasta com um pincel fino (Figura 2).
- Inserir o suporte, por o suporte da amostra. Cobrir a amostra com o porta-espécime do tipo B, a superfície plana voltada para baixo.
NOTA: O suporte de amostra deve ser seco e em temperatura ambiente. - Tome amostra no porta amostra, insira-o em máquina e iniciar um ciclo de congelamento, pressionando o botão "JATO AUTO", que deve ser concluída em um ou dois segundos.
- Trabalhando tão rapidamente quanto possível, remover o suporte da máquina e coloca o bico prende o SAMPle em azoto líquido na caixa térmica na parte superior da máquina HPF. Mergulhe as pontas dos dois pares de fórceps no nitrogênio líquido para refrigerar-los.
NOTA: Após o congelamento, as operadoras só devem ser manipulados com pinças refrigerado a nitrogênio líquido. Quentes (temperatura ambiente) fórceps são muitas vezes a causa da falha em técnicas de criofixação. - Abrir um criotubo contendo os meios FS, e colocar a tampa no lado da caixa. Com o auxílio de uma pinça refrigerados a nitrogênio líquido, retire delicadamente o disco do suporte da amostra, garantindo que o disco está sempre em nitrogênio líquido ou vapor. Trabalhando no vapor de nitrogênio líquido, mantenha o tubo FS com um fórceps pré-resfriado e use a outra para colocar o suporte do frasco FS. Feche a tampa do frasco FS novamente. Não qualquer armadilha de azoto líquido no recipiente.
NOTA: Ao transferir as amostras para criotubos para QFS, garantir que nenhum nitrogênio líquido é preso nos frascos. O nitrogênio líquido se expande 700 vezes durante o aquecimento e qualquer Trapped nitrogênio líquido pode causar explosões durante este tempo. - Repita os passos 3.1 a 3.7 até que todas as amostras desejados estão congeladas. Vários discos foliares contendo o mesmo tipo de amostra pode ser colocada no mesmo frasco. Note-se que o suporte da amostra deve ser seca e levada até à temperatura ambiente entre os funcionamentos de congelamento. Para fazer isso rapidamente, aquecê-lo com um secador de cabelo, e monitorar sua temperatura pelo toque.
4 Preparação para Freeze Substituição
- Imergir completamente o bloco aquecedor de alumínio em azoto líquido durante 10 minutos ou até cessar ebulição nucleada. Enquanto isto acontece, colocar uma camada de gelo seco (1-2 cm) no fundo do recipiente utilizado como câmara de FS (Figura 3). Um recipiente de isopor ou balde de gelo pode ser utilizado para o FS, juntamente com gelo seco ou grânulos esmagados.
- Insira rapidamente os criotubos contendo as amostras, juntamente com a sonda de temperatura nas fileiras do meio do bloco aquecedor. Certifique-se de que as tampas dofrascos são firmemente aparafusado para que a mídia FS não vazar durante FS. Começar o registo da temperatura.
- Fazer a sonda de temperatura, colocando um termopar através da parte superior de um frasco de congelação de modo a que ele atinge o fundo do tubo. Selar a tampa do tubo com a resina de modo a que não há fugas de líquido para fora. Encher o tubo com 1,5 ml de acetona, no início de cada ciclo de QFS.
- Usando cryogloves isolados ou grandes pinças, derramar todo o nitrogênio líquido a partir do bloco de aquecimento. Tome cuidado para não derramar as criotubos.
NOTA: Use EPI incluindo cryogloves e óculos de proteção ao manusear nitrogênio líquido. - Colocar o bloco contendo os frascos sobre a camada de gelo seco na câmara QFS. Certifique-se de que o bloco é colocado de modo que os tubos são deitado na horizontal, mas com uma ligeira inclinação para cima. Não deve haver nenhum vazamento se os criotubos corretos são utilizados.
- Embalar a câmara QFS com gelo seco, para que os tubos são cobertos FS, embora não seja necessáriocobrir o topo do bloco. Coloque a tampa da câmara.
5. rápida FS
NOTA: Execute o QFS corrida em um exaustor no caso de qualquer vazamento de OSO4 ocorre inadvertidamente apesar de outras precauções.
- Coloque câmara QFS num agitador rotativo plataforma em um exaustor e rodar a 125 rpm para 120 min. Durante este tempo a temperatura do bloco deve aumentar gradualmente até cerca de -80 ° C. A agitação assegura a mistura dos componentes para uma melhor FS.
NOTA: O posicionamento do agitador no exaustor de fumos e a posição do porta hotte deve ser o mesmo em todo o processo e para cada QFS QFS executados para assegurar o aquecimento consistente de amostras. - Remover o gelo seco a partir da câmara e continuar agitando por mais uma hora.
NOTA: a temperatura deve aumentar para cerca de -15 ° C a -20 ° C. - Retirar as amostras e sonda de temperatura da câmara de QFS e colocar noagitador à temperatura ambiente durante mais 10-15 minutos, até que eles atinjam a temperatura ambiente. Pare a gravação da temperatura.
- Durante FS, desligue a máquina HPF.
- Feche a torneira do tanque de nitrogênio líquido, enquanto a máquina HPF está sendo preenchido com nitrogênio.
- Pressione o botão "NITROGENADA".
- Espere até que os vermelhos "pistão para baixo" apaga luz.
- Pressione o botão "ON / OFF".
- Pressione o botão "SYSTEM secar".
- Cortar o fornecimento de ar comprimido para a máquina.
- Após um mínimo de 12 horas (para garantir a secagem de qualquer umidade), desligar a máquina rodando o interruptor principal de "1" para "0".
6 Pós FS Processing
- Retire cuidadosamente a mídia FS com pipetas de transferência de plástico e coloque no recipiente apropriado para lixo tóxico.
NOTA: OsO 4 e acetato de uranila são produtos químicos perigosose deve ser tratado na hotte enquanto usava equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo sapatos-toed fechado, jaleco e luvas. - Lavar as amostras quatro vezes com 100% de acetona. Coletar as duas primeiras lavagens e coloque no recipiente de lixo tóxico.
- Usando uma pinça fina, retire as amostras de tecido dos titulares. Manter as amostras molhado com acetona como isso é feito, e trabalhar com muito cuidado para evitar quebra de amostras.
NOTA: Não é incomum e pode ser realmente útil para ter a pasta de levedura cair longe das amostras neste momento. A pasta de levedura é normalmente castanha muito escura, enquanto o tecido da folha ainda está verde. - Coletar as amostras em criotubos contendo acetona. Prosseguir com a preparação da amostra (infiltração e incorporação) para TEM acordo com os protocolos usuais.
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Resultados
Os resultados apresentados a seguir foram obtidas utilizando um Wohlwend Compact 02 para HPF (Figura 1A). Uma das principais vantagens deste instrumento é a facilidade de utilização dos portadores de amostra e os seus suportes. Ao usar outros instrumentos, McDonald recomenda que dois usuários devem realizar a preparação de amostras e HPF, uma preparação das amostras, enquanto o outro faz o congelamento ea transferência para o FS criotubos 9. No entanto, o espécime Wohlwend operadoras e suport...
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Discussão
O sucesso do protocolo aqui apresentado depende fortemente do utilizador. Em primeiro lugar, a preparação avançada é necessária para garantir que todos os materiais necessários estão prontamente disponíveis e em quantidade suficiente para completar uma corrida HPF-QFS. Em segundo lugar, o utilizador deve trabalhar rapidamente, passando de passo-a-passo de uma forma eficiente que minimiza o manuseamento das amostras, minimizando, assim, alterações no estado do tecido nativo. Uma vez que as amostras são congeladas e antes...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
A bondade ea generosidade do Dr. Kent McDonald da UC Berkeley são muito apreciados. Agradecemos a um revisor anônimo para sugestões muito úteis. O laboratório de Burch-Smith é apoiado por fundos de arranque da Universidade de Tennessee.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Máquina de congelamento de alta pressão Wohlwend HPF Compact 02 | Technotrade International, Inc | HPF02 | Com osciloscópio integrado para exibir curvas de congelamento e pressão; PC (não incluído) é necessário para exibição de parâmetros de congelamento |
| Suporte para transportadores de alumínio DN 3 x 0,5 mm | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Transportadores de amostras, P=1.000, DN 3 x 0,5 alumínio, tipo A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Transportadores de amostras, P=1.000, DN 3 x 0,5 alumínio, tipo B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Armazenamento Dewar 20,5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Gráfico | ||
| Fermento | Quanto mais velho, melhor, para evitar a produção excessiva de gás (CO2) | ||
| Palitos de dente Registrador | |||
| dados de termopar EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Bateria de substituição adquirida separadamente |
| Sonda de temperatura | Microscopia Eletrônica Sciences | 34505 | |
| Bloco aquecedor 12/13 mm | |||
| Agitador rotativo | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Punção de folha - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Cera dental rosa | Microscopia eletrônica Ciências | 72660 | |
| Frascos criogênicos 2 ml | Microscopia eletrônica Ciências | 61802-02 | |
| Metanol | |||
| Secador | |||
| Gelo | |||
| Nitrogênio | |||
| Acetona | |||
| Fórceps | Vários pares |
Referências
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Reimpressões e permissões
