Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

Summary

Após a exocitose, a membrana plasmática fundida é recuperada por meio de um processo conhecido como endocitose. Esse mecanismo reforma novas vesículas sinápticas para a próxima rodada de liberação. Eventos endocíticos individuais são capturados e analisados por meio do uso de registros de capacitância ligados a células em células cromafins adrenais de camundongos.

Abstract

A transmissão neuronal é parte integrante da comunicação celular dentro do cérebro. A despolarização da membrana pré-sináptica leva à fusão da vesícula conhecida como exocitose, que medeia a transmissão sináptica. A recuperação subsequente de vesículas sinápticas é necessária para gerar novas vesículas cheias de neurotransmissores em um processo identificado como endocitose. Durante a exocitose, a fusão das membranas das vesículas resultará em um aumento na área de superfície e a endocitose subsequente resultará em uma diminuição na área de superfície. Aqui, nosso laboratório demonstra uma introdução básica aos registros de capacitância ligados a células de eventos endocíticos únicos na célula cromafim adrenal de camundongo. Esse tipo de registro elétrico é útil para registros de alta resolução de exocitose e endocitose no nível de vesícula única. Embora essa técnica possa detectar exocitose e endocitose de vesículas, o foco de nosso laboratório é a endocitose de vesículas. Além disso, essa técnica permite analisar a cinética de eventos endocíticos únicos. Aqui são descritos os métodos para dissecção do tecido da glândula adrenal de camundongo, cultura de células cromafins, técnicas básicas de ligação celular e exemplos subsequentes de traços individuais que medem o evento endocítico singular.

Introduction

A transmissão sináptica é mediada por exocitose de vesículas sinápticas contendo neurotransmissores e estas vesículas deve sofrer reciclagem endocítica local no terminal nervoso para manter a comunicação neuronal, a longo prazo. Dado o papel essencial da transmissão sináptica no cérebro, a compreensão do mecanismo molecular que constitui o ciclo de vesículas sinápticas é um fundamento essencial para uma melhor compreensão na comunicação celular como um todo. Entre os sistemas modelo de célula, a célula chromaffin adrenal tem proporcionado alguns dos insights mais definitivo na maquinaria molecular subjacente a reciclagem de vesículas sinápticas. Exocitose, o passo fi....

Protocol

NOTA: Todo o procedimento foi realizado de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Illinois, em Chicago Animal.

1. Soluções e Meios de Cultura Preparações

1. Mantenha todas as soluções a -20 ° C durante até seis meses. Mantenha o meio de cultura, a 4 ° C por até 3 meses.
2. Preparar 100 ml de meio de cultura por mistura de 1 ml de solução pen-strep e 1 ml de ITSX (insulina-transferrina-selênio-suplementação) a 100 ml com DMEM.
3. Preparar a solução de enzima por mistura de 250 mL de DMEM, 2,5 mL de 100 _mM CaCl2, e 2,5 ml de EDTA ....

Results

A viabilidade celular e a qualidade da vedação gigaohm são críticos na determinação da qualidade das gravações capacitância ligado de células. Portanto, é essencial para obter uma cultura de células eficazes e eficientes antes de registos electrofisiolicos, e células viáveis ​​típicas são ilustradas na Figura 1. Prática e tempo será útil na obtenção de uma vedação gigaohm com alta qualidade. Se se pode ver claramente a deformação da célula quando a pipeta patch for aproximando da célula tal como descrit.......

Discussion

Medições de capacitância anexado-Cell exigir várias etapas críticas, a fim de obter sucesso gravações com alta qualidade: 1) células viáveis ​​e saudáveis ​​preparados a partir de glândulas supra-renais; 2) PDL revestimento das lamelas; 3) de formação de selo gigaohm; 4) o nível de ruído do sistema; e 5) correção de fase.

Para a cirurgia animal, modificações pode potencialmente fazer é ajustar a abordagem cirúrgica para melhor atender destreza e para evitar danos durante a dissecção. Além di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Manter fora de UV
Dulbecco' s Vidro de Cobertura Modificado Eagle Medium	Life Technologies
	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicilina Estreptomicina	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulina-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Apenas descongele com ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 placa de aquisição de dados	National Instruments
Igor software de aquisição de dados	Wavemetrics
P-97 extrator de pipetas	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Capilares de vidro borossilicato	Sutter Instruments	B150-110-10	Diâmetro externo: 1,5 mm Diâmetro interno: 1,10 mm Comprimento: 10 cm