Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Resumo

As reações alérgicas, caracterizada pela ativação de mastócitos e basófilos, são movidos pela ligação cruzada de IgE e liberação de mediadores pró-inflamatórios. A avaliação quantitativa da resposta alérgica pode ser conseguido através de corante azul de Evans para monitorar alterações na permeabilidade vascular após o desafio alérgeno.

Resumo

As reações alérgicas são o resultado da ativação de células e basófilos mastro, ea posterior liberação dos vasoativas e mediadores pró-inflamatórios. A exposição a um alergénio em um indivíduo sensibilizado pode resultar em sintomas clínicos que variam de menor eritema a vida em risco de anafilaxia. No laboratório, vários modelos animais têm sido desenvolvidos para compreender os mecanismos de condução respostas alérgicas. Aqui, nós descrevemos um método detalhado para medir alterações na permeabilidade vascular quantificar respostas alérgicas localizadas. O ensaio de anafilaxia local, foi relatada pela primeira vez em 1920, e foi adaptado a partir da técnica publicada pela Kojima et al. em 2007 ^1. Neste ensaio, os ratos sensibilizados a OVA são desafiados na orelha esquerda com o veículo e na orelha direita com OVA. Isto é seguido por uma injecção intravenosa de corante azul de Evans. Dez minutos depois da injecção de azul de Evans, o animal é sacrificado e o corante que extravasou empara os ouvidos é extraída durante a noite em formamida. A absorvância do corante extraído é então quantificada com um espectrofotómetro. Este método resulta de forma confiável em uma manifestação visual e quantificável de uma resposta alérgica local.

Introdução

Hipersensibilidade de tipo I é mediada pela induzida por antigénio a ligação cruzada de IgE na superfície dos mastócitos e basófilos. Isso resulta em degranulação celular ea liberação de mediadores vasoativos e pró-inflamatórios como a histamina, triptase e fator ativador de plaquetas ^2. Após a liberação de mediadores pré-formados durante a degranulação, mastócitos sintetizam e liberam prostaglandinas e leucotrienos, que aumentam ainda mais a permeabilidade vascular ^3. A resposta clínica inicial ocorre rapidamente e é referido como uma "reacção imediata". Na pele, uma resposta pápula-e-queima é facilmente visível a poucos minutos do desafio anti....

Protocolo

1. Sensibilizar Ratos

1. Prepara-se uma solução estoque de OVA por diluição OVA em 1x PBS para uma concentração final de 20 mg / ml. Congelar as alíquotas em criotubos e armazenar a -80 ° C para uso futuro.
2. Trazer uma ou mais alíquotas de 20 mg / ml de caldo de OVA à temperatura ambiente. Dilui-se com OVA em 1x PBS para uma concentração final de 1 mg / ml num tubo de 5 ml de fundo redondo de poliestireno com uma tampa. Vortex para misturar brevemente.
3. Enquanto mantém o tubo de poliestireno contendo a 1 mg / ml de OVA sobre um vórtice à velocidade média, adicionar um volume igual de completamente homogeneizada Imject Alum (40 mg / ml), gota....

Resultados

Os animais que tenham sido submetidos a ensaio com êxito terão os olhos ea pele que aparecem em azul. PBS animais sensibilizados não deve reagir a PBS ou desafio com OVA, portanto, ambos os ouvidos deverá permanecer branco (Figura 1A). Em animais sensibilizados com OVA, na orelha recebendo o desafio PBS (esquerda) deve ser completamente branca ou levemente azul de uma maneira localizada no local da injecção. A orelha recebendo o desafio com OVA (direita) deve tornar-se progressivamente mais escura azul .......

Discussão

Inúmeros marcadores de doença alérgica são usados ​​para avaliar a força de respostas alérgicas seguintes desafio alérgeno, incluindo alterações nos níveis de histamina circulante, a produção de citocinas Th2, e recrutamento de células no líquido broncoalveolar no cenário de desafio das vias aéreas. Durante a monitorização de alterações nestes parâmetros é importante para o estudo de reações alérgicas, marcadores biológicos nem sempre têm relação com doença alérgica clínica. O ensaio de anafilaxia locais descritos neste.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos BALB/c	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumina	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Misture bem antes de usar
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamida	Sigma	295876	99%+ Isoflurano de grau espectrofotométrico
, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Seringas de insulina	BD	329654
3/10 cc Seringa de insulina com agulha de 31 G	Terumo	NDC 100861
27 G Agulhas	BD	305109
Fórceps	FST	11000-12
Tesoura cirúrgica	F.S.T.14070-12
Tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml	BD Falcon	352058
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Medical	Supply Partners	15-1151
Tubos cônicos de 15 ml	BD Falcon	352097
Placa de fundo plano de 96 poços	Costar	3590
Fita
RC2 Sistema de Anestesia para Roedores	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Modelo G560 com plataforma de 3 polegadas