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Summary

As reações alérgicas, caracterizada pela ativação de mastócitos e basófilos, são movidos pela ligação cruzada de IgE e liberação de mediadores pró-inflamatórios. A avaliação quantitativa da resposta alérgica pode ser conseguido através de corante azul de Evans para monitorar alterações na permeabilidade vascular após o desafio alérgeno.

Abstract

As reações alérgicas são o resultado da ativação de células e basófilos mastro, ea posterior liberação dos vasoativas e mediadores pró-inflamatórios. A exposição a um alergénio em um indivíduo sensibilizado pode resultar em sintomas clínicos que variam de menor eritema a vida em risco de anafilaxia. No laboratório, vários modelos animais têm sido desenvolvidos para compreender os mecanismos de condução respostas alérgicas. Aqui, nós descrevemos um método detalhado para medir alterações na permeabilidade vascular quantificar respostas alérgicas localizadas. O ensaio de anafilaxia local, foi relatada pela primeira vez em 1920, e foi adaptado a partir da técnica publicada pela Kojima et al. em 2007 ^1. Neste ensaio, os ratos sensibilizados a OVA são desafiados na orelha esquerda com o veículo e na orelha direita com OVA. Isto é seguido por uma injecção intravenosa de corante azul de Evans. Dez minutos depois da injecção de azul de Evans, o animal é sacrificado e o corante que extravasou empara os ouvidos é extraída durante a noite em formamida. A absorvância do corante extraído é então quantificada com um espectrofotómetro. Este método resulta de forma confiável em uma manifestação visual e quantificável de uma resposta alérgica local.

Introduction

Hipersensibilidade de tipo I é mediada pela induzida por antigénio a ligação cruzada de IgE na superfície dos mastócitos e basófilos. Isso resulta em degranulação celular ea liberação de mediadores vasoativos e pró-inflamatórios como a histamina, triptase e fator ativador de plaquetas ^2. Após a liberação de mediadores pré-formados durante a degranulação, mastócitos sintetizam e liberam prostaglandinas e leucotrienos, que aumentam ainda mais a permeabilidade vascular ^3. A resposta clínica inicial ocorre rapidamente e é referido como uma "reacção imediata". Na pele, uma resposta pápula-e-queima é facilmente visível a poucos minutos do desafio antigênico. Dependendo da dose do desafio, é possível observar uma "resposta de fase tardia" algumas horas mais tarde. Inchaço fase tardia é devido a edema localizado e o recrutamento de leucócitos para os tecidos ^2. A histamina, geralmente considerado como sendo o mediador principal participa nareações alérgicas imediatas, age em receptores de histamina 1 (HR1), expresso em vasos e receptor de histamina 2 (HR2) expressa no músculo liso. O efeito combinado aumenta o fluxo sanguíneo e da permeabilidade vascular no local da inflamação ^4.

Uma variedade de modelos animais de alergia têm sido desenvolvidas a fim de estudar os mecanismos envolvidos na inflamação alérgica, incluindo modelos de asma alérgica, anafilaxia sistémica e choque anafilático locais. A administração intravenosa do corante tem sido usado para medir as respostas alérgicas localizadas em modelos animais por quase um século, com publicações que descrevem esta técnica que remonta à década de 1920 ^5. Os coelhos e as cobaias foram os primeiros modelos animais utilizados para testar as reacções de hipersensibilidade imediata, e as respostas foram mais sensíveis geralmente encontrados no ouvido ^5,6. O ensaio foi posteriormente validado para uso em ratos e camundongos ^{7 8.}

Historicamente,uma variedade de métodos experimentais têm sido utilizados, incluindo a injecção de antigénio, antes da injecção do corante, a injecção de corante, antes da injecção de antigénio, e a injecção simultânea de corante e antigénio. Administração intravenosa de corante como um meio para medir as respostas alérgicas é um ensaio versátil, uma vez que pode ser utilizado para medir activa, passiva e inverter reacções passivas ^5,9. Numerosos corantes têm sido utilizados para avaliar as respostas alérgicas, incluindo Trypan Blue, pontamina Céu Azul, Azul de Evans, Geigy Azul 536, e Índia Ink ^5,6,9. Uma solução de 0,5% de azul de Evans é actualmente o corante padrão usado para medir as respostas alérgicas na pele.

A resposta anafilática ao desafio é transitório; intensidade máxima é atingida em 10-15 min de injeção de corante, e nenhuma reação é visível se corante é administrada mais de 30 min após o desafio, independentemente das espécies animais utilizados ^9. Quantificação de extravasamento de corante foi originally obtida pela medição do tamanho da pápula como indicado pelo corante azul ^7-9. Além disso, as contagens de mastócitos desgranulados pode ser quantificado através da excisão de tecido da pele a partir do local da reacção e coloração com azul de toluidina ^7. Desgranulação de mastócitos é muitas vezes usada como um marcador para cutânea, as respostas alérgicas mediadas por IgE, como mastócitos são a população principal de células que expressam o local de alta afinidade de IgE do receptor FceRI. Foram desenvolvidas técnicas de espectrofotometria para medir corante extravasamento para o tecido de anafilaxia cutânea passiva (PCA) no rato e rato ^{10 11} na década de 1990.

O seguinte protocolo de ensaio de anafilaxia local, foi adaptado a partir de Kojima et al. ^1, e utiliza ovalbumina de ovo de galinha (OVA) como antigénio para provocar respostas alérgicas. No entanto, com excepção de OVA antigénios podem ser utilizadas, se desejado. O ensaio, em seguida, utiliza corante azul de Evans para monitorar as mudanças em permeabilit vasculary que ocorrem devido a mastócitos IgE cross-linking e liberação de histamina.

Protocol

1. Sensibilizar Ratos

1. Prepara-se uma solução estoque de OVA por diluição OVA em 1x PBS para uma concentração final de 20 mg / ml. Congelar as alíquotas em criotubos e armazenar a -80 ° C para uso futuro.
2. Trazer uma ou mais alíquotas de 20 mg / ml de caldo de OVA à temperatura ambiente. Dilui-se com OVA em 1x PBS para uma concentração final de 1 mg / ml num tubo de 5 ml de fundo redondo de poliestireno com uma tampa. Vortex para misturar brevemente.
3. Enquanto mantém o tubo de poliestireno contendo a 1 mg / ml de OVA sobre um vórtice à velocidade média, adicionar um volume igual de completamente homogeneizada Imject Alum (40 mg / ml), gota a gota, enquanto continua a vortex do tubo para produzir uma proporção de 1: 1 de Alum de imunogénio.
4. Coloque a tampa no tubo e fita de tubo de vórtice. Vire vórtice em configuração mais baixa e permitir OVA de adsorção ao Alum por 30 min.
   1. Não permita que uma grande quantidade de tempo para passar entre a preparação OVA / Alum e sensibilizar camundongos. Se sensibilização não pode ser preenchido diretamente após OVA / Alum preparation, loja OVA / Alum à temperatura ambiente. Vortex por 1 min antes de usar.
5. Coloque um 1 ml seringa de insulina com a mistura de OVA / Alum. Tapar a seringa com agulha de calibre 27.
6. Injectar 100 uL de OVA / alum no peritoneu de ratinhos BALB / c por uma dose por ratinho de 50 ug de OVA e 2 mg de alúmen.
7. Para um controlo negativo, sensibilizar outro grupo de ratinhos a PBS. Prepara-se uma mistura 1: 1 de Alum e PBS no mesmo modo como listado acima, omitindo OVA.
8. Sensibilizar todos os ratos (controle OVA e PBS) uma vez por semana, durante três semanas para um total de 3 injeções. Após a injeção final, esperar pelo menos duas semanas antes da realização do ensaio anafilaxia local.

2. local Anafilaxia Assay

1. Levar a solução estoque de OVA à temperatura ambiente. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, diluir a 20 mg / ml de caldo de OVA a uma concentração final de 5 mg / ml com PBS (diluição 1: 4 de OVA em PBS 1X). Vortex para misturar brevemente.
2. Anestesiar ratos usando RC ^{2 <}/ Sup> Rodent Sistema de Anestesia (ou sistema de entrega vaporizado comparável). Encha o reservatório com isoflurano e ligue O ₂ fluxo de ar. Camundongos Coloque em câmara de indução e ajustar botão de controle de isoflurano a 5% para iniciar a anestesia. Uma vez que os ratos são totalmente anestesiado, indicado pela falta de mobilidade, ajustar botão de controle isoflurano a 3% para manter a anestesia profunda. A finalidade da anestesia neste procedimento é para imobilizar o animal. As injeções de orelha e cauda veia não causar-lhes dor ou sofrimento ao animal.
   NOTA: O isoflurano pode ter efeitos negativos sobre o sistema reprodutivo humano. Tenha certeza de usar em um quarto bem ventilado e coloque uma lata de eliminação para a câmara de indução para neutralizar gases residuais. Se você está grávida durante o uso de isoflurano, usar uma máscara de filtro de carbono para minimizar a exposição.
3. Carregar 10 ml de 5 mg / ml de OVA, para uma seringa de insulina 3/10 cc com uma agulha tampada 31 G. Coloque outro 3/10 cc seringa de insulina com 10 mLPBS 1x.
4. Usando um microscópio de dissecação, injectar 10 mL de OVA no ouvido direito de um rato anestesiado por uma dose de desafio de 50 ug de OVA. Outras doses, tais como 20 mg, também são aceitáveis.
   1. Para estabilizar o ouvido para injeção, enrole fita adesiva (sticky side up) em torno de um tubo de 15 ml. Fixar o lado dorsal da orelha direita para a fita. Inserir a agulha lado bisel para cima entre as duas folhas da orelha. Lentamente injetar OVA para o centro do tecido da orelha, tomando cuidado para não bater qualquer vasos sanguíneos.
5. Usando o mesmo método descrito acima, injectam 10 pi de PBS na orelha esquerda como controlo negativo.
6. Espere 3 min.
   1. Durante este tempo, coloque o mouse em um limitador e segure a cauda sob uma lâmpada de calor ou num banho de água quente para 1 min para dilatar os vasos sanguíneos.
7. Utilizando uma seringa de insulina de 1 ml tapado com uma agulha 27 G, lentamente injectar 200 ul de 0,5% de corante azul de Evans na cauda vein do mouse. A injecção rápida podem destruir a estrutura do vaso antes de a totalidade do 200 ul é administrado. Se isto ocorrer, a tentativa para injectar o volume restante de corante para dentro da veia no lado oposto da cauda.
8. Espere 10 min.
9. Eutanásia o mouse e remova ambas as orelhas, usando uma pinça e tesouras cirúrgicas.
   1. Agarrar as bordas da orelha com uma pinça, certificando-se de que qualquer pressão é aplicada no local da injecção no centro da orelha. Remover o máximo possível de tecido da orelha de corte perto, mas não através, ao cume de cartilagem presente na base da orelha. Pequenas quantidades de pele pode estar presente no ouvido excisado; isso não afetará o ensaio.
10. Alíquota de 700 mL de formamida em 1,5 ml microtubos. Prepare um tubo por orelha (dois tubos por mouse).
    NOTA: Formamide é teratogênico, mutagênico e irritante. Use luvas, proteção para os olhos, e proteção para o rosto. As mulheres grávidas devem ter cuidado ao manusear ums formamida pode ser fetotoxic.
11. Adicionar orelhas de formamida, a tampa dos tubos, e incubar durante a noite num banho de calor seco ajustada para 63 ° C. Orelhas ainda pode aparecer um pouco azul após a incubação; no entanto, a maioria do corante será extraído para a formamida.
12. Adicionar 300 ul de cada amostra, em duplicado, para uma placa de 96 poços. Evitar a transferência de pele, se estiver presente na amostra. Certifique-se de que não há bolhas presentes nos poços, como elas irão afetar a leitura da absorvância.
13. Adicionar 300 ul de formamida, em duplicado, à placa de 96 poços. Estes poços serão utilizados como brancos.
14. Utilizar um espectrofotómetro para medir a absorvância a 620 nm. Poços formamida subtrair de cada leitura da amostra.
    NOTA: Todos os experimentos foram realizados sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use a Universidade Militar.

Representative Results

Discussion

Inúmeros marcadores de doença alérgica são usados ​​para avaliar a força de respostas alérgicas seguintes desafio alérgeno, incluindo alterações nos níveis de histamina circulante, a produção de citocinas Th2, e recrutamento de células no líquido broncoalveolar no cenário de desafio das vias aéreas. Durante a monitorização de alterações nestes parâmetros é importante para o estudo de reações alérgicas, marcadores biológicos nem sempre têm relação com doença alérgica clínica. O ensaio de anafilaxia locais descritos neste protocolo prevê a reprodutibilidade da permeabilidade vascular localizada como correlato de doença alérgica localizada. Ao usar o corante azul de extravasamento, este protocolo permite tanto a visualização e quantificação relativa de uma reação alérgica localizada. Em contraste com os ensaios de alergia que dependem de pontuação clínica, o desfecho primário do ensaio (corante azul extravasamento como medida por absorvância espectrofotométrica) não está facilmente sujeito a preconceito do observador. Outra advantage é que os animais são sacrificados logo após o desafio, o que limita qualquer desconforto potencialmente causada pela provocação alergênica e administração corante. O uso alternativo de um espectrofotômetro manual descrito por Akiyama et al. ¹⁰ permite a medição contínua de alterações na permeabilidade vascular. No entanto, corante azul de Evans é tóxico, e injeção acabará por levar ao animal que precisam ser sacrificados.

Embora este ensaio tem uma série de vantagens, ele tem a limitação de ser um pouco difícil tecnicamente. Resultados confiáveis ​​dependem da orelha e cauda veia injeções consistentes e bem sucedidos. Se a totalidade da dose desafio não é administrado no ouvido, se os resultados de injecção na orelha punção óbvia de um vaso sanguíneo, ou se a injecção intravenosa de azul de Evans não está completa, o animal deve ser excluídos da análise. Em nosso laboratório, os investigadores tiveram de praticar as injeções intradérmicas de ouvido para several semanas antes de desenvolver proficiência. Além disso, é importante para executar os controlos adequados para o ensaio. Especificamente, injecção PBS deve ser rotineiramente utilizado como um controlo interno, tal como os animais parecem reagir de forma ligeiramente diferente para os danos causados ​​pela inserção da agulha. A leitura PBS dá uma medida da linha de base para as alterações da permeabilidade vascular induzido pela própria injecção. Em vez de utilizar injecções intradérmicas de orelha, o ensaio também pode ser aplicada à pele do dorso de ratinhos. Os investigadores podem encontrar essa rota a ser tecnicamente menos exigente, e, além disso, permite a análise de múltiplos antigénios simultaneamente.

O ensaio de anafilaxia local é extremamente versátil, como a dose de desafio pode ser manipulada de acordo com a experiência. Se é necessário olhar para alterações nas respostas alérgicas, pode ser vantajoso usar uma dose de desafio com OVA mais baixo, tal como 20 ug. Isto permite aumentar a sensibilidade a alterações na absorção de monitorização, conformeserá menos provável que o ponto de saturação para a ativação celular será alcançado.

Além disso, este ensaio pode ser usado para estudar anafilaxia cutânea passiva (PCA). Nesta configuração, a IgE especifica para o antigénio é injectado na orelha e um veículo para o outro. 24 horas mais tarde, o animal recebe um desafio por via intravenosa de antigénio e de corante azul de Evans. O modelo PCA pode reduzir o tempo que leva para completar a experiência, o número de animais utilizados, e permitir que os investigadores a olhar para os efeitos específicos de IgE cross-linking.

Apesar de ter mais tempo para realizar, existem algumas vantagens de se utilizar o modelo ativo anafilaxia cutânea (ACA) descrito neste artigo. Sensibilização através da exposição semanal ao antigénio imita o processo pelo qual os indivíduos a desenvolver doenças alérgicas, como a sensibilização é geralmente sistêmica e as pessoas geralmente têm tanto IgE alérgeno-específicos e IgG em circulação. Enquanto IgE cross-linking é o principal meio de mar degranulação, os mastócitos também respondem a IgG reticulação. Portanto, o modelo ACA permite a pesquisadores a investigar os mecanismos de reações alérgicas, além de doença só mediada por IgE. Em conclusão, enquanto que o método de sensibilização utilizado é à discrição do investigador, o ensaio de anafilaxia local é versátil e pode ser usado com uma variedade de metodologias de sensibilização.

Inchaço da orelha, um marcador vulgarmente utilizado para avaliar as respostas alérgicas, também pode ser medido após desafio com OVA. Verificou-se que as orelhas desafiados com OVA têm significativamente mais do que as orelhas inchaço provocados com PBS a 1 h após a injecção. Em contraste com o teste de azul de Evans, observou-se que a espessura da orelha medidas são menos sensíveis do que o extravasamento de corante e apresentam maior variabilidade entre os investigadores quanto a espessura da orelha pode ser alterada por compressão da orelha quando usando os dispositivos de medição.

Rato estirpes exceptoBALB / c podem ser utilizados para o ensaio de anafilaxia local; no entanto leituras de absorbância irá variar um pouco dependendo da tensão utilizada. Por causa de sua propensão a desenvolver respostas fortes Th2, os camundongos BALB / c geralmente produzem, leituras reprodutíveis de confiança com este ensaio.

Este ensaio permite a quantificação de respostas alérgicas localizadas em animais sensibilizados a uma variedade de antigénios. Selecção antigénio é flexível, tal como o ensaio foi realizado com sucesso com alergénios comuns, tais como o OVA e hemocianina de lapa (KLH). Além disso, em vez de sensibilização, uma reacção alérgica local pode ser induzida num animal ingénuo por injecção de anticorpos que os receptores de ligação cruzada de IgE ou IgE nos basófilos e células mastro, ou através da ligação de receptores de activação não-IgE nestas células, tais como ¹ CD200R3 .

Materials

BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC<sup>2</sup> Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform