A glândula lacrimal (LG) é um órgão de ramificação que produz os componentes aquosos de lágrimas necessários para a manutenção da visão e saúde ocular. Aqui nós descrevemos murino LG dissecção e ex vivo de técnicas de cultura de decifrar as vias de sinalização envolvidas na LG desenvolvimento.
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Artigo de método
Manipulando o Murino lacrimais Gland
Neste artigo
Resumo
Resumo
A glândula lacrimal (LG) segrega lágrimas aquosas necessárias para a manutenção da estrutura e função da córnea, um tecido transparente essencial para a visão. No ser humano uma única LG reside na órbita acima da extremidade lateral de cada olho entregar lágrimas para a superfície ocular através de 3-5 condutas. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal exorbital (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido. Semelhante a outros órgãos glandulares, o LG desenvolve através do processo de epitelial morfogénese de ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensada é submetido a vários ciclos de gema e formação adesiva para formar uma intrincada rede interligada de ácinos secretora e condutas. Este processo elaborado tem sido bem documentado em muitos outros órgãos epiteliais, tais como o pâncreas e glândulas salivares. No entanto, a LG tem sido muito menos explorado e os mecanismos que controlam a morfogênese são mal sobse levantou. Suspeitamos que essa sub-representação como um sistema modelo é uma conseqüência das dificuldades associadas com a descoberta, dissecando e cultivando a LG. Assim, aqui descrevemos técnicas de dissecação para a colheita embrionário e pós-natal LG e métodos para a ex vivo da cultura do tecido.
Introdução
A glândula lacrimal (LG) é responsável pela secreção de lágrima aquosa crítica para a acuidade visual e a saúde, a manutenção e a protecção das células da superfície ocular. LG resultados disfunção em um dos distúrbios oculares mais comuns e debilitantes: doença de olho seco deficiente aquosa, o qual é caracterizado por irritação ocular, sensibilidade à luz e uma visão diminuída. No ser humano o LG reside na órbita acima da extremidade lateral do olho onde 3-5 excretores lágrimas condutas de depósito sobre a superfície ocular. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal (LG) anterior localizado e ventral ao ouv....
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Protocolo
Todo o trabalho animal foi realizada sob estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade da Califórnia, em San Francisco.
1. embrionárias de camundongos lacrimais Glândulas (LG): Colheita e Microdissection
- Seguindo os procedimentos aprovados pelos Animais institucionais para a comissão de Ética de Pesquisa Científica, eutanásia cronometrado CD-1 (ou transgênicos) fêmeas grávidas com o aumento da inalação de CO 2, seguido de confirmação por d....
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Resultados
O LG desenvolve através do processo de ramificação epitelial morfogénese. Imagens de campo claro de GL embrionárias dissecados em e14, e15, e16, e17, e P2 ilustrar este evento.
Figura 1. A LG desenvolve através do processo de ramificação morfogênese epitelial. Imagens de campo claro de GL embrionárias recentemente dissecados em.......
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Discussão
A versatilidade de cultura e manipular o LG ex vivo proporciona vantagens significativas para estudar o seu desenvolvimento. Isto inclui a velocidade a que o pesquisador é capaz de testar hipóteses e a multiplicidade de perturbações que podem ser realizados para avaliar a forma como epitelial, neuronais, células endoteliais e mesencyhmal interagem para formar o órgão. No entanto, há um número de advertências para a utilização deste modelo. Em primeiro lugar, em virtude de seu isolamento a glândula não está mais.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer financiamento concedido pelo Programa de Alocação de Recursos UCSF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 sem HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicilina-Estreptomicina | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| de soro bovino | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| 16% | 15710 | Ciências de Microscopia Eletrônica | Diluída a 4% em 1x Solução |
| tamponada com fosfato PBS 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Preparado a partir de 10x | ||
| estoque holo-Transferrin bovino | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml de solução-mãe em água. Congelar alíquotas de uso único em -20 °C. Adicionar ao meio DMEM/F12 até uma concentração final de 50 μ g/ml. |
| Ácido L-ascórbico (Vitamina C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml de solução-mãe em água. Congelar alíquotas de uso único em -20 °C. Adicionar ao meio DMEM/F12 até uma concentração final de 50 μ g/ml. |
| Placas tratadas com cultura de tecidos BioLite 100 mm | 130182 | placas | não tratadas com cultura de tecidos da Thermo Scientific também podem ser usadas. |
| Microscópio estéreo com iluminador de subestágio | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Qualquer microscópio de dissecação estéreo pode ser usado com uma base de luz transmitida. |
| Base do iluminador de subestágio para microscópio estéreo | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Placas tratadas com cultura de tecidos | 353001 | Corning | Placas não tratadas com cultura de tecidos também podem ser usadas. |
| Pratos de fundo de vidro não revestido de 50 mm | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Microscópio de fluorescência de campo amplo | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Qualquer microscópio de fluorescência (microscópio vertical, invertido ou de dissecação estéreo) pode ser usado para monitorar a expressão de GFP em baixa ampliação com uma câmera digital acoplada. |
| Microscópio Confocal | TCS SP5 | Leica Microsystems | A microscopia confocal é necessária para ver as estruturas celulares detalhadas. Qualquer microscópio confocal pode ser usado. |
| Pinça Micro-Fina SWISS, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | São necessárias pontas finas para remover o mesênquima do epitélio. Agulhas de tungstênio também podem ser usadas. |
| Pinça de Ponta Padrão Dumont, #5 (11 cm) | 91150-20 | Ferramentas de Belas Ciências (EUA), Inc. | Ideal para a colheita de glândulas de embriões. |
| Alças de faca cirúrgica de plástico reutilizáveis, estilo nº 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Lâminas cirúrgicas estéreis de aço inoxidável, nº 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| AM1931 | Life Technologies | ||
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml diluído 1:1 com DMEM/F12 |
| Gravidez cronometrada Crl:CD1(ICR) camundongos | Charles River | Labs Os embriões são colhidos no dia 14 (com o dia da descoberta do plugue designado como dia 0). | |
| Membranas Hidrofílicas Gravadas com Trilha de Nucleóporos, 0.1 μ m tamanho do poro, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Cronometrado Grávida Pax6-Cre, camundongos GFP | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson | Laboratory Camundongos opcionais para aprender a localizar o LG. |
Referências
- Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).
- Makarenkova, H. P., et al. FGF10 is an inducer and Pax6....
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Reimpressões e permissões
