DNA e as proteínas são seqüência especificamente marcado com afinidade ou grupos repórter fluorescentes de DNA ou proteína methyltransferases e análogos sintéticos cofactor. Dependendo da especificidade do cofactor de enzimas, aziridina ou duplas análogos de cofactores activados são empregues para marcação de uma ou duas etapas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
-Adenosyl S-L-metionina (AdoMet ou SAM) metiltransferases dependentes de (MTAse) catalisam a transferência do grupo metilo de AdoMet activado a posições específicas no ADN, ARN, proteínas e pequenas biomoléculas. Esta reacção de metilação pode ser natural, expandida para uma grande variedade de reacções de alquilação usando análogos sintéticos de cofactor. A substituição do centro reactivo da AdoMet sulfónio com um anel aziridina leva à co-factores que podem ser acoplados com ADN por vários MTases ADN. Estes cofactores de aziridina pode ser equipado com grupos repórter em diferentes posições a porção de adenina e usado para S-specific equence M ethyltransferase- I nduced ing L abel de DNA (DNA de sorriso). Como um exemplo típico, damos um protocolo para a biotinilação de DNA de plasmídeo pBR322 na sequência 5'-ATCG A T-3 'com o ADN MTase M.BseCI e o cofactor aziridina em 6BAzum passo. Extensão do grupo metil ativado com insaturados grupos alquilo resulta em uma outra classe de análogos AdoMet que são utilizados para dirigida por ethyltransferase m T ransferência de A ctivated rupos G (mTAG). Uma vez que as cadeias laterais estendidas são activados pelo centro de sulfónio e a ligação insaturada, estes cofactores são chamados análogos AdoMet dupla activada. Estes análogos não só funcionam como co-factores para MTases ADN, como os cofactores de aziridina, mas também para ARN, proteínas e pequenas MTases molécula. Eles são tipicamente usados para a modificação enzimática da MTAse substratos com grupos funcionais únicos que são marcados com grupos repórter num segundo passo químico. Isso é exemplificado em um protocolo para a rotulagem de fluorescência da proteína histona H3. Um pequeno grupo propargilo é transferido do SeAdoYn cofactor análogo à proteína pela lisina histona H3 4 (H3K4) MTase SET7 / 9 seguido por clique rotulagem dohistona H3 alkynylated com TAMRA azida. Rotulagem MTase mediada com análogos cofactor é uma tecnologia capacitadora para muitas aplicações interessantes, incluindo a identificação e estudo funcional de substratos MTase bem como genotipagem de DNA e detecção de metilação.
Introdução
Rotulagem específica de ácidos nucléicos e proteínas 1,2 3,4 é de grande interesse para caracterizações funcionais, diagnóstico médico e (nano) biotecnologia. Aqui apresentamos um método de marcação enzimática para esses biopolímeros que é baseada no S -adenosyl-l-metionina (AdoMet ou SAM) methyltransferases -dependentes (MTases). Esta classe de enzimas (EC 2.1.1.) Tem como alvo as posições individuais nucleofílicos (azoto, oxigénio, enxofre e átomos de carbono) no interior resíduos específicos de ácidos nucleicos e proteínas e naturalmente transfere o grupo metilo activado da AdoMet cofactor (Figura 1A) 5. Além disso, ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Instruções Gerais
- Aziridina loja cofactor 6BAz (em DMSO) e proteína MTase SET7 / 9 a -80 ° C e todos os outros reagentes, incluindo co-factor activado SeAdoYn dupla e ADN MTase M.BseCI (em glicerol a 50%) à temperatura de -20 ° C.
- Determinar a concentração de 6BAz e SeAdoYn via UV / Vis utilizando os coeficientes de extinção ε 269nm (6BAz) = 16,000 centímetros -1 M-1 e ε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 centímetros -1 M-1 em água deionizada. Determinar a concentração de MTases pelo ensaio de Bradford ou, se o coeficiente de extinção está disponível, por meio de absorção directa a 280 nm.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Um passo-a Rotulagem de DNA via Aziridine Cofactores
Esta reacção é levada a cabo exemplo com o ADN MTase M.BseCI, que modifica o resíduo de adenina segunda dentro do 5'-ATCG A T-3 'sequência de cadeia dupla e tem um local de reconhecimento no plasmídeo pBR322 (Figura 4A). Para testar rotulagem plasmídeo, pBR322 é desafiado com a endonuclease de restrição (Rease) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI tem sete sites na pBR322, um dos quais está incluído no si.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Rotulagem de uma etapa de DNA com MTases DNA e cofatores aziridina (DNA sorrindo) é um método robusto, mas alguns aspectos devem ser considerados quando se planeja o experimento.
Cofactor aziridina: A concentração 6BAz para marcação de ADN com M.BseCI foi de 60 uM. Ao usar outros MTases DNA a concentração cofator deve ser otimizada, por exemplo, concentrações tão baixas como 20? M têm sido empregadas com o DNA MTase M.TaqI 19. Baixas concentrações 6BAz tem a vant.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores divulgam o seguinte interesse financeiro concorrente: E.W. é inventor de patentes relacionadas.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Kerstin Glensk por preparar os MTases M.BseCI e Set7/9 e agradecem o financiamento da Iniciativa de Excelência dos Governos Federal e Estadual Alemão e da Universidade RWTH Aachen. Os autores têm o prazer de fornecer 6BAz e SeAdoYn ou outros análogos de cofator para pesquisa colaborativa.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 6BAz | Sintetizado de acordo com Weinhold et al., Patente número US 8.129.106, publicada em 6 de março de 2012. | ||
| β-Mercaptoetanol | Serva | 28625 | |
| Ácido acético | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrilamida/Bis, 37,5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Persulfato de amônio (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Ácido bórico | Gerbu | 1115 | |
| Azul de bromofenol Na sal | Serva | 15375 | |
| Sulfato de cobre (II) | Aldrich | C1297 | |
| Clorofórmio | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA sal dissódico | Gerbu | 1034 | |
| Etanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10.000x em água) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Plasmídeo de expressão obtido do Dr. Philipp Voigt e do Prof. Danny Reinberg; expressão e isolamento de acordo com T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Plasmídeo de expressão obtido do Dr. Michael Kokkinidis; expressão e isolamento de acordo com Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Metanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Cloreto de Magnésio hexahidratado | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Cloreto de sódio | Gerbu | 1112 | |
| tira de pH (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µ l) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Sintetizado de acordo com Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Plasmídeo de expressão obtido do Prof. Danny Reinberg, expressão e isolamento de acordo com D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Estreptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-L-ascorbato de sódio | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| hidrogenofosfato dissódico | Merck | 106.586 | |
| TAMRA azida | Sintetizado de acordo com a referência 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Tampão TaqI (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N, N, N ', N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris (3-hidroxipropiltriazolil-metil) amina (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
Referências
- Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
Explorar mais artigos
Marcação por MetiltransferaseMarcação de DNA Específica de SequênciaMarcação de Proteínas por FluorescênciaAnálogos de Cofatores de AziridinaAnálogos de AdoMet com Dupla AtivaçãoDNA Metiltransferase M.BseCIHistona Metiltransferase Set7/9Técnica de DNA SMILingTransferência Enzimática mTAGMarcação por Química Click
