Obter imagens de microscopia eletrônica de transmissão de alta qualidade é um desafio, especialmente no caso de células vegetais, que possuem grandes vacúolos cheios de água e espaços aerados abundantes. O congelamento de alta pressão em tandem e a substituição rápida por congelamento reduzem muito o tempo de preparação de amostras de plantas para TEM, ao mesmo tempo em que produzem amostras com excelente preservação ultraestrutural.
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Artigo de método
Tandem congelamento de pressão alta e rápida substituição em congelamento dos tecidos vegetais por Microscopia Eletrônica de Transmissão
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma vez que a microscopia eletrônica de transmissão de 1940 (TEM) tem vindo a fornecer os biólogos com imagens ultra-alta resolução de materiais biológicos. No entanto, por causa de protocolos trabalhosas e demoradas, que também exigem experiência na preparação de amostras, sem efeitos artificiais, TEM não é considerado uma técnica de fácil utilização. Preparação de amostras para TEM tradicional usado fixadores químicos para preservar estruturas celulares. Congelamento de alta pressão é o criofixação de amostras biológicas sob pressões elevadas para produzir velocidades de arrefecimento muito rápido, restringindo, assim, a formação de gelo, o que é prejudicial para a integridade da ultra-estrutura celular. Congelamento de alta pressão e congelamento de substituição é o método de escolha para produzir a morfologia mais alta qualidade em seções de resina para TEM. Estes métodos minimizar os artefatos normalmente associadas com o processamento convencional para TEM de seções finas. Após criofixação a água congelada nas amostras é substituído por líquidosolvente orgânico a temperaturas baixas, de um processo chamado de substituição congelamento. Substituição por congelação é tipicamente levada a cabo ao longo de vários dias em dedicado, equipamento dispendioso. Uma inovação recente permite que o processo seja concluído em três horas, em vez dos habituais dois dias. Isso normalmente é seguida por vários dias de preparação da amostra, que inclui infiltração e inclusão em resinas epóxi antes do corte. Aqui apresentamos um protocolo que combina congelamento de alta pressão e rápida substituição de congelamento que permite fixação amostra da planta a ser realizado em poucas horas. O protocolo pode ser facilmente adaptado para trabalhar com outros tecidos ou organismos. Tecidos de plantas são de interesse especial devido à presença de espaços gaseificadas e vacúolos cheios de água, que possam impedir o congelamento livre de gelo de água. Além disso, o processo de fixação química é especialmente longa em plantas devido às paredes celulares que impedem a penetração dos produtos químicos para dentro dos tecidos profundos. Tecidos de plantas são, por conseguinte, particcularmente difícil, mas este protocolo é confiável e produz amostras de alta qualidade.
Introdução
Nosso conhecimento da ultra-estrutura celular vem principalmente de microscopia eletrônica, que pode resolver detalhes da ordem de alguns nanômetros 1. Apesar de ser tão poderosa na resolução TEM não é considerado user-friendly, como a preparação da amostra requer protocolos laboriosos demorado e, e exige algum conhecimento do praticante. Fixação tradicional das amostras foi combinado o uso de aldeídos e tetróxido de ósmio antes de processamento adicional, que inclui a desidratação, a incorporação em resina e, em seguida, o corte para produzir cortes ultra-finos que são depois coradas com metais pesados. No entanto, é sabido que a fixação química pode prod....
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Protocolo
NOTA: O procedimento QFS requer extremo cuidado e cautela por parte do utilizador e destacamos estas precauções de segurança aqui como Precauções e Notas, onde aplicáveis.
1.Preparation para HPF Run
- Antes de iniciar a preparação da amostra, ligar o congelador de alta pressão, seguindo as instruções do fabricante.
NOTA: A unidade HPF utilizado neste protocolo é um Wohlwend Compact 02 unidade (Figura 1A), e leva cerca de uma a uma hora e meia de procedimento de inicialização antes HPF funciona pode começar.- Ligar o Wohlwend Compact 02 Alta Pressão Freezer.
- Ligue o instrumento, girando a c....
- Ligar o Wohlwend Compact 02 Alta Pressão Freezer.
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Resultados
Os resultados apresentados a seguir foram obtidas utilizando um Wohlwend Compact 02 para HPF (Figura 1A). Uma das principais vantagens deste instrumento é a facilidade de utilização dos portadores de amostra e os seus suportes. Ao usar outros instrumentos, McDonald recomenda que dois usuários devem realizar a preparação de amostras e HPF, uma preparação das amostras, enquanto o outro faz o congelamento ea transferência para o FS criotubos 9. No entanto, o espécime Wohlwend operadoras e suport.......
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Discussão
O sucesso do protocolo aqui apresentado depende fortemente do utilizador. Em primeiro lugar, a preparação avançada é necessária para garantir que todos os materiais necessários estão prontamente disponíveis e em quantidade suficiente para completar uma corrida HPF-QFS. Em segundo lugar, o utilizador deve trabalhar rapidamente, passando de passo-a-passo de uma forma eficiente que minimiza o manuseamento das amostras, minimizando, assim, alterações no estado do tecido nativo. Uma vez que as amostras são congeladas e antes.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
A bondade ea generosidade do Dr. Kent McDonald da UC Berkeley são muito apreciados. Agradecemos a um revisor anônimo para sugestões muito úteis. O laboratório de Burch-Smith é apoiado por fundos de arranque da Universidade de Tennessee.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Máquina de congelamento de alta pressão Wohlwend HPF Compact 02 | Technotrade International, Inc | HPF02 | Com osciloscópio integrado para exibir curvas de congelamento e pressão; PC (não incluído) é necessário para exibição de parâmetros de congelamento |
| Suporte para transportadores de alumínio DN 3 x 0,5 mm | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Transportadores de amostras, P=1.000, DN 3 x 0,5 alumínio, tipo A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Transportadores de amostras, P=1.000, DN 3 x 0,5 alumínio, tipo B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Armazenamento Dewar 20,5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Gráfico | ||
| Fermento | Quanto mais velho, melhor, para evitar a produção excessiva de gás (CO2) | ||
| Palitos de dente Registrador | |||
| dados de termopar EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Bateria de substituição adquirida separadamente |
| Sonda de temperatura | Microscopia Eletrônica Sciences | 34505 | |
| Bloco aquecedor 12/13 mm | |||
| Agitador rotativo | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Punção de folha - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Cera dental rosa | Microscopia eletrônica Ciências | 72660 | |
| Frascos criogênicos 2 ml | Microscopia eletrônica Ciências | 61802-02 | |
| Metanol | |||
| Secador | |||
| Gelo | |||
| Nitrogênio | |||
| Acetona | |||
| Fórceps | Vários pares |
Referências
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M.
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Reimpressões e permissões
