Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é um programa de desenvolvimento que impulsiona a morfogênese de órgãos e remodelação do tecido durante a embriogênese. Quando activados anormalmente, EMT promove a metástase do tumor e órgão fibrose ^1,2. Obrigando estudos descreveram a importância da regulação da transcrição durante o processo de EMT, definida por vários factores de transcrição, tais como torção, Snail, e ZEB, que reprimem a expressão da proteína de junção aderente E-caderina, que resultam na perda de um cobble- pedra, como morfologia epitelial e ganho de um fenótipo mesenquimal fusiforme ^3-8. Estudos recentes por meio de análise de todo o genoma de ARN revelou que existe um grupo de genes cujos padrões de splicing estão associadas quer epiteliais ou mesenquimais fenótipos ^9,10. Trabalho de nosso laboratório de funcionalmente ligados splicing alternativo e EMT. Ao estudar a molécula de adesão de superfície celular CD44, foi demonstrado que CD44 alternative splicing é rigidamente controlado durante a EMT, e mais importante, que isoforma CD44 emenda comutação causalmente contribui para EMT ^11.

O splicing alternativo representa um modelo disseminado e conservada da regulação de genes, tal como até 95% de genes de multi-exões humanos são de splicing alternativo ^12-14. Através da produção de vários produtos de proteínas a partir de um único gene, o splicing alternativo constitui um mecanismo essencial para a diversidade de proteínas, a adição de uma outra camada de complexidade para o genoma humano. Como tal, a desregulação de splicing alternativo pode potencialmente levar a profundos efeitos biológicos que causam doenças humanas. Na verdade, o splicing alternativo aberrante em doenças tem sido documentada por mais de uma década ^{de 15-25,} incluindo as recentes descobertas de que as mutações em genes que codificam a maquinaria spliceosome são comumente encontrados em síndromes mielodisplásicas ^26-28. Portanto, o desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para a detecção de i de splicing alternativosoforms é de grande importância no estudo de processos biológicos diversos, incluindo EMT.

Aqui nós fornecemos um protocolo para detectar mudanças no splicing alternativo utilizando um modelo EMT induzida. Os métodos para a concepção de iniciadores de PCR e detectar as isoformas de splicing são adequadas não apenas para o estudo de splicing alternativo durante EMT, mas também para o estudo de splicing alternativo em outros processos biológicos. Investigando splicing alternativo durante EMT é imprescindível, a fim de compreender melhor os mecanismos da EMT ea metástase do tumor, facilitando, assim, o desenvolvimento de estratégias eficazes para tratar a metástase do câncer.

1 Cultura de Células da EMT Indução

Nota: EMT pode ser induzida por meio de tratamento de TGF-p ou expressão ectópica de factores de transcrição de torção, Snail, ou ZEB1 / 2 em células epiteliais. Descrito neste protocolo é um sistema EMT induzida via expressão da proteína de fusão Twist-ER nas células mamárias humanas imortalizadas epiteliais (HMLE / Twist-ER, um presente do Dr. J Yang, UCSD) ^9,11,29. Após o 4-hidroxitamoxifeno (TAM) de tratamento, a proteína de fusão Twist-ER transloca-se para o núcleo para dirigir a transcrição e resulta numa transição EMT completo em 12-14 dias ^9,11,29. Sistemas induzíveis EMT adicionais, como HMLE / Caracol-ER, HMLE / TGF e MCF10A / TGF, pode ser encontrada em nossas publicações anteriores ^11,30.

1. Manter células HMLE / tvist ER mamária em meio de crescimento de células epiteliais sem soro (MEGM) em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO _2. Passagem das células a cada 2-3 dias, quando chegar a 80% de confluência. Incubar as células com tripsina a 0,15% a 37 ° C durante 5-10 minutos, e, em seguida, inactivar a tripsina com 5% de soro de vitelo / DMEM. Gire as células e ressuspender-los em MEGM. Células da placa em uma nova placa de cultura de tecidos a uma razão de 1 a 4.
2. Dissolve-se em etanol a TAM para fazer uma solução 200 uM. Proteger da luz e da TAM armazenar a -20 ° C. Antes da utilização, adicionar recém TAM para os meios de MEGM a uma diluição de 1: 10000 para fazer uma concentração final de 20 nM a TAM.
3. Para a indução da EMT, placa células 1,6 x 10 ⁶ HMLE / Torção-ER em um 10 centímetros de cultura de tecidos prato em duplicado. Células de cultura com 20 nM mídia TAM contendo MEGM.
4. Placa células 1,6 x 10 ⁶ HMLE / Torção-ER em uma placa de 10 cm em duplicado e tratar as células com etanol 0,01% como controle tratados com não-TAM.
5. Dois dias após a incubação, para tirar fotos sob um microscópio de luz em aumento de 10x para gravar alterações morfológicas de células.
6. Aspirar o meio de um prato de controlo ou tratados com a TAMcélulas. Lavar as células com PBS frio, e as células da colheita pela demolição metade da placa em tampão de lise de ARN para o isolamento de ARN e a outra metade em tampão RIPA para análise de proteínas.
7. Células passagem do controle ou pratos tratados com TAM por re-chapeamento de 1,6 x 10 ⁶ células em um prato de 10 cm em duplicado. Continuamente tratar as células com 20 nM de TAM ou veículo.
8. Repita os passos 5-7 em dias alternados até ao dia 14, altura em que as células tratadas Twist-ER-TAM mostram uma morfologia mesenquimal em forma de fuso, ao passo que as células de controlo tratadas com veículo a manutenção da morfologia epitelial de tipo paralelepípedo.

2 Caracterização de EMT

Nota: A conclusão da EMT é indicado por: (1) Celulares alterações morfológicas de uma morfologia epitelial calçada semelhante a uma aparência de fibroblastos-like fusiforme; (2) Perda de localização de E-caderina nas junções célula-célula; e (3) a expressão dos marcadores de comutação EMT, definida pela perdade marcadores epiteliais e ganho de marcadores mesenquimais.

Celulares alterações morfológicas são captadas por microscópio de luz em aumento de 10x durante o curso do tempo de indução EMT, descrito na Seção 1 detecção de Imuno-fluorescência de E-caderina em junções celulares é descrita nesta seção. A expressão dos marcadores de EMT é detectada por imunotransferência. Marcadores epiteliais comuns são a E-caderina, γ-catenina, e ocludina e marcadores mesenquimais incluem fibronectina, N-caderina e vimentina. Procedimentos gerais de immunoblotting estão descritos na Seção 4.

1. No dia 12 do tratamento TAM, semente de 1 x 10 ⁵ células em um de 12 milímetros de vidro lamela circular colocado num poço de uma placa de 24 poços.
2. 48 horas depois que as células de semeadura, médias Aspirar e lavar com pré-aquecido PBS.
3. Fix células com pré-aquecido a 4% de paraformaldeído durante 15 min.
4. Lave as células três vezes com PBS.
5. Incubar as células com 0,2% de Triton X-100 em PBS por 15min à temperatura ambiente.
6. Lave as células três vezes com PBS.
7. Incubar as células em 5% de BSA / PBS, durante 1 hora à temperatura ambiente para bloquear a ligação não específica.
8. Incubar as células com o anticorpo de E-caderina primário numa diluição 1:50 em BSA a 1% / PBS em uma câmara humidificada S / N a 4 ° C. NOTA: O intervalo para a diluição de anticorpo primário é normalmente entre 1:50 e 1: 200, e a diluição óptima para cada anticorpo deve ser determinada experimentalmente.
9. Decantar o anticorpo primário e lava-se as células três vezes com PBS.
10. Incubar as células com o anticorpo secundário marcado com fluorescência em uma diluição 1: 500, durante 1 h à TA. A partir deste passo, a proteger as células da luz.
11. Decantar o anticorpo secundário e lava-se três vezes com PBS.
12. Células mancha com 0,1-1 g / ml DAPI ou Hoechst para 10 min.
13. Lavar as células com PBS três vezes.
14. Monte lamelas com uma gota de meio de montagem, e lamelas de vedação com unha polonês.
15. Observar células e tomarimagens em um microscópio fluorescente 63X.

A coloração com anticorpos adicionais podem ser realizados para confirmar o fenótipo de EMT. Por exemplo, N-caderina e actina de músculo liso-α pode ser corado por um ^29,31,32 fenótipo mesenquimal. Reorganização de estrutura do citoesqueleto podem ser monitorizadas por coloração das células com faloidina para F-actina ^11. Além disso, ensaios para a motilidade das células e resistência à morte celular podem ser realizados para examinar as propriedades dos EMT ^11.

3 Detecção de Splice isoformas utilizando qRT-PCR Ensaios

1. Projeto Primer
   NOTA: Os pares de primers devem ser cuidadosamente projetado para amplificar isoformas de splicing distintas. Exon pular, o acontecimento de processamento alternativo mais frequentemente observados, é mostrado como um exemplo para ilustrar a estratégia de desenho de primers. Figura 1A ilustra um exão de quatro pré-ARNm, com o terceiro exão de um exão variável. Inclusão de exão 3 resultaa produção de uma isoforma de emenda mais tempo, enquanto que o salto do exon 3 gera uma isoforma mais curta de splicing. Os iniciadores devem ser concebidos para distinguir a isoforma incluído exão-3-e isoforma do exão-3-ignorado, e para detectar o transcrito total deste ARNm.
   1. Para a detecção de inclusão exão, desenhar cuidadosamente um iniciador para a frente no interior do exão 3 variável, e uma sequência iniciadora reversa no interior do exão 4 constitutiva vizinhas, permitindo a amplificação específica da isoforma variável incluído-exão. Certifique-se não tanto à frente e conceber os iniciadores no seio da mesma exão variável inversa, a fim de evitar produtos de PCR amplificados a partir de ADN genómico ou de pré-ARNm.
   2. Para amplificar especificamente os eventos ignorando exão, design um dos iniciadores, abrangendo a junção do exão 2 e constitutiva exão 4, que de outra forma seriam destruídos quando exão variável 3 está incluído. Conceber o outro iniciador no interior do exão 4 constitutiva Como tal, os produtos de PCR são gerados apenas quando o exão 3 é variável, excluied eo constitutivo exon 2 e exon 4 são posteriormente unidas.
   3. Para detectar as transcrições totais do gene, desenhar os iniciadores de dentro de dois exons constitutivos 1 e 2 Assim, os produtos de PCR são amplificados a partir de todas as isoformas.
   4. Certifique-se de que a temperatura de fusão (Tm) para todos os iniciadores é de aproximadamente 55 ° C, a duração de cada um dos iniciadores é aproximadamente 18-22 nucleótidos, e o tamanho dos produtos de PCR é entre 80 e 150 pares de bases.
2. Extração de RNA: Extrato RNA usando um kit de isolamento total RNA (ver Tabela de Materiais).
   1. Recolher as células em 350 ul de tampão de lise de ARN.
   2. Adicionar 350 mL de etanol a 70% ao ligado e misture bem.
   3. Transfira a amostra para a coluna de purificação de ARN.
   4. Centrifuga-se a 10000 xg durante 1 min e descarte de fluxo.
   5. Lava-se a coluna uma vez com 500 ul de tampão de lavagem de RNA I e duas vezes com tampão de lavagem de ARN II.
   6. Remover o tampão de lavagem residual ARNII a partir da coluna através de centrifugação à velocidade máxima durante 2 min.
   7. Transferir a coluna para um novo tubo de 1,5 ml, adicionar 50 mL de água isenta de nuclease, no centro da matriz da coluna e eluir o ARN por centrifugação à velocidade máxima.
3. Síntese da primeira cadeia de cDNA
   1. Determinar a concentração e a qualidade do RNA por medição da absorção de UV. NOTA: qualidade RNA bom deve ter uma relação absorbância / 280 nm 260 nm de aproximadamente 2,0.
   2. Defina-se a transcriptase reversa (RT), de reacções que contêm 250 ng de ARN total, a 0,05 ug iniciadores de hexâmeros ao acaso, 50 pmol de _MgCl2, 10 pmol de dNTPs, 2 ul de tampão 5 × GoScript, e 1 ul da enzima RT, num volume final de 20 ul.
   3. Realizar as reacções de RT a 42 ° C durante 1 hora, seguido de incubação a 70 ° C durante 5 min, para inactivar a enzima RT.
4. PCR em tempo real
   1. Configure 20 reacções ul que consistem em 10 mL SYBR master mix verde,0,1-1,0 modelo de cDNA ul e 5 pmol de iniciadores directos e inversos.
   2. Executar PCR em tempo real com 40 ciclos dos seguintes passos: 95 ° C desnaturação durante 10 seg, 58 ° C, emparelhamento durante 10 segundos, e extensão a 60 ° C durante 30 seg. Realizar reações de PCR em triplicado.
   3. Confira curvas de dissociação e certifique-se que um único pico é observado para cada conjunto de primers.
   4. Obtenção dos valores de ciclo de quantificação (Cq), calculando os segundos valores derivados das curvas de amplificação.
   5. Calcula-se a quantidade relativa (RQ) de mRNAs alvo em amostras induzidas, em comparação com a amostra não induzido utilizando o "delta delta Cq (ΔΔCq) 'método, como mostrado pela seguinte fórmula. Use genes de manutenção, tais como GAPDH ou TBP, como referência.

Para calcular com mais precisão os valores relativos das isoformas de splicing, tele utilizar de múltiplos genes de referência deverá ser considerada. Os resultados podem ser analisados ​​utilizando um método de quantificação de valor absoluto modificado descrito por Pfaffl et al ^33,34.

4. Exame da Splice isoformas no nível de proteína

1. Recolher as células em 100 de tampão RIPA arrefecido em gelo ul.
2. Definir lisados ​​em gelo durante cerca de 10 min.
3. Centrifuga-se a 14000 xg durante 10 min a 4 ° C, e recolher o sobrenadante.
4. Medir a concentração de proteína por meio de ensaios de Bradford.
5. Diluir as amostras de proteína em tampão de carga de SDS e carregar 20-40 ug de proteínas em géis de 10% SDS-PAGE.
6. Execute géis SDS-PAGE a 20 mA durante 1,5 horas.
7. Proteínas de transferência para membranas de PVDF em um sistema de transferência húmida a 4 ° C durante 3 horas a 85 V. Ajustar o tempo de transferência de acordo com o peso molecular de proteínas alvo.
8. Bloco de membrana em 5% de leite desnatado durante 30 minutos a 1 hora a RT.
9. Incubar wi membranapo um anticorpo primário a 4 ° CO / N. O intervalo para a diluição de anticorpo primário é normalmente entre 1: 200 e 1: 5000, determinar a diluição óptima para cada anticorpo experimentalmente. A diluição dos anticorpos usados ​​no presente protocolo podem ser encontrados em "Tabela de reagentes e equipamentos específicos".
   1. Para detectar as isoformas de splicing, utilizar anticorpos específicos que reconhecem uma isoforma particular. Em alternativa, utilizar um anticorpo que reconhece o epitopo na região de codificação de exão constitutiva e detectar as isoformas de splicing, simultaneamente, com base nos seus tamanhos diferentes de proteína.
   2. Ao mesmo tempo, controlar EMT por imunotransferência por marcadores EMT. Use E-caderina, γ-catenina, e ocludina como marcadores epiteliais, e fibronectina, N-caderina e vimentina como marcadores mesenquimais.
10. Membrana de lavagem três vezes com TBS-T (50 mM Tris, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) em um intervalo de 5 minutos.
11. Incubar membrana com uma formiga secundário conjugado com HRPibody em uma diluição de 1: 10000 a 1 hora à temperatura ambiente.
12. Membrana de lavagem três vezes com TBS-T com um intervalo de 5 minutos.
13. Visualizar proteína com um sistema de detecção de quimioluminescência e expor a membrana a uma película de auto-radiografia.

Os procedimentos descritos acima fornecem um método robusto para detectar splicing alternativo durante EMT. Os resultados representativos de CD44 splice isoforma de comutação durante EMT induzida por torção são dadas abaixo como um exemplo.

EMT induzida por torção em células HMLE / twist-ER foi caracterizado por uma transição de uma calçada de pedra como fenótipo epitelial para um fenótipo fibroblástica alongada (Figura 2A), a ausência de marcadores epiteliais E-caderina, γ-catenina e a ocludina e regulação positiva de marcadores mesenquimais fibronectina, N-caderina e vimentina (Figura 2B). Além disso, foi avaliada por EMT a perda de E-caderina de localização nas junções célula-célula (Figura 2C).

A expressão de CD44 ligado isoformas de splicing durante EMT foi examinada por qRT-PCR e immunoblotting. O gene humano de CD44 é constituído por nove exões variáveis. O splicing alternativo de CD44 permite células para produzir variantes de CD44 (CD44v) que incluem pelo menos um exão variável, e padrão CD44 (CD44s) que é desprovido de todos os exões variáveis. Figura 3A descreve a estratégia de criação de iniciadores para a detecção de diferentes isoformas de CD44 splice. Para a detecção dos produtos de exão-CD44s ignorado, o iniciador directo está localizada no exão 5 constitutivo, ao passo que o iniciador reverso se estende ao longo da junção entre os exões 5 e 6 constitutivos Para a detecção de CD44v isoformas de splicing contendo a variável V5 e V6 exons, a frente e verso, primers são concebidos dentro do V5 e V6, respectivamente. Os iniciadores para a detecção de outras variáveis ​​isoformas contendo exão CD44 pode ser concebido usando a mesma estratégia. Além disso, a transcrição total de CD44 é detectado utilizando iniciadores directos e localizados no exão 2 constitutivo e o exão 3, respectivamente (Figura 3A) reversa. Como mostrado na Figura 3B, qRT-PCR utilizando análises destes conjuntos de iniciadores indicaram uma diminuição significativa no CD44v ARNm e aumento no CD44s ARNm após 14 dias de tratamento, a TAM nos HMLE torção células que expressam ER-. Por contraste, o transcrito total de CD44 manteve-se inalterada durante EMT (Figura 3C). Consistente com os resultados de qRT-PCR, o nível de proteína de CD44v diminuído notavelmente, enquanto que a expressão da proteína de CD44s foi grandemente regulados positivamente (Figura 3D). Por conseguinte, a principal isoforma de CD44 foi deslocada de CD44v a CD44s durante o processo de EMT.

Projeto Figura 1 Primer. Diagramas esquemáticos que ilustram a localização dos primers para a detecção de isoformas de splicing em um modelo de salto de exon. As caixas cinzas representam exons constitutivos, as caixas de laranja representam exons variáveis, e as linhas finas que conectam as caixas denotar íntrons. As posições dos iniciadores são indicaded por setas: setas pretas indicam conjuntos de primers para a detecção de mRNA total setas laranja indicam conjuntos de primers para amplificar isoformas incluiu-exon, e as setas azuis indicam conjuntos de primers para a detecção de isoformas de pular exão.

Figura 2 Indução de EMT. (A) as imagens de contraste de fase (10X) ilustrando as alterações morfológicas nas células HMLE / Torção-ER antes (sem tratamento) e após 14 dias de tratamento TAM. (B) Análise de Imunoblot de marcadores de EMT em células HMLE / Torção-ER antes (não tratada) e depois de 14 dias de tratamento TAM. Após o tratamento a TAM, marcadores epiteliais E-caderina, γ-catenina, ocludina e foram reprimidos, e mesenquimais marcadores fibronectina, N-caderina e vimentina foram regulados positivamente. (C) imagens de fluorescência imunitário (63X), indicando a perda de E-caderinalocalização nas junções célula-célula, após 14 dias de tratamento TAM. Coloração verde indica a E-caderina, e DAPI (azul) indica núcleos. Barra de escala = 10 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 Chave de isoformas CD44 emenda durante EMT. (A) o desenho de primers para a detecção de isoformas de CD44 splice. As caixas cinzas representam exons constitutivos, as caixas de laranja representam exons variáveis, e as linhas finas que conectam as caixas denotar íntrons. As localizações dos iniciadores estão indicadas por setas: setas pretas indicam conjuntos de iniciadores para a detecção de ARNm total de CD44, setas laranja indicam conjuntos de iniciadores para a amplificação de CD44v5-6, e setas azuis indicam conjuntos de iniciadores paradetectar CD44s. (B, C) ​​Análise de qRT-PCR dos níveis de isoformas de CD44 durante EMT utilizando iniciadores que detectam especificamente CD44v contendo exões V5 e V6 (v5 / 6) e CD44s (B), e variáveis ​​de ARNm total de CD44 (C) . Níveis de expressão relativa de mRNA em Dia 14 células foram normalizados ao dia correspondente 0 células na TAM grupos tratados e não-tratados. As barras de erro indicam EPM; n = 3 (D) Análise de Imunoblot das isoformas de CD44 durante a EMT induzida pela TAM em células HMLE / Torção-ER. Níveis de E-caderina e N-caderina foram monitorizados para identificar estado EMT.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.