Summary
Um módulo para microscopia de iluminação plano único (SPIM) está descrito que é facilmente adaptado a um microscópio de campo amplo invertido e optimizado para culturas de células de 3-dimensionais. A amostra está localizado dentro de um capilar rectangular, e através de um sistema de microfluidos corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou de drogas pode ser aplicada em pequenas quantidades.
Abstract
Um módulo de folha de luz ou microscopia de iluminação plano único (SPIM) está descrito que é facilmente adaptado a um microscópio de campo amplo invertido e optimizado para culturas de células de 3-dimensional, por exemplo, esferóides multicelulares tumorais (TCM). As formas de módulos SPIM excitação e deflecte a luz de tal modo que a amostra é iluminada por uma folha de luz perpendicular ao percurso de detecção do microscópio. O sistema é caracterizado pela utilização de um capilar para a realização rectangular (e em uma versão avançada também por uma abordagem de micro-capilar para rotação) das amostras, através de ajuste da folha síncrono de luz que ilumina a lente objectiva e usado para a detecção de fluorescência, bem como , por adaptação de um sistema de microfluidos para a aplicação de corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou drogas em pequenas quantidades. Um protocolo para trabalhar com este sistema é dado, e alguns detalhes técnicos são relatados. Os resultados representativos incluem (1) medição da acimater de uma droga citostática (doxorrubicina) e a sua conversão parcial para um produto de degradação, (2) as medições redox por utilização de um sensor de glutationa geneticamente codificado por adição de um agente oxidante, e (3) a iniciação e rotulagem de necrose celular da inibição da a cadeia respiratória mitocondrial. Diferenças e vantagens da presente módulo SPIM em comparação com os sistemas existentes são discutidos.
Introduction
Além de métodos bem estabelecidos (confocal ou multi-fotão microscopia de varredura a laser 1-4, estruturado de microscopia de iluminação 5,6) folha de luz ou de microscopia de iluminação plano único (SPIM) tem provado ser um método valioso de imagens 3D 7,8, 9. De particular interesse é a sua aplicação a culturas de células de 3 dimensões, como por exemplo, esferóides multicelulares tumorais (TCM), que são cada vez mais utilizados para a investigação de descoberta de fármacos 10,11. Além disso, o SPIM é um método preferencial quando mesmo após a exposição a longo prazo ou medidas repetidas doses de pouca luz são necessárias para manter a viabilidade da amostra, uma vez que para a medição de cada plano da amostra somente este plano será exposto à luz. Isto está em contraste com outras técnicas de microscopia, em que para a detecção de cada plano focal toda a amostra é iluminado, de modo que após a gravação de numerosos aviões as somas de dose de luz e podem danificar-se a amostra 12. A microscopia de luz ou SPIM folha baseia-se na iluminação da amostra no sentido perpendicular à linha de observação ou pela utilização de uma lente cilíndrica, ou através da leitura do feixe de laser excitante (para uma revisão ver ref. 8). Isso muitas vezes requer câmaras de amostras especiais 13,14 ou matrizes, por exemplo, agarose 7,15, implementado em microscópios especiais de alto custo. Como uma alternativa aos sistemas de um dispositivo de iluminação para comparavelmente simples SPIM foi desenvolvido e adaptado para um microscópio invertido convencional 16 (ver Figura 1). É constituída por um feixe laser expandido até um diâmetro de 8 mm e focada por uma lente cilíndrica (distância focal: 50 mm, abertura numérica: 0,08) para uma folha de luz de espessura 6-10 uM sobre uma profundidade de campo de cerca de 100 pm . As amostras estão situadas num capilar rectangular de 600-900 um de diâmetro interno colocado em frente do len objectivo microscópios para a detecção de fluorescência. Estas características principais são actualmente preenchido e optimizado pelo uso de avançadas abordagens de micro-capilares para segurar e para fazer rodar as amostras, o ajustamento síncrono da folha de luz iluminante (na direcção axial) e a lente objectiva utilizados para a detecção de fluorescência (caminho óptico idêntico comprimentos de deslocamento exigem uma correcção do arrastamento mecânico), bem como a adaptação de um sistema de microfluídica para aplicação de corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou drogas, minimizando, assim, as quantidades e as despesas necessárias.
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Protocol
1. celular em crescimento esferóide e Incubação
- Experimento 1: celulares esferóides incubadas com um quimioterápico
- Prepare de agarose a 1,5% em meio de cultura pela adição de 0,45 g de agarose de 30 ml de meio de cultura (suficiente para 6 placas).
- Aquece-se a mistura a partir do passo 1.1.1 a, pelo menos, 80 ° C, com agitação de vez em quando.
- Encher 50 ul da mistura aquecida do passo 1.1.2 em cada poço de uma placa de 96 poços e deixar solidificar dentro de 1-2 horas. Armazene as placas fechado e coberto na geladeira a 5 ° C até o uso.
- Semente de cerca de 150 células MCF-7 de cancro da mama em cada poço do preparado placa de 96 poços em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com meio F-12 de cultura de Ham suplementado com 10% soro fetal de vitelo (FCS) e 1% de penicilina / estreptomicina .
- Grow esferóides de 5-7 dias até um diâmetro de cerca de 200-300 um numa incubadora a 5% de CO 2 e 3776; C.
- Incubar os esferóides de células com o antibiótico antraciclina doxorubicina cloridrato de 6 horas a uma concentração que varia entre 2 um e 8 uM (em meio de cultura) em uma incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C.
- Lavar os esferóides de células com meio de cultura ou solução salina equilibrada de Earle (EBSS) antes da microscopia.
- Experimento 2: processo de oxidação em esferóides expressando um sensor redox
- Semente de cerca de 400 células de glioblastoma U251-MG-L106 permanentemente transfectadas com a glutationa sensível do sensor redox fluorescente verde Grx1-roGFP2 em poços revestidos com gel de agarose (procedimento descrito nos passos itens 1.1.1-1.1.3) de uma placa de 96 poços em DMEM meio de cultura suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 ug / ml).
- Grow esferóides de 5-7 dias até um diâmetro de cerca de 200-300 um numa incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C.
- Adicionar 10 & #181; litros de uma solução de peróxido de hidrogénio (purum aa, ≥ 30%) a 990 ul de água bi-destilada para criar uma solução de estoque de 100 mM para ser usado no prazo de 12 horas.
- Dilui-se a solução-mãe a partir do passo 1.2.3 a 50 uM em EBSS direita antes da experiência.
- Incubar os esferóides de células através do sistema de microfluidos durante a medição de peróxido de hidrogénio com 50 ^ M em EBSS para a oxidação do sensor redox.
- Experimento 3: Iniciação e rotulagem de necrose celular dentro de esferóides
- Semente de cerca de 400 células (por exemplo, células de glioblastoma U251-MG-L106-Grx1-roGFP2) em poços revestidos com gel de agarose (procedimento descrito nos passos itens 1.1.1-1.1.3) de uma placa de 96 poços em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e higromicina B (150 mg / ml).
- Grow esferóides de 5-7 dias até um diâmetro de cerca de 200-300 um numa incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C.
- Incubar a célulaesferóides com o inibidor de transporte de electrões mitocondrial rotenona durante 3 horas a uma concentração de 1 uM em meio de cultura para induzir a necrose celular. Além disso, a co-incubação com um corante verde citotoxicidade durante 3 horas a uma concentração de 1 ml em 1 ml de meio de cultura de modo a marcar células necróticas.
- Lave os esferóides de células com meio de cultura ou EBSS antes de microscopia.
2 Ajuste folha de luz
NOTA: Para alcançar melhores resultados tem que ser assegurado que a cintura do feixe da folha de luz está no plano de foco da lente objetiva. A posição do feixe de cintura apenas podem ser alinhadas por meio da observação da folha de luz na posição vertical relativamente ao capilar (ver passos 2,5-2,8).
- Usar um microscópio invertido e montar o módulo de excitação SPIM, como descrito na referência. 16, para a placa de base da mesa de posicionamento (ver a Figura 1A).
- Equipar o microscópio com um 10X / 0,3 ou 20X / lente objectiva de microscópio de 0,5 e um filtro de passagem longa apropriado (por exemplo, λ ≥ 515 nm) no caminho de detecção do microscópio.
- Montar uma câmara integrando para o orifício de detecção do microscópio.
- Usar um feixe colimado paralelo de um laser ou de um díodo de laser com um comprimento de onda de excitação de 470 nm, preferencialmente, e aplicá-lo ao módulo SPIM.
- Gire a lente cilíndrica de 90 graus, o que transfere a folha de luz em uma posição vertical para um ajuste axial da cintura do feixe da folha de luz.
- Coloque um capilar contendo um líquido com um corante fluorescente no suporte da amostra.
- Montar o suporte da amostra, com o capilar para a mesa de posicionamento do microscópio e alinhar a posição do capilar de tal forma que ele é centrado e a cintura do feixe de luz da folha está em foco.
- Ajustar a cintura do feixe por variação da posição axial da própria lente cilíndrica. Volte a lente após anúncioajusta-.
Aplicação Esferóide 3. celular e sincronização de alimentação Microscópio
- Colocar os esferóides de células separadamente ou em grupos dentro de borosilicato rectangular capilares de vidro 16 com uma secção transversal interna de 600 um x 600 ^ m e uma espessura de parede de 120 um. Duas técnicas de aplicação de um esferóide das células provaram ser bem sucedidas.
- Leve o capilar vazio na posição vertical com o polegar eo dedo médio e selar a abertura superior com o dedo indicador. Traga a abertura inferior perto do esferóide de células em seu líquido circundante (EBSS ou meio de cultura). Solte o dedo indicador da abertura superior. Líquido com o esferóide de células em que vai ser embebido em imediatamente por forças capilares. Ajustar a posição do esferóide dentro do capilar cheio pela gravidade na respectiva posição vertical do capilar.
- Alternativamente, aplicam-se os esferóides de células para o capilar por meio de pipetagem. Tome cuidado that da abertura da ponta da pipeta é, por um lado, suficientemente grande para o tamanho do esferóide e, por outro lado, inferior ou igual em tamanho que o diâmetro interno do capilar.
- Colocar o tubo capilar com o esferóide nele num suporte de amostras para a microscopia especial.
- Montar o suporte da amostra, com o capilar para a mesa de posicionamento do microscópio e alinhar a posição do esferóide de células de tal modo que é centrada e focada.
- Definir a correspondência entre a folha de luz e o plano focal da lente objectiva de microscópio, no caminho de detecção através do ajuste da posição da reflexão de espelho e a lente cilíndrica (ver parafuso de ajuste na Figura 1B).
- Ajustar o parafuso micrométrico (ver Figura 1B) de acordo com os índices de refracção e a abertura numérica da lente objectiva para compensar o efeito de aquário.
NOTA: Diferentes índices de refração da amostra e os meios de comunicação ao redor tele chumbo lente objetiva para a diferença entre o deslocamento da lente objetiva ea mudança do plano focal. Uma vez que a folha de luz é movida pela torre objectivo, a incompatibilidade entre o deslocamento da folha de luz (que corresponde ao deslocamento da lente objectiva) e o deslocamento do plano focal é compensado por um braço de alavanca (ver Figura 1B). O parafuso micrométrico é usado para adaptar a distância entre a parte superior e inferior do pino para ajustar o deslocamento da folha de luz de acordo com a abertura numérica da lente objectiva e os índices de refracção.
A Figura 1 (A) Imagem do módulo de iluminação plano único montado na placa de base da mesa de posicionamento de um microscópio invertido, (B) a instalação da iluminação único planomódulo ea sincronização de alimentação microscópio para compensar a elevação-incompatibilidade (efeito aquário) entre o plano focal eo plano de iluminação. Δz o indica o deslocamento da lente objetiva e Δz f a mudança do plano focal ea folha de luz. A capa mostra seções transversais de esferóides contendo capilares. Esquerda: capilar rectangular com diâmetro interior de 600 um (parede 120 um). Direita: Setup utilizado para a rotação. Um capilar interna redonda (diâmetro interno 400 um, diâmetro externo de 550 mm) é rodado dentro do capilar rectangular exterior. O espaço entre os dois capilares é enchido com um fluido de imersão.
4. Medição em Dinâmica meio líquido
NOTA: O protocolo anterior é usado para incubação estática antes de uma medição onde o esferóide de células tenha sido previamente incubadas e mantido no lugar no capilar pela gravitação simples. Não há necessidade de mais FIXAÇÃOna. No entanto, para as medições em meios em que uma incubação dinâmico e, por conseguinte, um ambiente dinâmico é desejável medir a cinética da captação de fluxo, pode-se realizar este sub-protocolo. Passos 4,5-4,9 são fundamentais para evitar bolhas de ar que atingem a amostra.
- Encher o capilar com FCS durante 30 min para suportar a adesão celular, depois de um esferóide célula para a superfície de vidro interior.
- Deixe o revestimento FCS remanescente no capilar empobrecido secar durante pelo menos 12 horas.
- Introduzir o esferóide de células para o capilar revestido de FCS, tal como descrito na etapa 3.2.
- Deixar o capilar na incubadora a 5% de CO 2 e 37 ° C durante 2-4 horas adicionais para fazer com que a adesão celular do esferóide.
- Configure o afluxo parte do sistema de microfluídica (ver Figura 2). Usar uma bomba peristáltica para preencher o afluxo da tubagem (diâmetro interno: 0,89 mm) com meio de cultura contendo o corante fluorescente, fármaco ou agente.
- Connect o afluxo parte do sistema de microfluidos de uma armadilha de bolhas (ver Figura 2).
- Em primeiro lugar prender o capilar livre de bolhas para a tubagem de afluxo e, em seguida, apertar o outro lado do capilar para o tubo de drenagem.
- Ajustar a temperatura do líquido do banho de água para o valor desejado (por exemplo, 37 ° C).
- Ajustar a bomba peristáltica para a velocidade da bomba desejado (por exemplo, taxa de fluxo: 9 mL / min, velocidade de bomba no capilar: 25 mm / min).
- Recolha o líquido bombeado ou em uma (instalação de circuito aberto) destinatário, alimentá-lo de volta à sua fonte (instalação de circuito fechado) ou alimentá-lo diretamente para o tubo da bomba peristáltica (instalação de circuito fechado apertado).
Figura 2 configuração microfluídicos (open-loop e apertado em circuito fechado); inlay: Iluminação de um spheroid dentro de um micro-capilar usando microscopia de fluorescência de luz folha de base acoplado a um microscópio invertido.
5 Aquisição de Dados e Análise
- Defina a potência do laser e do tempo de integração para a aquisição de imagem.
- Ter cuidado para que os parâmetros definidos na etapa 5.1 não excedam os valores de dose de luz sobre 50-100 J / cm 2, para as células nativas ou 10-20 J / cm 2, para as células incubadas com um corante fluorescente ou transfectadas com um plasmídeo que codifica para a proteína fluorescente evitar fototoxicidade (ver detalhes Ref. 12).
- Definir o incremento para a z-pilha de Δz = 5-10 uM que é preferível para a análise de dados em 3 dimensões, como a espessura da folha de luz é de cerca de 10 um.
- Realizar medições de imagens individuais ou Z-stacks pela variação do plano focal dentro do esferóide celular.
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Representative Results
Experimento 1: celulares esferóides incubadas com um quimioterápico
Uma varredura z-pilha de uma previamente incubadas células MCF-7 de células esferóide (8 uM de doxorrubicina, 6 horas) está descrito na Figura 3. Ele fornece informações detalhadas sobre a absorção celular e a distribuição de 17 doxorrubicina e do seu produto de degradação 18,19. Dentro da camada celular externa da doxorrubicina fluorescente vermelho esferóide é principalmente localizadas no núcleo, enquanto que nas zonas interiores de esferóides fluorescência verde emitida por um produto de degradação torna-se dominante na membrana celular 19.
Figura 3. As imagens de fluorescência de diferentes camadas (Δz = 10 um) de uma MCF-7 de células de carcinoma mamário esferoid incubadas com doxorrubicina (8 uM, 6 h) registada por microscopia de iluminação único plano; Reconstrução em 3 dimensões usando z-projeção (excitação: λ = 470 nm; detecção de fluorescência: λ ≥ 515 nm; microscópio lente objetiva: 10x / 0,30 Plano Neofluar).
A absorção do fármaco quimioterapêutico doxorrubicina em células MCF-7 esferóides de células de cancro da mama humana nativa é apresentada na Figura 4, para uma camada única de células seleccionada pelo SPIM. Após a aplicação de 2 M em meio de cultura dentro do sistema de fluxo de fluorescência vermelha e verde da doxorrubicina e seu aumento produto de degradação contínua (imagens e espectro representado).
Figura 4 Tempo de curso de absorção celular de 2 uM doxorrubicinaem meio de cultura, através do sistema de microfluidos. As imagens de fluorescência de uma única camada de um mamário MCF-7 de células de carcinoma esferóide registada por microscopia de iluminação plano único, a uma distância de 80 um a partir da sua borda com o espectro de emissão de fluorescência adicionais (excitação: λ = 470 nm, detecção por fluorescência: λ ≥ 515 nm ; microscópio lente objetiva: 10x / 0,3 Plano Neofluar).
Experimento 2: processo de oxidação em esferóides expressando um sensor redox
Medições SPIM dos estados redox intracelulares pode dar algumas informações sobre espécies reativas de oxigênio, por exemplo, em tumores. Para este efeito, um esferóide das células de glioblastoma U251MG-L106 permanentemente transfectadas com a glutationa sensível do sensor redox fluorescente verde Grx1-roGFP2 foi usado. A oxidação da glutationa foi induzida por exposição a 50 uM de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) em sal solut ião (EBSS), através do sistema de microfluidos e ocorreram predominantemente nas camadas celulares exteriores do esferóide.
Como relatado anteriormente 20 da captação de H 2 O 2 resulta num decréscimo da intensidade de fluorescência a 470 nm animado, correspondendo à forma reduzida do sensor redox. No início da incubação de H 2 O 2 afecta fortemente as camadas celulares exteriores (espessura: 50 pm) do esferóide e em seguida penetra mais profundamente na área interior (diâmetro: 150 mm) de esferóide com o aumento do tempo de incubação, resultando numa degradação mais lenta de intensidade de fluorescência. O tempo de esta diminuição é mostrada na Figura 5, demonstrando a possibilidade de aplicação de drogas rápida combinada com a rápida detecção pelo sistema SPIM 20.
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Figura 5 Tempo de curso de redução da fluorescência a 50 ^ M de H 2 O 2 a incubação de um U251MG-L106 esferóide celular de glioblastoma permanentemente transfectadas com a glutationa sensível do sensor redox fluorescente verde Grx1-roGFP2. A cinética do estado redox intracelular para as camadas externas e a zona interior de um esferóide das células foi obtida por valores de intensidade média de fluorescência de imagens gravadas por microscopia de iluminação plano único (camada única do esferóide de células sob um fluxo).
Experimento 3: Iniciação e rotulagem de necrose celular dentro de esferóides
Para iniciar a necrose celular um esferóide celular de glioblastoma U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 foi incubada com 1 uM rotenona, durante 3 h. O agente neurotóxico rotenona é um inibidor da cadeia de transporte de electrões mitocondrial e leva a uma perda da integridade da membrana celular. Para vilize o efeito necrótico do esferóide foi co-incubado com o corante verde-de rotulagem fluorescente citotoxicidade (1 ml 1 ml em meio de cultura, 3 h), a qual penetra no interior da célula danificada e liga-se ao ADN no núcleo da célula (ver Figura 6A, C). Para referência, uma imagem de iluminação de campo brilhante de todo o esferóide é mostrado na Figura 6B.
Figura 6. (A) As imagens de fluorescência de diferentes camadas (Δz = 5 um) de uma U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 esferóide das células de glioblastoma co-incubadas com rotenona (1 uM, 3 h) e citotoxicidade corante verde (1 ul de meio de cultura de 1 ml, 3 horas) gravado por microscopia de iluminação plano único (barra de escala de 100 um), (B) fi brilhantecampo de iluminação de todo o esferóide, e (C) reconstruído imagem de fluorescência de 3-dimensional (excitação: λ = 470 nm, detecção por fluorescência: λ ≥ 515 nm; microscópio lente objectiva: 20X / 0.5 Plano Neofluar).
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Discussion
O presente manuscrito descreve uma folha de luz ou microscopia de iluminação plano único (SPIM) dispositivo que é otimizado para sistemas de células em 3 dimensões, por exemplo, tumores esferóides multicelulares (MCTS). Três aplicações exemplares incluem (1) absorção de uma droga citostática e sua conversão parcial para um produto de degradação (cuja contribuição para a eficácia quimioterapêutica ainda a ser avaliada), (2) as medições do estado redox de utilização de um sensor de glutationa geneticamente codificado mediante adição de um agente oxidante, e (3) a iniciação e rotulagem de necrose celular da inibição da cadeia respiratória mitocondrial.
As principais vantagens deste módulo SPIM em comparação com os sistemas existentes (por exemplo, os relatados em refs. 7, 8, 9, 14, 15) são de que ele pode ser facilmente adaptado a qualquer microscópio de campo amplo invertido, e que as amostras se encontram em pequenas câmaras de medição (micro-capilares), que precisam de apenas pequenas quantidades Sf corantes fluorescentes, agentes farmacêuticos ou drogas para ser aplicado para diferentes tipos de experiências, minimizando assim os custos, por exemplo, por ensaios farmacológicos. Isto é assim, se um sistema de micro-fluídica, conforme relatado neste manuscrito, é usado. No entanto, deve ser mencionado que, embora por uma malha aberta baixos caudais adicionais são vantajosas para o rastreio de drogas eficientes em termos de custo, as taxas de até 1440 mL / min (correspondendo a velocidades de até 4.000 mm / min) mostrou ser possível sob as presentes condições experimentais, sem descolamento dos esferóides do capilar. Para uma configuração de circuito fechado apertado é exigido um volume de líquido total mínimo de 200-300 mL, independentemente da velocidade da bomba.
Qualquer fonte de luz que pode ser focado para uma mancha de difracção limitada, por exemplo, um laser ou laser de diodo, podem ser utilizados para a iluminação. Aplicação das várias fontes de luz, no entanto, exige a correcção cromática, quer por teles adicionaislidar sistemas colocados na frente de cada fonte de luz 20 ou através da concepção de um sistema de iluminação achromatic. A mais resultados de problemas de dispersão para a frente pronunciada, que pode ser não homogênea sobre a amostra, fazendo com que artefatos como listras ou sombras. Variação do ângulo de iluminação em um modo de oscilação 21 ou específicos algoritmos de software 22, no entanto, pode reduzir esses artefatos.
O presente sistema de iluminação consiste em um feixe de expansão telecentric e focando por uma lente cilíndrica de 50 mm de distância focal e uma abertura numérica A N = 0,08. De acordo com a fórmula d = λ / D N de difracção de Fraunhofer, isso resulta numa espessura de cerca de 6 um de a folha de luz (dependendo do comprimento de onda de excitação λ), que corresponde, aproximadamente, à espessura de uma camada de células e parece ser ideal para a observação de camadas individuais. Se uma maior resolução axial ié desejado, a abertura numérica pode ser aumentada por inserção de uma lente objectiva de microscópio adicional de abertura numérica moderada ou elevada para o raio de iluminação com a folha de luz ser focado no seu plano de abertura. Isso resulta em uma outra folha de luz no plano da amostra, o que, no entanto, é rodado de 90 ° (a rotação da lente cilíndrica de 90 ° pode compensar esta rotação). Desde que as lentes do microscópio de longa distância têm aberturas numéricas superior a cerca de 0,60, a espessura da folha de luz pode ser reduzida a 1 m ou ainda menos, aproximando-se assim a resolução axial obtida em microscopia confocal de varrimento laser. Simultaneamente, a profundidade de campo, que é proporcional a uma N-2 é reduzida a partir de cerca de 100 um a menos do que 2 ^ m.
Uma correcção de deslocamento de foco é utilizada para compensar o chamado efeito de aquário, devido à diferença de índice de refracção. A mudança da objetiva do microscópio lens ao longo do eixo óptico difere do desvio de focagem no interior da amostra. Dependendo da razão entre os índices de refracção entre o ar e o meio que circunda a amostra a altura objecto aparece clinched por um factor de cerca de 1,35 e leva a uma incompatibilidade de elevação pelo mesmo factor de entre o plano focal e o plano de iluminação na SPIM para gravar z -stacks (para referência ver Figura 1B).
Esferóides multicelulares tumorais (TCM) são simétricas em vez de amostras, que pode ser iluminado a partir de qualquer direcção. No entanto, para as amostras de menos simétricas ou pequenos organismos iluminação a partir de várias partes pode ser desejável. Por isso, recentemente desenvolvida uma instalação 23, onde as amostras situam-se num micro-capilar de forma cilíndrica (diâmetro interno 400 um, diâmetro externo 550 um) que pode ser rodado no interior do capilar rectangular (diâmetro interno 600 um, a espessura da parede 120 im), tal como representado na the embutimento da Figura 1B. Devido ao acoplamento óptico quase perfeita da microscopia baseado dois capilares folha de luz pode ser combinado com a rotação da amostra sem qualquer limitação.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este projecto foi financiado pelo Land Baden-Württemberg, bem como pela União Europeia, Europäischer Fonds für die Entwicklung Regionale. Os autores agradecem Rainer Wittig (ILM Ulm) para fornecer a linha de células U251-MG-L106-Grx1-roGFP2 e Claudia Hintze para assistência técnica hábil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtiter plate | Orange Scientific | 4430100 | For cell spheroid growing |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 3810.1 | For cell spheroid growing |
| MCF-7 cell line | CLS Cell Lines Service GmbH | 300273 | Cell line |
| U251-MG-L106 cell line | Cell line | ||
| DMEM | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG0435 | Culture medium |
| DMEM/Ham's F-12 | Biochrom AG (Merck Millipore) | FG4815 | Culture medium |
| FCS | Biochrom AG (Merck Millipore) | S0615 | Cell culture supplement |
| Penicillin/streptomycin | Biochrom AG (Merck Millipore) | A 2213 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA Laboratories | P02-015 | Antibiotic |
| EBSS | Sigma-Aldrich Inc. | E3024 | Cell culture supplement |
| Doxorubicin | Sigma-Aldrich Inc. | D1515 | Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity) |
| Green cytotoxicity dye | Promega GmbH | G8742 | CellTox - fluorescent cytotoxicity dye |
| Rotenone | Sigma-Aldrich Inc. | R8875 | Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity) |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich Inc. | 95302 | Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity) |
| Capillary | VitroCom | 8260-050 | Sample preparation |
| Microscope | Carl Zeiss Jena | Axiovert 200M | |
| AxioCam MRc CCD-camera | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | 426508-9901-000 | CCD-camera |
| AxioVision data aquisition software | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 4.8.2. | |
| Laser diode | Pico Quant GmbH | LDH-P-C-470 | Used with driver PDL800-B |
| Peristaltic pump | Ismatec Labortechnik | MS-1 Reglo | Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10 |
| Silicone tubes | IDEX Health & Science GmbH | TYGON R3607 |
References
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