A pele adulta de C. elegans é um modelo tratável para estudos de respostas epiteliais de feridas, incluindo fechamento de feridas, formação de cicatrizes e imunidade inata.
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Artigo de método
Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no C. elegans
Neste artigo
Resumo
Resumo
A C. elegans epiderme e cutícula formar uma camada de pele simples mas sofisticado que pode reparar danos localizados resultante do ferimento. Os estudos da resposta de feridas e reparação neste modelo ter iluminado a nossa compreensão do citoesqueleto e respostas genómicas para danos nos tecidos. Os dois métodos mais comumente usados para ferir a C. elegans pele de um adulto são picadas com agulhas microinjeção, e irradiação com laser local. Agulha ferindo interrompe localmente a cutícula, epiderme, e matriz extracelular associada, e também podem danificar os tecidos internos. Resultados da irradiação com laser em danos mais localizada. Ferimento desencadeia uma sucessão de respostas prontamente ensaiada, incluindo epidérmico elevada Ca 2+ (segundo minutos), a formação e fecho de um anel que contém actina no sítio da ferida (1-2 hr), a transcrição de genes elevada de péptidos antimicrobianos (2-24 hr), e formação de cicatriz. Essencialmente todos os animais adultos de tipo selvagem sobrevivem ferimento, ondecomo mutantes defectivos na reparação de feridas ou outras respostas mostram diminuição sobrevivência. Protocolos detalhados para agulhas e ferimento a laser, e ensaios para a quantificação e visualização de respostas feridas e processos de reparação (dinâmica de Ca, dinâmica de actina, indução peptídeo antimicrobiano e sobrevivência) são apresentados.
Introdução
Pele ferida mecanismos de cura são de interesse biológico básico e relevantes para a saúde humana. Cicatrização de feridas nos animais vertebrados e mamíferos compreende uma série complexa de respostas coordenadas de vários tecidos e de sinalização 1. Muitas simples organismos modelo genético também são capazes de curar feridas de pele 2. É, portanto, de interesse para analisar modelos geneticamente tratáveis de reparação de feridas de pele. Nós e os outros começaram a usar Caenorhabditis elegans como novo modelo para a pele ferida cura 3,4. O objetivo deste protocolo é permitir que um conjunto mais amplo de pesquisadores p....
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Protocolo
Os seguintes protocolos de descrever o procedimento detalhado para C. elegans pele ferindo e para ensaiar respostas feridas.
1. Needle Ferimento 3,4
- Crescer vermes unstarved saudáveis na NGM standard (meio de crescimento nematóide) placas com E. bactérias coli OP50 como alimentos, mantidos em um 20 ° C incubadora.
NOTA: Os métodos para placas de agar NGM e cultivo de rotina de C. elegans pode ser encontrada em www.wormbook.org 6. - Escolha 25 L4 vermes palco para um recém-semeadas placa 1 dia antes ferindo e cultura a 20 ° CO / N.
- Antes ferindo....
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Resultados
Laser ou agulha ferimento irá desencadear uma elevação rápida e sustentada dos níveis de Ca epidérmicas, como visualizado com sensores Ca como GCaMPs (Figura 1). A elevação Ca ocorre em poucos segundos, e permanece elevada por dezenas de minutos. Agulha ferindo reprodutivelmente resulta na formação de anéis de F-actina em locais de ferida (Figura 2); estas aparecem dentro de minutos, e fechar gradualmente ao longo de 1-2 horas após o ferimento. Anéis de actina são menos frequentemente f.......
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Discussão
Os métodos apresentados aqui por agulha e ferimento a laser oferecem abordagens complementares para avaliar a capacidade do epitélio epidérmico para reparar os danos. Ferimento Laser é relativamente localizada e (dependendo da configuração laser) pode ser confinado à epiderme, enquanto ferimento agulha interrompe a epiderme, cutícula e membranas basais internos prováveis. Ferimento Needle pode assemelhar-se com mais precisão as feridas infligidas por patógenos ou danos mecânicos no ambiente natural. Como regra geral, ag.......
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Divulgações
Os autores não estão cientes de quaisquer interesses conflitantes.
Agradecimentos
Os métodos de ferimento por agulha para C. elegans foram desenvolvidos pela primeira vez por Nathalie Pujol e Jonathan Ewbank; agradecemos a Nathalie Pujol pelos comentários sobre o manuscrito. O trabalho em nosso laboratório no reparo de feridas epidérmicas de C. elegans é apoiado por uma bolsa do NIH para ADC (R01 GM054657).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| de | Agarose Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Tritech Research | T3308 | 60 mm | |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Capilar de vidro borossilicato | Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Extrator de agulhas | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Picareta sem-fim (fio de platina) | Tritech Research | PT-9010 | |
| Solução M9 | Caseiro | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 litro. Esterilizar por autoclave | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml para 50 minhocas |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| Bio-Rad | C1000/CFX96 | ||
| Tubos de PCR de 96 poços | Software de análise de imagem Bio-Rad | MLL9601 | |
| Metamorfo | de Dispositivos Moleculares |
Referências
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol<....
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Reimpressões e permissões
