Utilizando a pedido de clientes Galvanotaxis Chambers para Estudar Direcional migração das células da próstata

Resumo

Apresentamos um método para aplicar um campo elétrico fisiológico a células migratórias e imortalizadas da próstata em uma câmara de galvanotaxia feita sob medida. Usando este método, demonstramos que 2 linhas de células prostáticas não tumorigênicas demonstram diferentes graus de direcionalidade de migração no campo.

Resumo

O campo eléctrico fisiológico serve funções biológicas específicas, tais como dirigir a migração de células no desenvolvimento embrionário, crescimento neuronal e reparação epitelial. A aplicação de um campo eléctrico de corrente directa para células cultivadas in vitro, induz a migração de células direccional, ou galvanotaxis. O método galvanotaxis 2-dimensional demonstramos aqui é modificado com feito por encomenda poli (cloreto de vinilo) (PVC) câmaras, superfície de vidro, eléctrodos de platina e a utilização de uma fase motorizada no qual as células são criadas imagens. As câmaras de PVC e eletrodos de platina apresentam baixa toxicidade e são acessíveis e re-utilizável. A superfície de vidro e a platina motorizada microscópio melhorar a qualidade das imagens e permitir a possibilidade de alterar a superfície do vidro e tratamentos para as células. Filmamos o galvanotaxis de dois, linhas de células não-tumorais imortalizada com SV40 próstata, PRN-1-1 e PNT2. Estas duas linhas de células mostram velocidades de migração semelhantes e ambos migrar em direcçãocátodo, mas mostram um grau diferente de direcionalidade em galvanotaxis. Os resultados obtidos através deste protocolo sugerem que os PRN-1-1 e as linhas de células PNT2 podem ter diferentes características intrínsecas que governam as suas respostas migratórias direcionais.

Introdução

Campos eléctricos endógenos são detectados em vários tecidos, tais como ^{pele, 1, 32, 33} e ² cérebro. O campo eléctrico fisiológico serve funções biológicas particulares, incluindo a orientação desenvolvimento embrionário ^{3, 4,} guiando o crescimento de processos neuronais ^{5, 6} e promoção do epitélio da córnea e o fechamento da ferida ^{1, 7.} In vitro, a aplicação de um campo eléctrico de corrente directa para células cultivadas imita o campo elétrico fisiológico e induz a migração de células direcional, ou galvanotaxis. Galvanotaxis foi estudado em fibroblastos ^8, queratinócitos de peixe ^9,<....

Protocolo

1. A cultura da próstata Células

1. Cultura A PRN-1-1 e PNT2 próstata células em placas de 100 mm de cultura em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e Antibiótico-antimicótico a 37 ° C com 5% de CO _2. Refrescar o meio de cultura todos os dias até as células atingirem a confluência de 80% para as experiências galvanotaxis.

2. Montagem Galvanotaxis Chambers

1. Montagem câmaras inferiores
   1. Wipe uma câmara galvanotaxis plástico com 2-propanol. Aplicar o selante de silicone de grau marinho em torno das aberturas circulares no lado inferior de uma câmara com uma seringa e fixar uma grande lamela

Resultados

Duas linhas de células da próstata (PRN-1-1 e PNT2) foram investigadas com este método. As células em ambas as linhas de migrar a velocidades similares de 1,0 +/- 0,3 micra / min ao longo de 2 horas (Figura 5A). No entanto, o direccionamento para o campo eléctrico é de 0,7 +/- 0,3 para a PRN-linha 1-1, e 0,2 +/- 0,8 para a linha PNT2 (Figura 5B). Os resultados mostram uma diferença significativa na galvanotaxis destas duas linhas celulares (p <0,01, as células foram rastreados 100), .......

Discussão

A análise da resposta galvanotaxis de uma célula tem sido um importante indicador funcional para muitos migratório celular ou crescimento processa ^{27, 28.} Aqui usamos uma câmara feito por encomenda com superfície de vidro para filmar duas linhas de células da próstata. Estas linhas de células demonstraram diferentes graus de galvanotaxis, e especula-se que a localização intracelular ou da activação das proteínas de mediar galvanotaxis pode ser interferido durante o processo de geração de linhas de células imo.......

Materiais

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cells
pRNS-1-1 células			Lee, et al. (1994)
Células da próstata PNT2	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	aquece até 37 &graus; C antes do uso
Soro Fetal Bovino - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% em PBS, aqueça até 37 &graus; C antes
de usar Antibiótico-Antimicótico (100x)	Life Technologies	15240	adicione 5 ml a 500 ml de meio
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-		137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 e 1,5 mM KH2PO4 em 1.000 ml de H2 O, pH para 7,4 e autoclavado, aquecer até 37 &graus; C antes de usar
0,25% de tripsina-EDTA	Invitrogen	25200-056	aquece até 37 &graus; C antes de usar, trate as células por 3-5 min a 37 & C
Dispositivo Galvanotaxixe
Câmaras Galvanotaxis	Precision Plastics Inc, CA		Personalizado (1/4" x 2" x 3,5"), câmaras de PVC transparentes e não tóxicas. Entre em contato com os autores para obter as especificações do projeto.
Eletrodos Galvanotaxis	UCD eletrodos	enrolados de platina para
de energia Galvanotaxis	Engenharia de substrato, CA		de energia CC projetada sob medida com voltímetro
Vidro de cobertura do microscópio, grande, 45 x 50 mm, nº 1.5	Fisher	12-544-F
Vidro de cobertura do microscópio, pequeno, 25 x 25 mm, nº 1	ThermoScientific	3307
Marcador de ponta de diamante	ThermoScientific	750
Selante de silicone de grau marinho, transparente	3M	051135-08019
Graxa de alto vácuo	Dow Corning	2021846-0807
Seringa de 6 ml	Fisher Scientific	05-561-64
Seringa Nichiryo, 1,5 ml	Nichiryo	SG-M
Aplicadores de algodão	Produtos Médicos Purtian	806-WC
Qtips	Johnson & Tubo
	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	faz solução de ágar 2%
Lâmina de barbear	Personna	74-0001
Equipamentos e Software
Centrífuga de Bancada	Eppendorf	5810R	operada com um rotor A-4-62
Celômetro Auto T4	Nexcelom	Câmaras de contagem de celômetro T4
	Nexcelom	CHT4-SD100-002	carga 20 μ l soluções celulares para contar
Temperatura de Cultura Placa de aquecimento	Bel-Art Scienceware	370150000	para manter as câmaras de galvanotaxia em 37 ° C
Microscópio Eclipse TE-2000 com platina motorizada e câmara ambiental	Lente objetiva Nikon
Plan Fluor 10X/0.30
Retiga EX	Câmara	CCD refrigerada Qimaging, monocromática, ar comprimido de 12 bits
	FileMaker
Microsoft Excel 2008 para Mac	Microsoft

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