Artigo de método

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/52011

⸱

13 de dezembro de 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2Department of Biology, York College/CUNY, 3Department of Biology, Western Ontario University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a evitação de indivíduos estressados. Este paradigma é poderoso, mas fácil de usar, e pode ser usado para avaliar a influência de genes e ambiente em um tipo de interação social em Drosophila melanogaster.

Resumo

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Drosophila melanogaster é um modelo emergente para estudar diferentes aspectos das interações sociais. Por exemplo, as moscas evitam áreas anteriormente ocupadas por coespecíficos estressados devido a um odorante liberado durante o estresse conhecido como odorante de estresse Drosophila (dSO). Através do uso do aparelho T-maze, pode-se quantificar a evitação do dSO por moscas respondedoras em um ensaio muito acessível e robusto. As condições necessárias para obter um desempenho forte são apresentadas aqui. Uma experiência estressante é necessária para que as moscas emitam dSO, bem como moscas emissoras suficientes para causar uma resposta robusta de evitação à presença de dSO. O histórico genético, mas não o tamanho do grupo, alterou fortemente a evitação do dSO pelas moscas respondedoras. Canton-S e Elwood apresentam um desempenho mais alto em evitar o dSO do que as cepas de Oregon e Samarcanda. Este ensaio comportamental permitirá a identificação dos mecanismos subjacentes a esse comportamento social e a avaliação da influência de genes e condições ambientais na emissão e evitação do dSO. Tal ensaio pode ser incluído em baterias de testes diagnósticos simples usados para identificar deficiências sociais de mutantes ou condições ambientais de interesse.

Introdução

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O objetivo deste método é quantificar facilmente um novo aspecto do comportamento social simples em Drosophila melanogaster, independente do namoro e agressão.

As interações sociais são cruciais para o bom desenvolvimento e saúde dos indivíduos dentro de uma sociedade, bem como a funcionalidade de um grupo social como um todo. A elevada complexidade destas interacções exige grandes tamanhos de amostra e um sistema que permite a simplificação do comportamento como as bases genéticas e neurais do comportamento social são ainda pouco compreendidos. Drosophila melanogaster é um poderoso modelo genético que pode ser usada para identificar os factores genéticos e bases neurais de interações sociais. Com efeito, D. melanogaster tem um repertório de comportamentos sociais complexos e algumas medições diretas de socialização já foram feitas 1-7. No entanto, a maioria desses esforços têm sido focados em comportamentos sociais relativamente complexas, como aggresinterações sive 3,6, vários aspectos do namoro 3,8-12, e como experiência social afeta outros comportamentos como a aprendizagem, ou ritmo circadiano 13-17. Além disso, muitos desses ensaios dependem de analisar os padrões de interacção complexas de grupos de moscas, usando o acompanhamento de vídeo e software de computador para analisar a abundância resultante de dados. Essas análises são de valor inestimável, e levar a novos conhecimentos importantes, como a dinâmica das interações fly-fly em grupos de sete. Uma limitação, no entanto, é a inacessibilidade destes ensaios para a comunidade em geral, e o limitado conhecimento dos mecanismos subjacentes reconhecimento dos outros. Em outras palavras, com base na emissão de um sinal por um indivíduo e o seu reconhecimento por outro ainda está mal compreendida 18.

Em contraste, as moscas também exibem um comportamento simples, evitação social, onde os indivíduos se afastar de um sinal emitido por moscas estressados: o D. Melanogaster Estresse Odorant ou DSO 19. Em um ensaio de elevado débito, este comportamento pode ser quantificada como a prevenção de um sinal de tensão emitida por outros, moscas ou evitação social 19. As moscas são colocadas num aparelho de labirinto em T e dada a opção de evitar um frasco contendo DSO. Utilizando este ensaio, CO 2 mostrou ser um componente do DSO, e parte do circuito neural necessário para responder ao CO 2 foi dissecada 19.

O ensaio de evitação social aqui apresentada é semelhante conceitualmente para os ensaios comportamentais simples desenvolvido no laboratório de Seymour Benzer que permitiram gerações de pesquisadores para dissecar comportamentos complexos 20. Análise de evitação social pode ser levada a cabo de forma eficaz em termos de custos, utilizando o ensaio de labirinto em T, para permitir um estudo mais generalizada do comportamento social. Por exemplo, com este ensaio que recentemente demonstrou que diferentes riscos genéticos para autismo têm efeitos contrastantes em b sociaisensaios ehavior. Mutantes para um gene candidato para o autismo - neurobeachin 21,22 - deficiências presentes tanto no espaço social (descritos em outros 23) e evitação social 24. Sinalização dopaminérgica anormal também é proposto para desempenhar um papel na etiologia de autismo em humanos 25,26. Em contraste com os resultados obtidos com neurobeachin, descobrimos que o desempenho evitação social não foi afectada por um aumento ou diminuição dos níveis de Drosophila vesicular da monoamina transportador (VMAT) em células dopaminérgicas, embora espaço social foi directamente correlacionada com estes níveis de VMAT 27. Os resultados contrastantes obtidos com neurobeachin e VMAT ressaltam a possibilidade de identificar várias formas de comportamento anti-social e, assim, os diferentes circuitos neurais subjacentes modulando a resposta para os outros.

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Protocolo

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1. equipamentos e reagentes criados em casa (Veja a lista de material para os outros)

  1. Prepare um aparelho de anestesia Drosophila frio para realizar o trabalho real.
    1. Cortar uma folha de polietileno poroso para cobrir uma pequena caixa de plástico (12.7 cm de comprimento, 10,2 cm de largura), normalmente a tampa superior de uma caixa de pontas de pipeta (12.7 cm de comprimento, 10,2 cm de largura, 3,8 cm de profundidade).
    2. Preencha a caixa com gelo picado, cubra com a folha de polietileno poroso.
  2. Prepare um aparelho T-maze; adaptar o aparelho anteriormente descrito em detalhes 28-31.
  3. Preparar um aspirador de mosca como descrito 32.
  4. Prepare um aparelho de resposta phototaxis para deslocar moscas dentro e fora de frascos de teste sem estresse:
    1. Usar um aparelho em contracorrente, tal como descrito por 29,33.

NOTA: O labirinto em T pode também ser utilizado para outros fins, como descrito por 28.

  1. Certifique-homcondições de iluminação ogeneous: realizar o experimento em um banco coberto com uma capa de banco branco, e na frente de um quadro branco.
    NOTA: Para estas experiências, as linhagens de moscas utilizados foram Drosophila melanogaster tipos selvagens: Canton-S, Oregon e Samarkand voa de nossos estoques de laboratório 34; Elwood moscas foram coletadas no outono de 2011 no bairro de Elwood de Huntington, em Long Island, Nova York, EUA.

2. Preparar as moscas antes do experimento

1-2 dias antes de realizar o experimento:

  1. Manter moscas em meio padrão fubá-agar-melaço de levedura a 25 ° C em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz.
  2. Recolher as moscas que respondem sob anestesia frio 1-2 dias antes de se efectuar a experiência
    1. Transferem-se as moscas das garrafas no qual foram colocadas em tubos Falcon de 50 ml, utilizando um funil.
    2. Coloque o tubo de falcão com as moscas sob nível de gelo, em umbalde de gelo isolado.
    3. Coloque o aparelho de anestesia fria com gelo picado a -4 ° C para relaxar.
    4. Espere 5 minutos para as moscas para entrar em um coma frio.
    5. Transferem-se as moscas para a folha de polietileno poroso do aparelho de anestesia frio.
    6. Colete as moscas de resposta sobre o aparelho de anestesia frio. No RT, sob microscópio estereoscópico, separe masculina 3-7 dias de idade de moscas fêmeas e manter essas moscas em grupos de 40.
  3. Recolher as moscas emissor 1-2 dias antes de realizar a experiência.
    1. Gentilmente recolher Canton-S mixed-sexo voa de suas garrafas, usando um aspirador de boca, controlando o seu número.
    2. Manter essas moscas no grupo de 60-100, pois eles serão os emissores.
    3. Preparar todas as amostras de emissores como pontos de dados necessários.
  4. Permitir que pelo menos uma noite de recuperação após a coleta dos respondentes e emissores, para minimizar qualquer efeito de confusão da anestesia frioe coleta de boca aspirador no comportamento.
  5. Abrir o saco de frascos de teste, para permitir que o ar com cheiro plástico obsoleto em que o saco seja substituído por ar fresco, pelo menos 1 dia antes da experiência.

2 horas antes da realização do ensaio:

  1. Certifique-se de que a temperatura na sala em que a experiência é realizada é de cerca de 23-25 ​​° C, com luz uniforme, e humidade superior a 30%.
  2. Transfira os respondedores e moscas emissores de frutas em frascos de alimentos frescos para garantir que estas moscas não estão morrendo de fome.
  3. Deixe que as moscas de fruta ajustar ao ambiente, durante 2 horas, no banco em que o experimento será realizado.

3. a realização do experimento evitação social

  1. Executar cada experiência à mesma hora do dia, num intervalo de 3-4 horas, à tarde entre o tempo Zeitgeber ZT5 e ZT9.
  2. Coloque o T-maze no teclado batendo, e aperte o parafuso de modo clipe tele é estável elevador.
  3. Transfira as moscas de resposta em um tubo de ensaio fresco. Encaixe este frasco contendo as moscas de resposta sobre a parte superior do labirinto-T.
  4. Inclinar o aparelho T-maze e coloque-a sobre o tapete batendo tão moscas da fruta cair no elevador.
  5. Mover a parte superior do elevador para baixo para que as moscas são entre a secção superior e inferior do labirinto em T, mas prestar atenção para manter o elevador acima do ponto de escolha - para impedir que as moscas de escapar.
  6. Obter frascos com DSO (ver seção 5 para gerar DSO-free frascos que foram anteriormente ocupadas por moscas).
    1. Enquanto as moscas de resposta estão se ajustando a esse novo ambiente, coloque as moscas de emissor em um tubo de ensaio.
    2. Coloque um pedaço de algodão para fechar o frasco de modo que as moscas de fruta não escapam.
    3. Mecanicamente isto agitar o frasco numa mini-vórtice do seguinte modo: em vórtice durante 15 seg, remover o frasco de vórtice durante 5 segundos. Repita 3 vezes para um total de 55 seg.
    4. Remove as moscas emissor para fora do frasco fresco - por transferência num frasco de alimentos - e rapidamente colocar esse frasco cheio DSO em um dos dois lados do aparelho de labirinto-T.
    5. Alterne o lado de colocação para o frasco DSO preenchidos em cada nova execução.
  7. Coloque um tubo de ensaio fresco no outro lado do labirinto-T.
  8. Traga o elevador completamente para baixo, de modo que as moscas de fruta pode escolher entre o tubo de ensaio fresco eo tubo de ensaio com DSO, e iniciar o timer.
  9. Deixe as moscas escolher entre o frasco fresco e o frasco DSO, por 1 min, salvo indicação em contrário.
  10. Após 1 min, mover o elevador para cima para separar as moscas no frasco fresco, DSO frasco, e os que estão presos no elevador.
  11. Contar o número de moscas em cada frasco, e no elevador.
  12. Repita esse procedimento para cada genótipo / condição.

4. Analisando os dados evitação social

  1. Contar o número de moscas da fruta em cada frasco para cada Genotipo, e transferir os dados para uma planilha.
  2. Usando um programa de planilha, calcular o Índice de Desempenho (PI) para cada genótipo, subtraindo o número de moscas no frasco DSO do número de moscas no frasco DSO-livre, e dividindo pelo número total de moscas.
  3. Compare dos IPs que consiste em utilizar o software de análise estatística para análise dos resultados.
    1. Idealmente, preparar 2-3 repetições internas de cada experiência, e três repetições independentes, realizadas em dias diferentes, com diferentes garrafas ou 30 atravessa.
    2. Use testes estatísticos de distribuição de Gauss, como os dados seguem uma distribuição normal.
    3. Ao testar um efeito (isto é, densidade - Figura 2), utilizar um ANOVA de uma via, com o pós-teste de comparação múltipla (coluna por coluna), ou um t-teste simples para comparar cada resultado de um controlo.
    4. Quando experimentos do grupo são realizadas, testar ambas as condições e sexos (frascos vazios, destacou umd moscas un-esforçado; e efeito de gênero - Figura 1), usando uma ANOVA de duas vias.

5. Gerar frascos anteriormente ocupado por Flies átonas - Realizar Em vez de 3,5-3,6

  1. Use fototaxia para preparar frascos ocupados por moscas que não têm sido destacadas, como um controlo.
  2. Transfira as moscas em um tubo de ensaio, e encaixe-o aparelho em contracorrente, com frescos frascos vazios no local oposto.
  3. Coloque o aparelho na horizontal, com o frasco distal diretamente em frente a 15 W fluorescente luz cool-branco, e cubra com um pano preto.
  4. Deixe as moscas mover suavemente no frasco fresco. Isso pode levar vários minutos. Uma vez que a maioria das moscas estão caminhando em direção à luz no frasco distal, iniciar o temporizador para 1 min.
  5. Remova cuidadosamente o pano preto, mudar a localização da luz, recuperar com o pano preto, e permitir que as moscas de deixar o tubo de ensaio.
  6. Naquela época, eunitiate o experimento escolha como em 3.2 a 3.5. Ir 3.6 e 3.7.
  7. Mover o cursor do aparelho, para separar as moscas que desocupado o tubo de ensaio a partir do outro lado.
  8. Use o frasco teste desocupado na T-labirinto de imediato para o experimento escolha, como em 3.7.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ensaio de evitação social é um ensaio robusto quantificar a capacidade de Drosophila melanogaster para reconhecer um sinal de tensão (DSO) emitidos por outras moscas, e avaliando assim um aspecto de interacções sociais. O ensaio é realizado utilizando um aparelho comumente usado em vários ensaios de comportamento conhecido como T-labirinto, que apresentam as moscas com uma escolha entre duas opções diferentes - a esquerda ou direita 19,28-31. Neste caso, a eficiência com que as moscas evitar o DSO ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para o ensaio de evitação social. Canton-S só vai evitar um frasco em que voa tenham sido previamente stress mecânico, e que o sexo e número de respondentes que não afeta o desempenho evitação social. No entanto, a base genética dos respondentes tem uma grande influência.

Seguem-se vários passos críticos para a realização deste experimento com sucesso: 1) sempre transferir as moscas 2 horas antes do experimento e certifique-se de não perturba...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Agradecemos a Rachelle Kanippayoor por sua ajuda na identificação da nova cepa de tipo selvagem como sendo da espécie melanogaster. R.W.F., O.F. e A.F.S foram responsáveis pelo desenho da pesquisa; R.W.F, M.N. e O.F. realizaram os experimentos. R.W.F, M.N., O.F. e A.F.S. analisaram os dados; R.W.F., I.S.M. e A.F.S. escreveram o manuscrito.

Este trabalho foi apoiado por prêmios de pesquisa PSC-CUNY, financiados conjuntamente pelo The Professional Staff Congress e pela City University of New York para a AFS; por financiamento interno da Western University para AFS e ISM; por um apoio de treinamento da National Alliance for Hispanic Health's Alliance / Merck Ciencia (Science) Hispanic Scholars Program e uma bolsa universitária da Yale Graduate School of Arts and Sciences para a RWF.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio Zoom Estéreo Nikon   SMZ-645Qualquer outro escopo padrão para manuseio de moscas funcionaria
Pincéis pequenos para empurrar moscas
Polietileno Poroso, 12" x 12" FolhaFlystuff - Genesee46-100http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100
Folha de plástico poroso para a caixa de anestesia fria
Mini-Alarme Temporizador/Cronômetro
Canetas
Fita Adesiva
Mini vórticeFisher14-955-151 http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail
Para agitação mecânica das moscas - qualquer vórtice funcionaria.
Corning Life Sciences DL No.:352017, Tubo de ensaio Falcon; fundo redondo; descartável; sem fechamento, 14 ml; 17 x 100 mmFisher14-959-8    http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0
Eles se encaixam no labirinto em T feito internamente e no aparelho de contracorrente (ver texto)
bolaspara fechar os frascos após o experimento.
Tábua com três dobras e coberturapara fornecer um fundo branco e uma luz homogênea.
Capa
Almofada de BatidaQualquer mouse pad funciona.
grande panopara cobrir o aparelho de contracorrente na resposta da fototaxia.
luz branca fria A Home Depot1000516563http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423
qualquer luz linear semelhante com lâmpada fluorescente branca fria a 13-15 W funcionaria
Sharpie de algodão de banco branca de Banco Branca preto

Referências

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