Medindo Anafilaxia locais em Ratos

O objetivo geral deste procedimento é medir as mudanças na permeabilidade vascular, para quantificar as respostas alérgicas localizadas. Isso é feito primeiro sensibilizando os animais a um alérgeno, como a albumina O. O segundo passo é desafiar os ouvidos com uma injeção intradérmica do alérgeno.

Em seguida, o corante azul de Evan é injetado na veia da cauda. A etapa final é extrair o corante das orelhas desafiadas, incubando-as durante a noite. Na forma, a amida, uma espectrofotometria, é usada para quantificar a quantidade de corante que entrou no ouvido.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é que o extravasamento do corante é medido por espectrometria. Isso significa que o ensaio não é facilmente submetido ao viés do observador. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque as injeções intradérmicas e nas veias da cauda são tecnicamente desafiadoras e exigem muita prática para alcançar a proficiência.

Comece trazendo uma alíquota da solução estoque de óvulos à temperatura ambiente para uso. Quando estiver à temperatura ambiente, diluir o estoque de óvulos até uma concentração de um miligrama por mililitro em um XPBS. Use um tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros.

Vortex o tubo em velocidade média e adicione cuidadosamente um volume igual de homogeneizado completo. Injete alúmen na solução de óvulos gota a gota. Paralelamente, preparar uma solução de controlo negativo de alúmen misturado em PBS na proporção de um para um, utilizando a mesma técnica.

Em seguida, tampe os tubos e prenda-os ao vórtice. Execute o vórtice na configuração mais baixa por meia hora com os tubos conectados. Quando as soluções estiverem prontas, prossiga imediatamente com a sensibilização dos camundongos BAB.

Coloque a mistura de óvulos de alúmen em uma seringa de um mililitro. Em seguida, com uma agulha de calibre 27, injete 100 microlitros no peritônio de cada camundongo. Repita isso para os camundongos de controle negativo usando a solução de alúmen sem óvulos nas próximas três semanas.

Repita este processo para um total de três injeções por camundongo após a última injeção, espere pelo menos duas semanas antes de realizar o ensaio de anafilaxia local a partir de óvulos congelados. Comece fazendo uma solução de trabalho de cinco miligramas por mililitro em PBS. Vortex brevemente, usando flúor 5% ISO.

Anestesiar um camundongo sensibilizado e, quando ele ficar imóvel, diminua o flúor iso para 3% Agora carregue uma seringa de insulina três 10 com 10 microlitros da preparação de óvulos e tampe com uma agulha de calibre 31 e carregue uma segunda seringa com 10 microlitros de um XPBS. Em seguida, enrole um tubo cônico de 15 mililitros com fita adesiva transparente com o lado adesivo para fora sob um microscópio de dissecação, prenda o lado dorsal da orelha esquerda de um camundongo anestesiado ao tubo. Insira a agulha da seringa PBS com o lado chanfrado para cima entre as duas folhas da orelha e injete lentamente os 10 microlitros completos.

Evite atingir os vasos sanguíneos. Uma injeção bem-sucedida resultará em um pontinho intradérmico óbvio. É fundamental injetar todo o volume no ouvido.

Se algum líquido vazar do local da injeção, o animal não pode ser usado na análise. Além disso, se a agulha passar completamente pela orelha ou arranhar a superfície da orelha, o ensaio é inválido porque esses traumas confundirão os resultados na orelha direita. Utilizar o mesmo método para injectar os óvulos durante o período de três minutos.

Transfira o mouse para uma contenção e coloque-o sob uma lâmpada de calor. Em seguida, injete lentamente 200 microlitros de corante azul de Evans 0,5% na veia da cauda. Usando uma agulha de calibre 27, a injeção rápida pode ser prejudicial se o vaso for destruído antes que todo o corante seja injetado.

Continue injetando no lado oposto da cauda. Agora espere 10 minutos e depois eutanasiar o camundongo com dióxido de carbono, seguido de luxação cervical. Uma vez que o animal tenha sido sacrificado, use uma pinça e uma tesoura para remover as orelhas.

Segure a borda da orelha com a pinça sem pressionar o local da injeção. Em seguida, corte perto, mas não através da crista da cartilagem na base das orelhas. Colete o máximo de tecido possível.

Agora, tomando as devidas precauções, alíquota de 700 microlitros de amida de forma para cada orelha em um tubo de microcentrífuga. Transfira uma orelha para cada tubo e incube-os durante a noite a 63 graus Celsius em um bloco de calor seco, no dia seguinte a maior parte do corante será extraída, mas as orelhas podem parecer ligeiramente azuis. Adicione 300 microlitros de cada amostra em duplicata a uma placa de 96 poços.

Evite transferir qualquer pele e não forme bolhas para espaços em branco. Carregue dois poços com 300 microlitros de amida forma. Em seguida, meça a absorbância em 620 nanômetros.

Subtraia os valores do plano de fundo e analise os resultados. Os animais sensibilizados com PBS não reagiram ao desafio com ovos ou ao desafio com PBS. Como esperado, ambas as orelhas permaneceram brancas.

O ano em que recebeu o desafio PBS em animais sensibilizados por OVAs foi completamente branco ou levemente azulado, localizado no local da injeção onde suas orelhas que receberam o desafio com ovos tornaram-se progressivamente mais escuras por 10 minutos após a administração do corante, o tecido auditivo tratado com IDE dos animais sensibilizados por PBS teve leituras de absorbância insignificantes após o desafio PBS e OVA. Já para animais sensibilizados a ovos, a injeção de PBS geralmente resultou em uma leitura média de absorbância de 0,13. Por outro lado, um desafio de ovos de 50 microgramas resultou em uma leitura média de absorbância de 0,58.

A quantidade de óvulos usados para o desafio pode ser ajustada dentro de limites. Por exemplo, um desafio de 20 microgramas resultou em uma absorbância média de 0,30. No entanto, um desafio de menos de 20 microgramas não deu resultados confiáveis.

Embora seja desafiador quando uma pessoa é proficiente nas injeções intradérmicas e intravenosas, essa técnica pode ser realizada em um animal em cerca de 15 minutos Com duas pessoas trabalhando juntas, uma realizando as injeções no ouvido e a outra realizando as injeções na veia da cauda. O procedimento pode ser realizado em 10 animais em aproximadamente uma hora. Este ensaio é altamente versátil, pois pode ser usado para anafilaxia cutânea ativa e passiva.

Também pode ser usado para uma ampla variedade de alérgenos. Não se esqueça que o flúor pode ter efeitos negativos no sistema reprodutor humano. Use-o apenas em uma sala bem ventilada e tenha um recipiente de limpeza conectado à câmara de indução para neutralizar os gases residuais se estiver grávida.

Ao usar flúor, use uma máscara de filtro de carbono para minimizar a exposição.