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Avaliação da Murino exercício de resistência sem o uso de um choque grade: uma alternativa para o exercício forçado

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DOI:

10.3791/51846

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14 de agosto de 2014

 ,  , 
1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

Neste artigo

Resumo

Um método para avaliar a resistência ao exercício em camundongos de laboratório sem o uso de uma grade de choque é demonstrado. Este método é um refinamento humano que pode diminuir os efeitos de confusão do estresse nos parâmetros experimentais.

Resumo

Usando modelos de ratos de laboratório, as vias moleculares responsáveis ​​pelos benefícios metabólicos do exercício físico estão começando a ser definido. O método mais comum para avaliar exercícios de resistência em ratos utiliza forçado correr em uma esteira motorizada equipada com uma grade de choque. Animais que parar de correr são empurrados pela correia em movimento esteira dentro de uma grade que proporciona um choque elétrico no pé; para escapar do estímulo negativo, os ratos voltar a correr na esteira. No entanto, o comportamento de evitação e estresse psicológico devido ao uso de um aparelho de choque pode interferir na quantificação de correr resistência, bem como medidas de confundir os níveis hormonais e de citocinas no soro pós-exercício. Aqui, vamos demonstrar e validar um método sofisticado para medir resistência em execução no ingênuos C57BL / 6 de laboratório em uma esteira motorizada sem a utilização de uma grade de choque. Quando os ratos são preacclimated para a esteira, eles correm voluntariamente com a marcha velocidades específicas para cada mouse. Utilização da rede de choque é substituído por encorajamento suave por um operador humano, usando um depressor de língua, juntamente com a sensibilidade à disposição para ser executado voluntário da parte do rato. Endpoints claras para quantificar o tempo de colocação à exaustão para cada rato correndo são definidos e refletida em sinais comportamentais de exaustão, tais como postura espalmadas e dificuldade para respirar. Este método é um refinamento humano que também diminui os efeitos de confusão do estresse sobre os parâmetros experimentais.

Introdução

A obesidade, resistência à insulina e diabetes tipo 2 são doenças metabólicas inter-relacionadas que exercem efeitos profundos sobre a saúde de ambos os EUA e as populações em todo o mundo 1-4. Exercícios de endurance pode prevenir, bem como tratar, estas condições 5,6. Além disso, a avaliação da velocidade da marcha e resistência são utilizados testes clinicamente como diagnóstico para fragilidade, sarcopenia, e as consequências de outras doenças tais como a doença pulmonar obstrutiva crônica, em seres humanos 7.

As vias bioquímicas subjacentes aos efeitos benéficos do exercício físico sobre a composição corporal ea sensibilidade à insulina estão começando a ser elucidados, usando camundongos geneticamente modificados ou farmacologicamente que Enhanced display ou redução da capacidade de exercício 8-11. No entanto, muitos desses estudos têm utilizado esteiras motorizadas equipadas com grades de choque para forçar ratos para correr 8-11. Animais que parar de correr são empurrados pora correia em movimento esteira dentro de uma grade que proporciona um choque elétrico no pé; para escapar do estímulo negativo, os ratos voltar a correr na esteira. Tais procedimentos podem introduzir estresse psicológico e comportamento de evitação como fatores de confusão que afetam parâmetros experimentais 12. Outros métodos de medição de resistência, como a quantificação da atividade ambulatorial utilizando um aparelho de raio-break ou quantificação de in-gaiola roda de corrida, podem ser confundidos pela modulação dos ciclos circadianos, a ansiedade, a formação inadvertida, ou comida comportamento de busca 12-16. Além disso, estes procedimentos exigem o alojamento individual, outra fonte de estresse psicológico para os ratos. Portanto, é necessária uma medição direta do exercício de endurance não confundidos por stress.

Para obviar a estas preocupações, o nosso laboratório tem desenvolvido e validado um método para avaliar a capacidade de funcionamento máxima e sustentada em execução velocidade em destreinados, camundongos normais usando uma esteira motorizada não equipped com uma grade de choque. O espaço no fim da correia de execução, em que a grade de choque normalmente reside, em seguida, transforma-se uma plataforma para os ratos para descansar, e proporciona um local para ratos que se recusam a correr para sentar até ser removido a partir do aparelho. Ratos são incentivados a executar por um observador humano através de toque suave ou tocar com uma espátula, juntamente com a sensibilidade à disposição voluntária para ser executado por parte do mouse. Este método foi utilizado para quantificar as diferenças de resistência entre exercício geneticamente modificado e controlar ratinhos C57BL / 6, que diferem na expressão do músculo citocina derivada de interleucina-15 (IL-15), 16,17. Este método é um refinamento humano que diminui os efeitos de confusão do reforço negativo causado pelo uso de uma grade de choque.

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Protocolo

O procedimento aqui descrito foi aprovado pelo Comitê de Som Animal Care Institucional e Uso do VA Puget, e está em conformidade com o Manual do ILAR para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Experimental Preparação

  1. Decida de antemão se o sangue ou coleta de tecido logo após o exercício é necessário, e em caso afirmativo, determinar o intervalo pós-exercício para a condução de tais procedimentos. Exemplos incluem a determinação do hormônio induzido pelo exercício ou a liberação de citocinas na circulação (necessitando de coleta de sangue), a determinação da expressão induzida exercício de espécies de mRNA de interesse (necessitando de eutanásia seguida pela coleta de tecido). Se o exercício sangue pós imediato ou coleta de tecido é indicado, têm materiais para estes procedimentos na mão na sala de procedimento. Receba revisão institucional aprovação do conselho e executar de acordo com as diretrizes regulamentares. Nem todos os experimentos necessitam de sangue pós-exercício ou tecido collectina; uma simples comparação de correr resistência pode ser tudo o que é necessário.
  2. Decida com antecedência sobre os grupos experimentais e os procedimentos pós-exercício para os ratos (ver descrição acima).
  3. Coloque a esteira em uma mesa resistente em uma sala silenciosa dedicado durante os ensaios em execução para este procedimento.
  4. Coloque o tapete rolante para as pistas do tamanho do rato e com uma inclinação adequada para o protocolo. A inclinação de 5 o é usado aqui para evitar lesões musculares devido ao exercício excêntrico (alongamento do músculo, ao mesmo tempo que a contracção) que ocorre durante a descida rodando.
  5. Coloque um pano absorvente por baixo do cinto de esteira para pegar as fezes.

2. Aclimatação de Ratos para a esteira

Decidir se um (sem exercício) grupo "sedentário" de ratos é necessário, e expor os ratos sedentários para a esteira sem correr como descrito nas etapas 2,1-2,5. Determinar se são necessários 2 ou 4 grupos experimentais,. exemplo, sedentário / Exercício (2 grupos); Controlos exercidos / exercidas tratamento (2 grupos, nem animais sedentários); ou, Sedentários / Exercido x Controle / Tratamento (4 grupos). O "tratamento" pode ser um genótipo transgênico ou nocaute, um regime medicamentoso, dieta especial, ou outra intervenção experimental.

  1. Permitir o mouse para se aclimatar para a sala de procedimento em sua gaiola transportado, com companheiros de gaiola, por 1-2 horas.
  2. Selecione um único mouse e número da etiqueta de registro; pesar do mouse e peso recorde.
  3. Colocar o mouse na esteira sem o motor ligado para aclimatação, cerca de 5 min. Ligue a energia, sem o cinto de esteira rolante, e deixar o mouse aclimatar ao barulho das máquinas por mais 5 min.
  4. Remover camundongos nos grupos "sedentários" (se for usado, ver Nota 1) da esteira neste ponto e devolvê-los à sua gaiola ou realizar procedimentos pós-exercício de acordo com o projeto experimental (ver nota 2).

3. Iniciando o teste Run-to-Exaustão

  1. Após aclimatação, vire a correia de baixa velocidade (10 m / min) quando o animal está explorando o cinto e não na plataforma.
  2. Bata levemente ou levantar a parte traseira do rato com um espátula, uma a três vezes, para incentivar os animais relutantes em ficar na esteira e correr.
    NOTA: A maioria dos mouses será executado rapidamente, mas eles às vezes parar por períodos curtos. Quando isso ocorrer, use a espátula para tocar ou levantar a traseira do animal para incentivar a retomada de correr suavemente. Muitas vezes, os ratos não precisa ser tocado com a espátula; percebendo a mão com a espátula vindo na direção deles faz com que os ratos para correr um pouco mais.
  3. Iniciar um temporizador laboratório uma vez que o mouse está funcionando na velocidade inicial de 10 m / min.
  4. Gire a velocidade lentamente quando o mouse está em cima (final subida) da correia, em incrementos de 1 m / min, a cada 2 min.
  5. Gire a velocidade até oconfiguração anterior se o mouse é executado repetidamente em curtos períodos e não em um ritmo constante.
  6. Determinar a velocidade máxima sustentada execução de cada rato (geralmente 14-17 m / min para murganhos C57BL / 6) pelo ajustamento da velocidade e acompanhando o rato. Registre essa velocidade.
    NOTA: A localização do animal na esteira deixas o investigador quanto à disposição do animal para correr a uma velocidade maior. Se o mouse está na extremidade (para cima) final e prestes a correr para a parede, ele está pronto para correr a uma velocidade maior. Se o mouse está funcionando em um ritmo constante no meio da esteira pode ser em sua velocidade máxima, ou podem precisar de mais ajustes, dependendo da qualidade da execução.

4. Endpoints e ratos que param

  1. Use a espátula para tocar ou levantar os quartos traseiros dos animais que param, para incentivar a retomada de correr suavemente (ver Nota 3.2). Não parar o temporizador para interrupções temporárias na corrida.
  2. Identificar e remove ratos que se recusam a executar. Nota esta na folha de dados. Dependendo do seu projeto experimental, os ratos que se recusam pode ser testada novamente em um dia diferente
    NOTA: Alguns ratos se recusam completamente a correr. Esses camundongos será executado em rajadas curtas, então pare de noivo ou "pedal", ou seja, sentar-se na plataforma e usar suas patas dianteiras sobre o cinto. A postura destes ratos é curvado, com as quatro patas plantadas sob o animal para evitar ser empurrado de volta para a escada rolante pela espátula. Ocasionalmente, um rato torna-se agressivo para com a espátula quando dispostos a correr, morder a língua depressor ou subindo-a como uma forma de fuga. É evidente dentro dos primeiros 5 min do julgamento se o mouse vai, ou não, ser executado. Remover os ratos que se recusam a correr a partir da análise, mas não contá-los como ratos "sedentários".
  3. Identificar camundongos exaustos e parar o cronómetro.
    NOTA: A exaustão é definida por três paradas sucessivas e recusa em resume funcionando apesar encorajamento gentil, além de sinais físicos de cansaço, como dificuldade de respiração e postura espalmadas. Ratos recuperar da exaustão dentro de 30 a 60 min.
  4. Registre a quantidade total de tempo gasto em execução em todas as velocidades.
  5. Dependendo do projeto experimental, quer retornar o mouse é a sua gaiola, ou realizar procedimentos pós-exercício imediatas, como sangue ou coleta de tecido de acordo com as diretrizes institucionais.
  6. Limpe o cinto limpo com um toalhete germicida depois de testar cada rato individual, de modo que o cheiro do mouse anterior não influenciar o comportamento de ratos testados subseqüentes.
  7. Teste o próximo mouse. Use a língua depressor fresco para cada rato. Ratos que residem na mesma caixa pode ser testados sequencialmente no mesmo dia, sem aclimatação adicional para a sala de procedimento.

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Resultados

Este procedimento para a medição da resistência de exercício reflete com precisão o perfil molecular e metabólica de diferentes estirpes de ratinhos C57BL / 6, que diferem na expressão da citocina IL-15, 16,17. Camundongos transgênicos que superexpressam IL-15 (IL-15 TG ratos) apresentam aumento significativamente os tempos de execução para a exaustão em comparação com os controles da mesma ninhada, enquanto os ratos que carecem de IL-15 (IL-15 KO) apresentam reduziu significativamente os tempos de execução a...

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Discussão

Descrito aqui é um método para avaliar a corrida de resistência voluntária em ratos de laboratório usando uma esteira motorizada sem o uso de uma grade de choque. Este método pode revelar diferenças entre as sub-linhas de ratinhos C57BL / 6, que diferem na expressão da citocina IL-15, que por sua vez faz com que as diferenças na expressão de factores que estão na base de endurance 16,17. Em consonância com os princípios da "Três Rs" no laboratório de ciência animal, este método pode ser usado como u...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

Agradecimentos

Apoiado por Mérito comentário # BX001026 do Departamento de Assuntos de Veteranos (LSQ), e uso de recursos e facilidades para Care System VA Puget Sound Health, o Core Transgênicos Recursos da Universidade de Washington Nathan Choque Centro de Excelência em Biologia Básica do Envelhecimento (NIA # 5P30AG-013.280), e da Universidade de Washington Diabetes Endocrinologia Research Center (NIH # P30 DK-17047). Agradecemos Cynthia Pekow DVM e Kari L. Koszdin DVM, VA Puget Sound, desde comentários úteis sobre o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Esteira Aberta para Roedores Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RMEste número de catálogo é para modelos sem grade de choque. As grades de choque podem ser removidas manualmente de modelos mais antigos (Eco 3/6)
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYgeralmente encomendado através de instalações locaisContém 10% de álcool isopropílico; qualquer produto equivalente pode ser usado.
Abaixadores de línguaQualquer fornecedor
Temporizador de laboratórioQualquer fornecedor
de camundongos IL-15 TG*JAX, Bar Harbor, ME011002Transgene Murine IL-15 expresso a partir de promotor de actina alfa-esquelética humana modificado com sequência de sinal alterada para facilitar a secreção.
Camundongos C57BL/6J (tipo selvagem)*JAX, Bar Harbor, ME000664Camundongos controle para camundongos IL-15
TG IL-15 KOTaconic Farms, Germantown, NY4269-MCamundongos "knockout" homozigotos de IL-15 em C57BL/6 fundo
C57BL/6NTac (tipo selvagem)*Taconic Farms, Germantown, NYCamundongos de controle B6-Mpara IL-15 KO
*Opcional; linhas e tratamentos de camundongos podem ser específicos para o experimento protocolo.
local*

Referências

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