Artigo de método

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

DOI:

10.3791/51995

⸱

14 de setembro de 2014

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1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Compreender as conformações dos antígenos de superfície viral é necessário para avaliar a neutralização de anticorpos e orientar o projeto de imunógenos vacinais eficazes. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite o estudo do reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 expresso na superfície das células transfectadas por anticorpos anti-Env específicos.

Resumo

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as glicoproteínas do envelope do HIV-1 (Env) medeiam a entrada viral nas células-alvo e são essenciais para o ciclo infeccioso. Entender como essas glicoproteínas são capazes de alimentar o processo de fusão por meio de suas mudanças conformacionais pode levar ao design de imunógenos melhores e mais eficazes para estratégias de vacinas. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite estudar o reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 por anticorpos monoclonais. Após a expressão do HIV-1 trimeric Env na superfície das células transfectadas, os anticorpos anti-Env específicos da conformação são incubados com as células. Um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano e uma reação simples de quimioluminescência são então usados para detectar anticorpos ligados. Este sistema é altamente flexível e pode detectar alterações conformacionais de Env induzidas por CD4 solúvel ou proteínas celulares. Requer uma quantidade mínima de material e nenhum equipamento ou know-how altamente especializado. Assim, essa técnica pode ser estabelecida para triagem de antígenos e anticorpos de médio a alto rendimento, como anticorpos recém-isolados.

Introdução

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Humano do tipo 1 do vírus da imunodeficiência (HIV-1) de entrada, mediada pelas glicoproteínas do envelope viral triméricos (Env), é a primeira etapa do ciclo infeccioso. Sendo o único antigénio viral exposto apresentado na superfície de viriões, o trímero de Env elicia anticorpos neutralizantes e não neutralizantes. Como tal, ele representa um candidato interessante para o design imunogénio de vacina. No entanto, ensaios de vacinação com Env em formas solúveis ou recombinante induziu respostas com apenas uma eficácia mínima contra mais primário de HIV-1 isolados de 1-3. No entanto, a eficácia parcial observada no teste de vacina RV144 4 renovado interesse em HIV-1 Env como candidato imunógeno. Esse fato foi corroborado por um estudo recente descreve que os anticorpos anti-Env provocada por vacina foram suficientes para gerar um certo grau de proteção contra SIV e HIV desafia 5.

Depois de ser sintetizada no retículo endoplasmático, o glycoprote Envno precursor, a gp160, sofre várias modificações pós-traducionais que são críticos para a sua capacidade para alimentar o processo de fusão viral. O precursor Env deve dobrar corretamente e associado em trímeros antes de ser clivada em seus gp120 e gp41 transmembrana extra-citoplasmática subunidades 6-10, com interações não covalentes mantendo a ligação gp120-gp41. A maquinaria da célula infectada, também é fortemente responsável pela glicosilação de Env, compreendendo cerca de 50% da sua massa total de 11,12. A estrutura complexa resultante permite Env ser conformação flexível 13,14, enquanto fornece uma metaestabilidade que é pensado para permitir Env para se adaptar e se esconder certos epítopos altamente imunogênica que seriam expostos 15-19, destacando a importância de compreender melhor as diferentes conformações amostrados pelo trimer Env nativa.

Até à data, são conhecidos vários métodos têm sido desenvolvidos e utilizados com sucesso para estudar Env ch conformacionalanges. No entanto, eles variam em suas limitações, sendo, muitas vezes restrita a contextos específicos Env. Por exemplo, a ressonância de plasmon de superfície ou ensaios de imunoprecipitação, utilizando anticorpos monoclonais específicos de conformação (mAbs), dependem quer em moléculas solúveis ou solubilizadas monoméricos de Env que são conhecidos por serem imunogeneticamente diferente das suas formas triméricas 20,21. Estudos recentes também sugerem que a clivagem afecta as conformações de Env que resultam na exposição de epitopos reconhecidos, principalmente, pelos anticorpos não neutralizantes 14,22,23.

Aqui vamos descrever em detalhes um método que permite a determinação rápida e fácil de conformação de expressa-celularmente Env tr�eros 18,24-26. Após a transfecção transiente de Env numa linha celular humana aderente a ligação de anticorpos específicos de Env é detectado utilizando uma simples reacção de quimioluminescência. Esta técnica também pode ser usada para caracterizar a preferência conformacional de conformação-depenanticorpos Dent. Assim, este ensaio proporciona um método de detecção robusta e altamente flexível.

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Protocolo

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1 Dia 1 - Cultura de Células

  1. Placa de 2 x 10 4 osteossarcoma humano (HOS) células por poço de uma, placa de 96 poços de cultura de células opaco adequado para leitura de luminescência. Use de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina. Incubar até ao dia seguinte a 37 ° C, 5% de CO 2.

2 Dia 2 - polietilenimina (PEI) transfecção

  1. Preparar a mistura de transfecção de acordo com os passos subsequentes. Ajustar reagentes e quantidades de DNA de acordo com o número de poços a serem transfectadas com o mesmo Env.
  2. O tubo A: Adiciona-se 10 ng de plasmídeo que codifica Tat (tais como PTAT III-27) e 150 ng de plasmídeo que codifica Env-5 ul de DMEM suplementado com HEPES 25 mM.
  3. O plasmídeo Tat-codificação só é necessária quando se utiliza plasmídeos Tat-dependente ENV-codificam como pSVIII.
  4. Tubo B: Adicionar 450 ng PEI (a partir de um 1ug / solução ul) a 5 mL de DMEM.
  5. Adicionar o conteúdo do tubo B do tubo A. Misturar completamente em vortex durante 10 seg e incubar mistura de transfecção de 10 min à temperatura ambiente (22 ° C).
  6. Adicionar 10 ml da mistura de transfecção por poço da placa de 96 poços. Incubar durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.

3 Dia 4 - ELISA

  1. Realizar todos os experimentos à temperatura ambiente para minimizar possível endocitose de env / anticorpos complexos.
  2. Preparar 250 ml de tampão de lavagem por cada placa ser utilizados ao mesmo tempo. Tampão de Lavagem é solução salina 1x com Tris (TBS) pH 7.5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; NaCl 150 mM), suplementado com 1 mM de MgCl 2 e 1,8 mM de CaCl 2.
  3. Prepare 125 ml de tampão de bloqueio por placa, adicionando leite em pó desnatado 1% e 5 mM Tris pH 8,0 e tampão de lavagem.
  4. Remover o meio de cultura de células e mistura de transfecção (sobrenadante) a partir de placa de 96 poços.
  5. Adicionam-se 100 μ; L de tampão de bloqueio por po e incubar 20 min a RT.
  6. Remover o sobrenadante e adicionar 50 uL de anticorpo (ou soro) por poço, diluiu-se a concentração apropriada em tampão de bloqueio. Tipicamente, utilizar uma concentração de 1 ug / ml. Incubar 1 hora à temperatura ambiente.
  7. Lavar 3x com 100 ul tampão de bloqueio e repita 3x processo de lavagem com 100 mL tampão de lavagem.
  8. Remover o sobrenadante, adiciona-se 100 ul tampão de bloqueio, e incuba-se 5 minutos à TA.
  9. Remover o sobrenadante e adicionar 50 uL de anticorpo secundário, diluídos 1/3000 em tampão de bloqueio. Varie diluição do anticorpo ideal de acordo com as diferenças fabricante. Incubar 40 min a RT.
  10. Lavar 3x com 100 ul tampão de bloqueio e repita 3x processo de lavagem com 100 mL tampão de lavagem.

4 Aquisição de Dados

  1. Remover o sobrenadante a partir da placa e adicionar 30 ul de 1x quimioluminescência aumentada (ECL) de substrato por poço.
  2. Adquirir chemiluminescence sinal por 1 segundo / po num leitor de placas apropriado de acordo com as instruções do fabricante. O tempo de leitura pode variar de acordo com as diferenças de hardware.

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Resultados

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Utilizando o procedimento geral descrito acima, nós adaptamos o protocolo para ensaiar os efeitos de CD4 solúvel (sCD4) e CD4 celular co-expresso na exposição de epitopos de cada CD4i de tipo selvagem (wt) ou mutadas Env, como descrito anteriormente, 18,24, 25,28. Figura 1 representa esquematicamente o procedimento geral e a exposição de epítopos CD4i após o tratamento com sCD4 ou por co-expressão de CD4 celular 18. Na Figura 2, o sCD4 foi utilizado para induzir mu...

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Discussão

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Este ensaio foi optimizado para detectar a interacção de mAbs específicos com HIV-1 trimérico Env expressa na superfície da célula. Uma vez que o protocolo foi estabelecida, ela pode ser utilizada na forma de altas taxas de transferência, com baixos custos materiais globais e pequenas quantidades de anticorpos. Uma vez que este ensaio é à base de transfecção, que pode facilmente ser adaptada para a co-expressão de proteínas celulares, tais como CD4, a fim de estudar os seus efeitos na conformação Env.

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Dr. James Robinson, pelo seu dom generoso da A32, 17b, 48d, e C11 mAbs. PGT 121 foi obtido por meio do Programa de reagentes NIH AIDS, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343). Este trabalho foi financiado pela Fundação Canadense para a Inovação Líder de Programa # 29866, por uma operação CIHR # 257792, por um FRQS Estabelecimento de Jovem Cientista conceder # 24639 para AF e por um subsídio contínuo CRCHUM, bem como por um CIHR concessão catalisador # 126630 a AF e MR. AF é o destinatário de uma FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 comunhão # 24639. MV foi apoiado por um Prêmio de Pesquisa de Doutorado CIHR # 291485.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células HOSATCCCRL-1543
Placa de Cultura de Tecidos Opaca Branca, 96 poços, Fundo PlanoBD353296
Polietileminina, linear, 25.000 MWPolysciences23966Preparado em solução de 1 mg/ml
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Invitrogen11995
IgG anti-humano de cabra, peroxidase conjugadaPierce31413
Substrato de Quimioluminescência AprimoradaPerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941, Leitor de PlacasBerthold Technologies

Referências

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