Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito, Aedes albopictus

Summary

RNA-Seq as análises estão se tornando cada vez mais importantes para identificar os fundamentos moleculares de características adaptativas em organismos não modelo. Aqui, um protocolo para identificar genes diferencialmente expressos entre mosquitos Aedes albopictus diapausados e não diapausados é descrito, desde a criação de mosquitos até o sequenciamento de RNA e análises de bioinformática de dados de RNA-Seq.

Abstract

A diapausa fotoperiódica é uma adaptação importante que permite que os indivíduos escapem de ambientes sazonais hostis por meio de uma série de mudanças fisiológicas, principalmente a parada do desenvolvimento e a redução do metabolismo. O perfil de expressão gênica global via RNA-Seq pode fornecer informações importantes sobre os mecanismos transcricionais da diapausa fotoperiódica. O mosquito tigre asiático, Aedes albopictus, é um organismo notável para o estudo das bases transcricionais da diapausa devido à sua facilidade de criação, diapausa facilmente induzida e aos recursos genômicos disponíveis. Este manuscrito apresenta um fluxo de trabalho experimental geral para identificar diferenças transcricionais induzidas por diapausa em A. albopictus. Técnicas de criação, condições necessárias para induzir o desenvolvimento de diapausa e não diapausa, métodos para estimar a porcentagem de diapausa em uma população e extração de RNA e avaliação de integridade para mosquitos estão documentados. Um fluxo de trabalho para processar dados de RNA-Seq de sequenciadores Illumina culmina em uma lista de genes diferencialmente expressos. Os resultados representativos demonstram que este protocolo pode ser usado para identificar efetivamente genes regulados diferencialmente no nível transcricional em A. albopictus devido a diferenças fotoperiódicas. Com ajustes modestos, esse fluxo de trabalho pode ser prontamente adaptado para estudar as bases transcricionais da diapausa ou outras características importantes da história de vida em outros mosquitos.

Introduction

Avanços rápidos nas tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) estão oferecendo oportunidades empolgantes para investigar os fundamentos moleculares de uma ampla gama de adaptações ecológicas geneticamente complexas em uma ampla diversidade de organismos não modelo^1–3. Essa abordagem é extremamente poderosa porque estabelece uma base para estudos genômicos populacionais e funcionais de organismos com uma ecologia ou história evolutiva especialmente interessante e/ou bem descrita, bem como organismos de preocupação prática, como pragas agrícolas e vetores de doenças. Assim, as tecnologias NGS estão levando a rápidos avanços ....

Protocol

1. larval criação de duas A. Grupos albopictus à Idade Adulta

1. Definir dois armários de fotoperíodo com iluminação programável a 21 ° C para a expressão diapause óptima ¹⁶ e cerca de 80% de umidade relativa.
   1. Programa de um gabinete para a 16L: luz 8D: ciclo escuro (a não diapausa induzindo LD fotoperíodo). Defina o segundo armário para um 8L: 16D luz: ciclo escuro (diapausa induzindo) ^13.
   2. 'Luzes sobre' programa ao mesmo tempo em ambos os armários para sincronizar o tempo circadiano entre fotoperíodo.
2. Calcular a quantidade de ovos necessários para a realização da experiênc....

Results

Fluorometria de duas amostras de RNA representativos mostraram duas bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). O ARN ribossómico 28S de insectos é composta de duas cadeias polinucleotídicas mantidas juntas por ligações de hidrogénio, que são facilmente rompidas por breve aquecimento ou agentes que perturbam a ³⁵ ligações de hidrogénio. Os dois componentes resultantes são aproximadamente do mesmo tamanho que o ARN ribossómico 18S. A segunda amostra de RNA apresentaram altos níveis de deg.......

Discussion

Este protocolo apresenta métodos para descobrir genes diferencialmente expressos, devido à photoperiodically diapausa induzida em A. albopictus. O protocolo é significativo na medida em que combina de forma única de criação do mosquito e técnicas de bioinformática para fazer todos os aspectos experimentais de um programa de fisiologia molecular acessível a usuários novatos - em especial para as que incidam sobre a resposta ao fotoperíodo diapausa. Os métodos existentes, a nosso conhecimento, não forneça o máxim.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubadora - Modelo 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Sala de ambiente controlado	Thermax Scientific	N/A	Sala de ambiente controlado walk-in construída de acordo com especificações personalizadas pela Thermax Scientific Products. Uma alternativa maior para uma incubadora. http://thermmax.com/
Lâmpada fluorescente	fria Philips	392183	4 W
Placa de Petri 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Papel de filtro 20,5 cm	Fisher	09-803-6J
Balde de 9,5 L Plastican		Bway Products	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utility Tecido-Mosquiteiro Branco	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Meias ortopédicas	Albahealth	23650-040	produto no. 081420
Passas Orgânicas	Newman's Own	UPC: 884284040255
Copos de oviposição (marrom)	Fisher Scientific	03-007-52	O produto é na verdade uma garrafa âmbar de 125 ml que vimos na tampa.
Toalhas de Papel Reciclado	Sétima Geração	30BPT120
Modular Mates Conjunto Tupperware Quadrado	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
	Corning Incorporated	7727-2	Estes moedores de tecido Tenbroeck quebram os ovos e liberam RNA no Reagente TRI.
Reagente TRI	Sigma Aldrich	T9424	Aplique 1 ml de reagente TRI por 50-100 mg de tecido. Atenção — Este reagente é tóxico.
TURBO DNA-free	Ambion/Life Technologies	AM1907	Este kit gera maior rendimento do que o tratamento tradicional de DNase seguido de limpeza de fenol/clorofórmio, e é mais simples de usar.
RNaseZap	Ambion / Life Technologies	AM9782	Aplique generosamente nas superfícies da bancada e em qualquer equipamento que possa estar em contato com as amostras de RNA. A solução é ligeiramente alcalina / corrosiva, pode causar irritação e é prejudicial quando ingerida.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Coloque até 12 amostras de RNA em um chip.
Alimentador de Membrana	Hemotek Hemotek	5W1	Este sistema fornece 5 estações de alimentação que podem ser usadas simultaneamente. Inclui unidade de alimentação PS5 e cabo de alimentação; 5 Alimentadores FUI + Reservatórios de Refeição e O-rings; Plugues de plástico, membrana de alimentação de colágeno Hemotek; Ferramenta de ajuste de temperatura; e ferramenta de extração de plugue. O endereço de correspondência da empresa é: Hemotek Ltd; Unidade 5 Tribunal da União; Alan Ramsbottom Caminho; Grande Harwood; Lancashire, Reino Unido; BB6 7FD; Tel: +44 1254 889 307.
Termômetro Digital e Sonda	Hemotek	Termômetro MT3KFU	MicroT3 e sonda KFU. Isso é usado para definir a temperatura de cada unidade de alimentação FOI.
Sangue total de frango, não estéril com citrato de sódio	Pel-Freez Biologicals	33130-1	Os 500 ml de sangue foram congelados e armazenados em alíquotas de 20 ml a -80 ° C por até 1 ano. Descongele o sangue em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora antes de usar.