A competição em Streptococcus pneumoniae é mediada por bacteriocinas, pequenos peptídeos antimicrobianos com atividade inibitória em relação ao pneumococo e outras espécies relacionadas. Aqui descrevemos um ensaio de sobreposição bacteriana otimizado que permite a caracterização da atividade da bacteriocina e do espectro inibitório, imunidade específica da bacteriocina e detecção de peptídeos secretados de quorum sensing.
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Artigo de método
Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Streptococcus pneumoniae coloniza a comunidade polimicrobiana altamente diversificada da nasofaringe, onde deve competir com organismos residentes. Mostramos que peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias (bacteriocinas) ditam o resultado dessas interações competitivas. Todas as cepas pneumocócicas totalmente sequenciadas abrigam um locus bacteriocin-l ike peptide (blp). O locus blp codifica uma variedade de bacteriocinas diversas e todos os componentes altamente conservados necessários para sua regulação, processamento e secreção. A diversidade das bacteriocinas encontradas na região de imunidade da bacteriocina (BIR) do locus é um dos principais contribuintes da competição pneumocócica. Junto com as bacteriocinas, os genes de imunidade são encontrados no BIR e são necessários para proteger a célula produtora dos efeitos de sua própria bacteriocina. O ensaio de sobreposição é um método rápido para examinar um grande número de cepas para interações competitivas mediadas por bacteriocinas. O ensaio de sobreposição também permite a caracterização da imunidade específica da bacteriocina e a detecção de peptídeos de detecção de quorum secretados. O ensaio é realizado pré-inoculando uma placa de ágar com uma cepa a ser testada para a produção de bacteriocina, seguida pela aplicação de uma camada de ágar mole contendo uma cepa a ser testada quanto à sensibilidade à bacteriocina. Uma zona de depuração ao redor da facada indica que a cepa de sobreposição é sensível às bacteriocinas produzidas pela cepa pré-inoculada. Se não for observada uma zona de depuração, a estirpe de sobreposição é imune à produção de bacteriocinas ou a estirpe pré-inoculada não produz bacteriocinas. Para determinar se o locus blp é funcional em uma determinada cepa, o ensaio de sobreposição pode ser adaptado para avaliar a secreção de feromônios peptídicos pela cepa pré-inoculada. Nesse caso, uma série de quatro cepas lacZ-repüer com diferentes especificidades de feromônios são usadas na sobreposição.
Introdução
Streptococcus pneumoniae, um colonizador comum da comunidade polimicrobiana da nasofaringe, é capaz de competir com outros pneumococos e espécies estreitamente relacionadas com a produção de peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias (bacteriocinas). Cada cepa de pneumococo totalmente sequenciado examinado até o momento contém uma versão do b acteriocin- l ike lócus p eptide, blp. Produção de bacteriocina por pneumococos foi demonstrada ser importante no resultado de estudos in vitro e in vivo em competição 1-4. Dinâmica competitiva são influenciados pela express....
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Protocolo
1 Preparação da Estirpe Produtor
- Streak uma cepa de pneumococo a ser testado para a produção de bacteriocina em sangue de carneiro soja tríptica placa de ágar de 5% a partir de -80 ° C stocks congelador.
NOTA: A utilização de placas de sangue para o crescimento inicial da estirpe para ser testado para a inibição aumenta enormemente a reprodutibilidade do ensaio. Além disso, outras estirpes não pneumococos que produzem bacteriocinas pode ser usada, embora as condições de crescimento podem ter de ser modificados para um organismo específico. Usámos o Streptococcus mitis e Lactococcus lactis no ensaio de sobreposição com sucesso.
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Resultados
Há dois resultados possíveis no ensaio de sobreposição. Deve ser possível ver o crescimento da estirpe esfaqueado após incubação durante a noite. Na Figura 1A, a sobreposição estirpe é sensível para as bacteriocinas que são produzidos. A zona livre pode ser visualizada em torno da tensão esfaqueado. Além disso, a roda da estirpe esfaqueado na mistura de revestimento é possível e pode ser visto na figura 1A. Na Figura 1B, a sobreposição estirpe é imune às bacteriocinas s.......
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Discussão
Este ensaio sobreposição é uma maneira rápida para determinar o leque de actividades para os produtores de bacteriocinas e demonstrar interações competitivas que podem ocorrer entre cepas de pneumococo. O ensaio de sobreposição pode ser adaptado para ser usado para o rastreio de várias estirpes de produção de bacteriocina, numa única placa. Temos rastreados com sucesso de grandes colecções de deformação com este ensaio, utilizando um replicador de 48 pinos para inocular placas de SBA de uma metade de uma placa de 96 poç.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Elizabeth E. Kennedy.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar Soja Tripticase com 5% de Sangue de Ovelha | Fisher | B21261X | Para crescimento a partir de culturas congeladas |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Unidades por prato |
| Caldo Todd Hewitt + Extrato de Levedura (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g de THB, 5 g de extrato de levedura, 1 L de autoclave ddH2O |
| Caldo de Soja Tripticase + Placas de Ágar (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g de TS, 15 g de ágar, 1 L de autoclave ddH2O |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranosídeo (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolver em placas de Petri de dimetilformamida |
| Fisher | FB0875712 | ||
| Spectropômetro | Mede o OD620 de culturas | ||
| 37 ° C banho-maria | |||
| 37 > C incubadora com | |||
| de 15 ml |
Referências
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al.
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Reimpressões e permissões
