Artigo de método

In Vitro Síntese de ARNm de modificação para indução da expressão da proteína em células humanas

DOI:

10.3791/51943

⸱

13 de novembro de 2014

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1Department of Thoracic, Cardiac, and Vascular Surgery, University Hospital Tuebingen

Neste artigo

Resumo

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Neste artigo de vídeo, que descrevem a síntese in vitro do ARNm modificado para a indução da expressão da proteína nas células.

Resumo

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O fornecimento exógeno de codificação de RNA mensageiro sintético (ARNm) para a indução da síntese de proteínas nas células desejadas tem um potencial enorme nos domínios da medicina regenerativa, biologia celular básico, tratamento de doenças, e reprogramação das células. Aqui, nós descrevemos um protocolo passo-a-passo para a geração de ARNm modificado com reduzido potencial imunológico activação e aumento da estabilidade, controlo de qualidade de ARNm produzido, a transfecção de células com o mRNA e verificação da expressão da proteína induzida por citometria de fluxo. Até 3 dias após a transfecção com um único mRNA eGFP, as células HEK293 transfectadas produzir eGFP. Neste artigo de vídeo, a síntese de mRNA eGFP é descrito como um exemplo. No entanto, o procedimento pode ser aplicado para a produção de outros ARNm desejados. Usando o mRNA sintético modificado, as células podem ser induzidas a expressar transitoriamente as proteínas desejadas, que normalmente não expressam.

Introdução

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Nas células, a transcrição de ARN mensageiro (ARNm) e a tradução na sequência de ARNm em proteínas desejadas garantir o bom funcionamento das células. Doenças genéticas, hereditárias ou adquiridas pode levar à síntese de proteínas insuficiente e ineficiente e causar doenças graves. Assim, uma nova abordagem terapêutica para induzir a produção de proteínas defeituosas ou em falta é o fornecimento exógeno de ARNm sintético modificado em células, que codifica para a proteína desejada. Desse modo, as células são acionados para sintetizar proteínas funcionais, que normalmente não podem produzir ou, naturalmente, não precisa. Usando esta abordagem, as doenças genéticas pode ser corrigido por introdução do ARNm que codifica para a proteína defeituosa ou falta 1. A terapia de mRNA também pode ser utilizada para a vacinação de sintetizar proteínas, antigénios que são expressos pelas células tumorais ou agentes patogénicos. Deste modo, o sistema imune do hospedeiro pode ser activado para eliminar de forma eficaz as células tumorais ou prevenir infeficções 2,3. Além disso, nos últimos anos, o ARNm foi utilizado com sucesso para gerar células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs). Para este efeito, os fibroblastos foram transfectadas com os mRNAs para induzir a expressão de factores de reprogramação 4-6 e de convertê-los em iPSCs com um enorme potencial em medicina regenerativa.

Anteriormente, o uso de ARNm convencional estava associada com a baixa estabilidade e forte imunogenicidade. Assim, aplicações clínicas de mRNAs convencionais foram limitados. No entanto, a substituição de citidina e uridina por 5-metilcitidina e pseudouridina dentro da molécula de ARNm por Kariko e colegas rendeu moléculas de mRNA estáveis ​​em fluidos biológicos e reduziu dramaticamente a activação imunitária 7-10, que agora permite que a aplicabilidade clínica de mRNAs modificados.

Utilizando mRNAs modificados produzidos sinteticamente, transcritos de genes desejados podem ser temporariamente entregues in vivo 11ou in vitro para induzir a expressão da proteína. O mRNA é traduzido introduzido sob condições fisiológicas pela máquina de tradução celular. Devido à falta de integração no genoma da célula hospedeira em comparação com vectores de terapia de genes virais, o risco de oncogénese é impedido 12,13. Assim, a terapia usando mRNA sintético modificado vai ficar melhor aceitação clínica no futuro.

Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a produção de ARNm modificado (Figura 1), a transfecção de células com o ARNm e a avaliação da expressão da proteína em células transfectadas.

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Protocolo

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1. Aumento de plasmídeos contendo Obrigatório Codificação de DNA seqüências (CDS)

  1. Meio de pré-SOC morno, que está incluída no kit de transformação, para a temperatura ambiente e as placas de agar LB contendo 100 ug / ml de ampicilina a 37 ° C. Equilibrar o banho de água a 42 ° C.
  2. Descongelar um frasco de química componente E. coli em gelo.
  3. Adicionar 1-5 ul do plasmídeo (10 pg a 100 ng) contendo os CDS para dentro do frasco de componente quimicamente E. coli e misture delicadamente. Não misture as células por pipetagem. Após a adição de plasmídeos, misture tocando suavemente o tubo.
  4. Incubar a mistura em gelo durante 30 min.
  5. Heat-choque do E. coli durante 30 segundos a 42 ° C num banho de água sem agitação.
  6. Colocar o frasco em gelo durante 2 min.
  7. Adicionar 250 ul de meio SOC pré-aquecido para a E. coli e agitar as bactérias horizontalmente a 300 rpm durante 1 hora a 37 ° C num incubador bacteriano.
  8. Espalhe 100 ul e 150 ul da mistura de transformação em placas de agar de LB pré-aquecido, inverter as placas e incubar durante a noite a 37 ° C.
  9. Depois de colónias tornam-se visíveis, inocular uma única colónia de cada placa num tubo de cultura de 15 ml contendo 5 ml de meio LB com 100 ug / ml de ampicilina. Incubar-los durante a noite a 37 ° C com agitação a 300 rpm até a cultura está em log tardia ou fase estacionária.
  10. Para armazenamento a longo prazo de transformada E. coli, pipeta 75 ul de glicerol a 100% para o frasco de congelação. Adicionar 225 ul da cultura bacteriana (estoque congelada conterá 25% de glicerol), misturar bem e armazenar o frasco de congelação a -80 ° C.
  11. Isolar os plasmídeos que contêm os CDS necessários usando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante.
  12. Determinar a concentração de plasmídeo utilizando um espectrofotómetro.
  13. Preparar alíquotas de 20 ul e armazená-las a -20 ° C durante um tempo prolongado.
_title "> 2. A amplificação do plasmídeo inserções e adição de poli T-tail por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

  1. NOTA: Para obter o DNA molde para a transcrição in vitro (IVT), CDS de interesse, aqui eGFP, é amplificado utilizando PCR. Simultaneamente, um poli-T-cauda de 120 timidinas (T) é adicionada à pastilha utilizando um iniciador reverso com uma extensão de 120 t. Deste modo, os mRNAs gerados obter um poli A-cauda com um comprimento definido, após o IVT.
  2. Prepare a mistura de PCR conforme detalhado na Tabela 1.
  3. Misture a mistura de reacção completamente. NOTA: o produto de PCR pode ser usado em reacções 4-5 IVT. Para aumentar a quantidade de ADN molde para IVT, o volume total da mistura de PCR pode ser aumentada. Vários tubos de PCR de 100 ul de cada mistura de PCR contendo pode ser utilizado para obter um rendimento suficiente de produto de PCR.
  4. Inserir os tubos de PCR num termociclador e executar a PCR utilizando o protocolo de PCR de ciclismo (Tabela 2).
  5. Limpe o PCR reacção utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante e eluir o ADN, utilizando 20 ul de água livre de nuclease.
  6. Medir a concentração do ADN, utilizando um espectrofotómetro. NOTA: A concentração de DNA detectado é de aproximadamente 300 ug / ml. Assim, o montante total esperado deve ser ~ 6 mg. A quantidade de ADN para outras proteínas pode variar dependendo do comprimento da CDS, quantidade de plasmídeo utilizado para a PCR, a temperatura de emparelhamento de iniciadores, e o número do ciclo.
  7. Congelar o ADN a -20 ° C, durante um longo período de tempo ou usá-lo directamente para IVT.

Passo 3. Controlo: Qualidade do Produto PCR

  1. Para verificar a qualidade do produto de PCR por electroforese em gel de ADN.
  2. Misturar a quantidade desejada de agarose com TBE 1x num balão. Para um gel de agarose a 1%, adicionar 0,5 g de agarose com 50 ml de 1 x TBE.
  3. Micro-ondas, até a agarose é dissolvido. Não deixe ferver. Assegure-se que a agarose é completamente na solução.
  4. Adicionar 5 mL nucleico mancha gel de ácido para 50 ml de gel de agarose.
  5. Despeje o gel em uma caixa de gel de agarose, coloque o pente, e esperar cerca de 1 hora até que o gel solidificado.
  6. Retire o pente e colocar a caixa de gel em uma bandeja de gel.
  7. Misture 2 ul (200 ng) de 80-10,000 pb de ADN-Escada e 200 ng de produto de PCR, cada uma com 2 ul de tampão de carregamento 6x num volume total de 12 ul.
  8. Encher cuidadosamente amostras de ADN nos poços do gel de agarose.
  9. Usando 1 x TBE como tampão de corrida, correr o gel de agarose a 100 V durante 1 h.
  10. Visualizar as bandas de ADN em um sistema de imagem (Figura 2).

4. transcrição in vitro (IVT)

  1. NOTA: Após a PCR, os insertos de plasmídeo são amplificados e uma cauda poli-T é adicionado. Durante o IVT, a informação genética é transcrito a partir do DNA para o RNA. A transcrição do mRNA gerado é usado para produzir proteínas em células.
  2. Limpe a área de trabalho e pipetas com uma RNase dsolução econtamination. Use PCR pontas de pipeta dual-filtro limpo e esterilizado e mudam frequentemente de luvas para minimizar a contaminação da reação mistura com RNases.
  3. Prepare a mistura analógica NTP / cap, conforme descrito na Tabela 3.
  4. Misture a mistura analógica NTP / cap completamente em vórtice e mexer um pouco.
  5. Montar a mistura de reacção IVT como descrito na Tabela 4.
  6. Misture a mistura de reação IVT com cuidado pipetando cima e para baixo. Em seguida centrifugar o tubo de PCR rapidamente para recolher a mistura na parte inferior do tubo.
  7. Incubar a 37 ° C durante 3 horas num termomisturador.
    NOTA: O tempo de incubação óptimo depende do comprimento das inserções e a eficiência transcricional de determinado modelo. Para inserções curtas (<500 nt), um tempo de incubação mais longo pode ser vantajoso. Uma experiência ao longo do tempo pode ser realizado para determinar o tempo de incubação óptimo para um rendimento máximo. Por isso, criou reações FPI, para example, durante 1, 2, 3, 4, 6 hr, e a incubação durante a noite e determinar a quantidade de ARNm. A cinética da transcrição in vitro para a geração de mRNA eGFP é mostrado na Figura 3.
  8. Para remover o DNA molde, adicionar 1 ul de ADNase (2 U / ul) à mistura de reacção IVT, misturar bem e incubar 15 min a 37 ° C.
  9. Purifica-se a mistura de reacção utilizando um kit de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o mRNA modificado a partir da membrana coluna de rotação duas vezes com 40 mL de água livre de nuclease. NOTA: A concentração de ARN detectado é cerca de 1,500 ug / ml. Assim, o montante total esperado deve ser ~ 120 mg. A quantidade de mRNA sintetizados para outras proteínas pode variar dependendo do comprimento de CDS e a quantidade de produto de PCR utilizado para IVT.

5. Tratamento de mRNA purificado com Antártica Phosphatase

  1. NOTA: O mRNA gerado é tratado com fosfatase para remover 5 tri 'fosfatos, que podem ser reconhecidos por RIG-I e levam à activação imunitária. Além disso, o tratamento com fosfatase evita a re-circularização numa reacção de auto-ligação.
  2. Adicionar 9 mL de tampão de reação 10x fosfatase Antártida a 79 ml de solução de mRNA purificado. Posteriormente, adicionar 2 mL de fosfatase Antártica (5 U / mL) e misture delicadamente a amostra. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 30 min.
  3. Purifica-se a mistura de reacção utilizando um kit de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Eluir o ARNm modificado a partir da membrana coluna de centrifugação duas vezes com 50 mL de água livre de nuclease.
  4. Medir a concentração dos ARNm modificados utilizando um espectrofotómetro. Verificar que a razão de absorvância a 260 nm / 280 nm (A 260 / A 280) é ≥ 1,8 e a proporção de A 260 / A 230 é de 2,0, o que indica pureza.
    NOTA: O rendimento total esperado deve ser aproximadamente de 90 ug, que é sufficient por aproximadamente 36 transfections mRNA.
  5. Ajustar a concentração de mRNA de 100 ng / mL por adição de água livre de nuclease.
  6. Alíquota o ARNm modificado em alíquotas de uso único necessários para transfecções e armazenar a -80 ° C. Evite múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. Devidamente preparado e armazenado ARNm é estável durante muitos anos. Durante o trabalho, mantenha sempre o mRNA modificado no gelo.

6. Controle de Passo: Qualidade de mRNA Modificado Sintetizado

  1. Verificar a qualidade de ARNm modificado por electroforese em gel de ARN.
  2. Misturar a quantidade desejada de agarose com TBE 1x num balão. Para um gel de agarose a 1%, adicionar 0,5 g de agarose com 50 ml de 1 x TBE.
  3. Micro-ondas, até a agarose é dissolvido. Não deixe ferver. Assegure-se que a agarose é completamente na solução.
  4. Adicionar 5 mL nucleico mancha gel de ácido para 50 ml de gel de agarose.
  5. Despeje o gel em uma caixa de gel de agarose, coloque o pente, e esperar cerca de 1 hora até que o gel é solidified.
  6. Retire o pente e colocar a caixa de gel em uma bandeja de gel.
  7. Misturar 3 ul (3 ug) de 0,5-10 kb ARN Escada e 200 ng de cada mRNA sintetizados modificado com tampão de carga 7 ul num volume total de 10 ul. A composição do tampão de carga é descrita na Tabela 5.
  8. Desnaturar a escada e as amostras de ARNm, a 70 ° C durante 10 min.
  9. Carregar cuidadosamente a escada e as amostras de ARNm sobre o gel de agarose a 1%.
  10. Efectuar a electroforese a 100 V durante 1 h utilizando 1 x TBE como tampão de corrida.
  11. Visualizar a escada e bandas de ARNm num transiluminador de UV e uma fotografia utilizando um sistema de documentação de gel (Figura 4).

7. Preparação de células para transfecção

  1. Placa 2 x 10 5 células (células HEK293) por poço da placa de 12 poços.
  2. Incubar as células durante a noite a 37 ° C num incubador celular. NOTA: No dia da transfecção, as células devem ter reacele tinha 80-90% de confluência.

8. Realizar mRNA transfecção de células

  1. Descongelar o ARNm modificado.
  2. Gerar os lipoplexos para transfecção.
  3. Adicionar 25 ul (2,5 ug) de ARNm modificado e 2 ul de reagente de transfecção de lípido catiónico para 473 ul de Opti-MEM (Meio Essencial Mínimo) I de meio de soro reduzido para gerar a mistura de transfecção para a transfecção de um poço de uma placa de 12 poços. Dimensionar-se os volumes de acordo com o número de poços a serem transfectadas. Como controle negativo, prepare uma mistura de transfecção sem mRNA.
  4. Misturar os componentes com cuidado por pipetagem. Incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente durante 20 min para gerar lipoplexos para transfecção.
    NOTA: A mistura de transfecção não contém antibióticos. Assim, tome cuidado para garantir a esterilidade durante o manuseio de células.
  5. Lavar as células com DPBS 500 ul / poço.
  6. Adicionar 500 ul mistura de transfecção para um poço de uma pla de 12 poçoste.
  7. Incubar as células durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
  8. Aspirar a mistura de transfecção e juntar 1 mL de meio de cultura de células completa para as células.
  9. Incubar as células durante 24 horas na incubadora celular.
  10. Realizar fluorescência microscópica análises utilizando um microscópio de fluorescência (Figura 5). NOTA: Para analisar a expressão de outras proteínas nas células, as quais são produzidas através de transfecção com o outro do que o ARNm de codificação de mRNA eGFP, as células podem ser cultivadas em lamelas. Em seguida, a transfecção pode ser realizada e as células podem ser coradas com anticorpos apropriados e analisadas por microscopia de fluorescência.

9. A análise de citometria de fluxo de eGFP Expressão em Células

  1. Remover o meio de cultura de células a partir dos poços e lavar cada poço 1 ml com DPBS (sem cálcio e magnésio). Adicionar 500 ul de tripsina / EDTA por cavidade para destacar as células da superfície das placas de cultura de células. Posteriormente, adicione 500TNS ul por cavidade para inactivar a tripsina.
  2. Centrifugar as células destacadas durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. Retirar o sobrenadante, deixando apenas o sedimento. Ressuspender o sedimento celular em 150 ul solução de fixação de células e transferir a suspensão de células para um tubo de citometria de fluxo.
  3. Analisar a percentagem de células que expressam eGFP e da intensidade de fluorescência utilizando Geo média (média geométrica da intensidade de fluorescência) (Figura 6).

10. A medição da expressão da proteína ao longo do tempo

  1. Realizar ARNm de transfecção de células em três poços de uma placa de 12 poços tal como descrito no passo 8. Para além disso, incubar três poços de células HEK293 com a mistura de transfecção sem a adição de ARNm.
  2. Medir a expressão de eGFP 1, 2, e 3 dias após a transfecção para avaliar a duração da expressão da proteína (Figura 7).

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Resultados

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Usando um plasmídeo pcDNA 3.3 contendo CDS da eGFP, a síntese de mRNA eGFP foi estabelecida modificada (Figura 1). Após a amplificação por PCR de inserção e poli-T-cauda, ​​uma banda clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb é detectado (Figura 2). Aumentando o tempo de FPI aumentou o rendimento de ARNm (Figura 3). Após o IVT, uma banda de ARNm clara com um comprimento de, aproximadamente, 1.100 pb foi detectado, o que corresponde ao comprimento do mRNA eGF...

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Discussão

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A terapia de ARNm tem um tremendo potencial no campo da medicina regenerativa, tratamento de doenças e de vacinação. Neste vídeo, que demonstram a produção de um ARNm modificado estabilizado para a indução da expressão da proteína nas células. Usando este protocolo, outros ARNm desejados podem ser gerados. A síntese in vitro do ARNm modificado permite a transfecção de células com mRNAs desejadas para induzir a expressão de proteínas alvo. Deste modo, a proteína desejada é expressa transientemente em condições f...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este projeto foi financiado pelo Fundo Social Europeu, em Baden-Württemberg, Alemanha.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cultura de células
DMEM, alta glicosePAAE15-009
FBSLife Technologies10500
Penicilina/Estreptomicina PAAP11-010100x
L-glutamina PAAM11-004200 mM
DPBS sem cálcio e magnésio PAAE15-002
0.04% Tripsina / 0.03% EDTA PromocellC-41020
TNSPromocellC-41120Solução Neutralizante de Tripsina, inibidor de tripsina a 0,05% em células BSA
HEK-293ATCCCRL-1573
Consumíveis
Placas de cultura de tecidos, 12 poços Corning3512
Frasco de cultura de células (75 cm2) Corning430641
tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 ml livres de DNase e RNase Eppendorf0030 121.589Safe-Lock, Tubos
cônicos Biopur de 15 ml greiner bio-one188271
PCR limpa e estéril epT.I.P.S. pontas de pipeta de filtro duplo Eppendorf10 µ l: 022491202; 100 µ L: 022491237; 1.000 µ l: 022491253
Cryovialgreiner bio-one122279-128Cryo.s 
Tubo de fundo redondo de polipropileno de 14 ml para cultura bacteriana BD Falcon352059
Amplificação e purificação de plasmídeos
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid Addgene26822
One Shot Top10 componente químico Escherichia coli InvitrogenC4040-10
Água estéril (Ampuwa)Fresenius Kabi1636071
LB médio (Luria/Miller) Carl RothX968.1Dissolver 25 g L-1 in água estéril.
Ágar LB (Luria/Miller) Carl RothX969.1Dissolver 40 g L-1 in água estéril.
Solução Pronta para AmpicilinaSigma AldrichA5354100 mg/ml 
AldrichG2025Sigma Glycerol
Qiagen27104
produção de mRNA
Kit de Polimerase HiFidelity HotStar dede PCR Qiagen
QIAquick Kit Qiagen28106
MEGAscript T7Life TechnologiesAM1334
5-Metilcitidina-5&agudo;-trifosfato TrilinkN10145-metil-CTP
pseudouridina-5&agudo;-trifosfato TrilinkN1019Pseudo-UTP
3´<;->O-Me-m7G(5&agudo;)ppp (5&agudo;)G RNA cap structure analog New England BiolabsS1411L
RiboLock RNase InhibitorThermo ScientificEO038140 U/µ l 
TURBO DNaseLife TechnologiesAM13342 U/µ l (do Kit MEGAscript T7)
Fosfatase antártica England BiolabsMO289S
RNeasy Solução Qiagen74104
RNaseZap Life TechnologiesAM9780
Transfection
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen11668-019Reagente de transfecção lipídica catiônica
Opti-MEM I Mídia de soro reduzida Invitrogen11058-021Meio Essencial Mínimo Melhorado (MEM) que permite uma redução da suplementação de Soro Fetal Bovino (FBS) 
Eletroforese em gel
AgaroseSigma-AldrichA9539
Gelred Nucleic Acid Gel StainBiotium4100310,000x em água 
Mix de Gama peqGOLD DNA-Ladder Peqlab25-2210
Análises de citometria de fluxo
CellFIX (1x)BD Biosciences34018110x concentrado 
Primer para amplificação de inserção e PCR de cauda poli (T)
Forward Primer (grau HPLC) 10 µ MElla Biotech5&agudo;-TTGGACCCTCGTAC
AGAAGCTAATACG-3&agudo;
Primer reverso (grau HPLC) 10 µ MElla Biotech5´- T120-CTTCCTACT
CAGGCTTTATTCAA
AGACCA-3&agudo;
Equipment
Cell incubatorBinderCO2 (5%) e O2 (20%) 
Contador de células CASY Schä rfe System
Bancada de trabalho estéril BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Incubadora bacterianaEspectrofotômetro ScanDrop para
Termociclador analítico Jena
PCRMicrocentrífuga Eppendorf Eppendorf
Vortexpeqlab
ThermomixerEppendorf
Aparelho de gel para eletroforese Sistema de documentação Bio-Rad
Gel Sistema Bio-Rad
FACScan Microscópio de fluorescência BD Biosciences
Microscópio
 Zeiss
a 0,1% Kit de Minipreparação Spin Spin QIAprep Kit Purificação 202602 Kit mini New banho-maria Incutec de contraste de fase Nikon

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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