A competição em Streptococcus pneumoniae é mediada por bacteriocinas, pequenos peptídeos antimicrobianos com atividade inibitória em relação ao pneumococo e outras espécies relacionadas. Aqui descrevemos um ensaio de sobreposição bacteriana otimizado que permite a caracterização da atividade da bacteriocina e do espectro inibitório, imunidade específica da bacteriocina e detecção de peptídeos secretados de quorum sensing.
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Artigo de método
Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Streptococcus pneumoniae coloniza a comunidade polimicrobiana altamente diversificada da nasofaringe, onde deve competir com organismos residentes. Mostramos que peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias (bacteriocinas) ditam o resultado dessas interações competitivas. Todas as cepas pneumocócicas totalmente sequenciadas abrigam um locus bacteriocin-l ike peptide (blp). O locus blp codifica uma variedade de bacteriocinas diversas e todos os componentes altamente conservados necessários para sua regulação, processamento e secreção. A diversidade das bacteriocinas encontradas na região de imunidade da bacteriocina (BIR) do locus é um dos principais contribuintes da competição pneumocócica. Junto com as bacteriocinas, os genes de imunidade são encontrados no BIR e são necessários para proteger a célula produtora dos efeitos de sua própria bacteriocina. O ensaio de sobreposição é um método rápido para examinar um grande número de cepas para interações competitivas mediadas por bacteriocinas. O ensaio de sobreposição também permite a caracterização da imunidade específica da bacteriocina e a detecção de peptídeos de detecção de quorum secretados. O ensaio é realizado pré-inoculando uma placa de ágar com uma cepa a ser testada para a produção de bacteriocina, seguida pela aplicação de uma camada de ágar mole contendo uma cepa a ser testada quanto à sensibilidade à bacteriocina. Uma zona de depuração ao redor da facada indica que a cepa de sobreposição é sensível às bacteriocinas produzidas pela cepa pré-inoculada. Se não for observada uma zona de depuração, a estirpe de sobreposição é imune à produção de bacteriocinas ou a estirpe pré-inoculada não produz bacteriocinas. Para determinar se o locus blp é funcional em uma determinada cepa, o ensaio de sobreposição pode ser adaptado para avaliar a secreção de feromônios peptídicos pela cepa pré-inoculada. Nesse caso, uma série de quatro cepas lacZ-repüer com diferentes especificidades de feromônios são usadas na sobreposição.
Introdução
Streptococcus pneumoniae, um colonizador comum da comunidade polimicrobiana da nasofaringe, é capaz de competir com outros pneumococos e espécies estreitamente relacionadas com a produção de peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias (bacteriocinas). Cada cepa de pneumococo totalmente sequenciado examinado até o momento contém uma versão do b acteriocin- l ike lócus p eptide, blp. Produção de bacteriocina por pneumococos foi demonstrada ser importante no resultado de estudos in vitro e in vivo em competição 1-4. Dinâmica competitiva são influenciados pela expressão de diversas proteínas de bacteriocinas, juntamente com imunidade cognatos em resposta a uma feromona de péptido específico. Indução do locus blp é controlada por um sistema de sensor de quorum na qual um péptido de feromonas, BLPC, liga-se ao sensor de quinase, BlpH, e inicia uma cascata de sinalização que resulta em otranscrição do locus de 5,6 blp. Existem quatro variantes alélicas BLPC que se ligam a cada um o seu cognato BlpH 6. Para a célula sobreviver os efeitos da sua própria bacteriocina, os genes que codificam as proteínas cognatas imunidade são transcritos no mesmo operão como cada um dos genes de bacteriocina. Matar ocorre se uma estirpe de competidor não é capaz de regular positivamente o locus blp em resposta a feromona exógena ou, se a estirpe não tem o gene da imunidade específica é necessária para a protecção. O complexo transportador, BlpAB é necessário para a secreção e processamento do péptido de feromona e dos péptidos de bacteriocina 2,4. Recentemente, tem sido demonstrado que uma proporção significativa de cepas de pneumococo são "trapaceiros", que significa que eles têm uma mutação no gene conservado BLPA que os torna incapazes de secretar feromônios e bacteriocinas 1,2. Essas cepas são capazes de responder a BLPC exógena 2 secretado pelo relincharestirpes chatas que permitem a produção de proteínas de imunidade.
Embora, preparações cruas de bacteriocinas de sobrenadantes podem ser preparados a partir de estirpes produtoras utilizando métodos bioquímicos passos para alcançar a pureza, esta abordagem não é útil para o rastreio de grandes colecções de isolados e, se o nível de expressão é baixo bacteriocina em caldo de culturas cultivadas 2,7- 9. O ensaio de sobreposição é usada como uma forma rápida para investigar a dinâmica da concorrência entre as linhagens que podem existir in vitro. Para isso, uma estirpe de pneumococos é pré-inoculado em uma placa de agar e deixadas a crescer até atingir concentrações bacterianas locais suficientes para a indução do locus blp. Uma segunda estirpe é inoculada em seguida uma solução de agar mole fundido, que é então aplicada sobre a tensão pré-inoculado para testar a sensibilidade. Para avaliar a actividade do locus blp (independente da actividade inibidora), as estirpes podem ser cobertos com uma série de three linhagens descritas anteriormente repórter BLPC. Essas linhagens foram construídos para conter um dos três alelos blpH diferentes que respondem a três feromônios BLPC mais comuns secretados pelo pneumococo. As estirpes de repórter tem um gene lacZ integrada, que está sob o controlo de um promotor dependente BlpH e transportar uma deleção no gene BLPC que impede a auto-estimulação 10,11.
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Protocolo
1 Preparação da Estirpe Produtor
- Streak uma cepa de pneumococo a ser testado para a produção de bacteriocina em sangue de carneiro soja tríptica placa de ágar de 5% a partir de -80 ° C stocks congelador.
NOTA: A utilização de placas de sangue para o crescimento inicial da estirpe para ser testado para a inibição aumenta enormemente a reprodutibilidade do ensaio. Além disso, outras estirpes não pneumococos que produzem bacteriocinas pode ser usada, embora as condições de crescimento podem ter de ser modificados para um organismo específico. Usámos o Streptococcus mitis e Lactococcus lactis no ensaio de sobreposição com sucesso. - Incubar a placa durante a noite (O / N) a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Após a incubação da estirpe produtora, preparar a placa de agar de tripticase de soja (TSA), pipetando 3000 a 4000 unidades de catalase em placas contendo 25 mL de TSA e espalhar a solução de catalase usando esferas de vidro estéreis. Deixe a placa secar durante cerca de 10 minutos, sobuma cabine de segurança biológica.
- Colete uma quantidade visível de bactérias em uma ponta da pipeta. Esfaquear a ponta da pipeta na placa de TSA seco.
NOTA: Mais de uma cepa produtora pode ser esfaqueado em uma única placa de TSA. É importante para o espaço fora dos golpes de modo que halos resultantes não se sobreponham.- Se possível, incluem os conhecidos produtor de bacteriocina, como um controlo positivo e a estirpe para ser usado na camada como um controlo negativo.
NOTA: Os controlos positivos e negativos são têm sido publicados anteriormente e estão disponíveis mediante solicitação 10.
- Se possível, incluem os conhecidos produtor de bacteriocina, como um controlo positivo e a estirpe para ser usado na camada como um controlo negativo.
- Incubar a placa de TSA contendo múltiplos golpes, a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 6 horas.
2. Fazer Stocks glicerol da estirpe Overlay
- Preparar stocks de glicerol (culturas crescidas até à fase semi-exponencial e em seguida armazenadas a -80 ° C após a adição de glicerol) antes do dia do ensaio de sobreposição. Inocular 5-10 colônias de str pneumocócicaain a ser testada para a sensibilidade ou a secreção de feromonas em meio Todd-Hewitt com extracto de levedura 0,5% (THY).
NOTA: Construção de BLPC repórteres induzíveis foi previamente descrito 2 e cepas estão disponíveis mediante solicitação. - Incubar 5-10 colônias em tubos de vidro com 5 ml de THY com tampas hermeticamente fechado em C banho de água 37 °, sem tremer.
- Incubar as culturas a 37 ° C até atingir uma OD 620 de 0,3 a 0,5.
NOTA: Isso levará cerca de 4-5 horas, dependendo da estirpe utilizada.- Inverta suavemente o tubo algumas vezes antes de medir o OD.
- Se a experiência não pode ser realizada no mesmo dia ou a tensão irá ser usado várias vezes no futuro, fazer stocks de glicerol e retomar o experimento em data posterior. Para as unidades populacionais de glicerol, glicerol adicionar às culturas a uma concentração final de 20%. Culturas Alíquota em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C. NOTA: As amostras podem ser stored para meses a -80 ° C. Se não fazer estoques de glicerol, utilize amostras diretamente para o ensaio de sobreposição.
3. Assay Overlay
- Pouco antes de sobrepor aplicação, misturar os componentes de sobreposição. Em um tubo de 15 ml, adicionar 5 ml de THY, 3000-4000 U de catalase, e 200 mL do caldo de cultura sobreposição de tensão que tanto cresceu naquele dia ou um estoque de glicerol da cultura que foi descongelado à temperatura ambiente. Se utilizar a estirpe repórter, adicionar 50 ul de X-gal (40 mg / ml) para a mistura de sobreposição. Use um tubo cônico por placa.
- Equilibrar mistura de sobreposição à temperatura ambiente antes da adição de TSA fundido.
- Retire a placa de TSA com tensão esfaqueado por incubadora. Derreta TSA sólido em microondas e manter a 55 ° C banho-maria até que esteja pronto para uso. Adicione 3 mL de TSA fundido com 1,5% de agar arrefecida a 55 ° C para se sobrepor mistura.
- Preparar a mistura de revestimento imediatamente antes de pipetar, a mistura começa a solidificar muitorapidamente. NOTA: Se a máscara começa a solidificar antes de chapeamento, os resultados serão uninterpretable.
- Misturar a mistura de sobreposição por pipetagem para cima e para baixo várias vezes com 5 ml de uma pipeta tendo o cuidado de não introduzir bolhas na mistura. Lentamente pipeta mistura sobreposição diretamente sobre a placa de TSA esfaqueado. Manter a placa na bancada durante alguns minutos, permitindo que o agar endurecer.
- Não rode a placa para distribuir a mistura de sobreposição, isso vai puxar o crescimento da cultura esfaqueado na sobreposição.
- Coloque cuidadosamente placa de TSA com sobreposição em 37 ° C incubadora contendo 5% de CO 2 O / N (cerca de 16-18 h).
- Observar as placas após o crescimento durante a noite. As placas devem aparecer opaco do crescimento da sobreposição de tensão, exceto em áreas onde tenha ocorrido inibição ou feromônio sinalização. Estes aparecem como zonas ou claros ou azuis ao redor da cepa esfaqueado, respectivamente.
NOTA: Embora measurements do diâmetro da clareira azul ou pode ser determinada por avaliação quantitativa, as diferenças no diâmetro pode também variar dependendo da quantidade de bactérias que foi rapidamente na placa. O ensaio de sobreposição é um ensaio qualitativo, qualquer avaliação quantitativa devem ser interpretados com cautela. Qualquer compensação visível em comparação com o controlo negativo é considerado como actividade.
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Resultados
Há dois resultados possíveis no ensaio de sobreposição. Deve ser possível ver o crescimento da estirpe esfaqueado após incubação durante a noite. Na Figura 1A, a sobreposição estirpe é sensível para as bacteriocinas que são produzidos. A zona livre pode ser visualizada em torno da tensão esfaqueado. Além disso, a roda da estirpe esfaqueado na mistura de revestimento é possível e pode ser visto na figura 1A. Na Figura 1B, a sobreposição estirpe é imune às bacteriocinas s...
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Discussão
Este ensaio sobreposição é uma maneira rápida para determinar o leque de actividades para os produtores de bacteriocinas e demonstrar interações competitivas que podem ocorrer entre cepas de pneumococo. O ensaio de sobreposição pode ser adaptado para ser usado para o rastreio de várias estirpes de produção de bacteriocina, numa única placa. Temos rastreados com sucesso de grandes colecções de deformação com este ensaio, utilizando um replicador de 48 pinos para inocular placas de SBA de uma metade de uma placa de 96 poç...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Elizabeth E. Kennedy.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ágar Soja Tripticase com 5% de Sangue de Ovelha | Fisher | B21261X | Para crescimento a partir de culturas congeladas |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Unidades por prato |
| Caldo Todd Hewitt + Extrato de Levedura (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g de THB, 5 g de extrato de levedura, 1 L de autoclave ddH2O |
| Caldo de Soja Tripticase + Placas de Ágar (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g de TS, 15 g de ágar, 1 L de autoclave ddH2O |
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranosídeo (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolver em placas de Petri de dimetilformamida |
| Fisher | FB0875712 | ||
| Spectropômetro | Mede o OD620 de culturas | ||
| 37 ° C banho-maria | |||
| 37 > C incubadora com | |||
| de 15 ml |
Referências
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- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
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Reimpressões e permissões
