Artigo de método

Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

DOI:

10.3791/52031

⸱

28 de dezembro de 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unidad de Investigacón Neurovascular, Departmento de Farmacología, Falcultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid y Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre, Madrid

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Cérebro células mielóides caracterização de acidente vascular cerebral pode ser realizada por estereologia usando o método de fraccionamento da óptica, ou por uma análise de citometria de fluxo de suspensões cérebro leucócitos. Ambos são técnicas úteis para realizar uma distinção fenotípica acurada dos principais subpopulações de células mielóides encontrados no cérebro isquêmico.

Resumo

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Activação da microglia, bem como o extravasamento de neutrófilos e macrófagos haematog�ea, acredita-se desempenhar um papel crucial na lesão cerebral após apoplexia. Estas subpopulações de células mielóides pode exibir diferentes fenótipos e funções e devem ser diferenciadas e caracterizados para estudar sua regulação e contribuição para o dano tecidual. Este protocolo prevê duas metodologias diferentes para cérebro caracterização de células imunes: uma abordagem da estereologia precisa e uma análise de citometria de fluxo. A abordagem estereologia baseia-se no método de fraccionamento da óptica, o qual calcula o número total de células em uma área de interesse (cérebro enfartado) estimada por amostragem aleatória sistemática. A segunda abordagem caracterização oferece uma maneira simples para isolar suspensões de leucócitos cérebro e caracterizá-los por citometria de fluxo, permitindo a caracterização de microglia, monócitos e neutrófilos infiltrados do tecido isquémico. Além disso, também details um modelo de isquemia cerebral em camundongos que afeta exclusivamente córtex cerebral, gerando infartos altamente reprodutíveis com uma baixa taxa de mortalidade, bem como o procedimento para o processamento cerebral histológico para caracterizar o volume de enfarte pelo método de Cavalieri.

Introdução

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Morfológicas fenotípica, e expressão do gene de alterações da microglia, bem como o extravasamento e a activação de macrófagos e neutrófilos haematog�ea Acredita-se que desempenham um papel fundamental na cascata fisiopatológica após lesão cerebral 1-4. Este protocolo prevê duas abordagens para estimar o número de diferentes subpopulações de células mielóides do cérebro isquêmico e para realizar sua caracterização fenotípica. Além disso, também proporciona uma descrição de um modelo experimental de isquemia cerebral em ratos, que consiste na ligação permanente ou transitória de ambas Artéria Cerebral Média distal (ACM) e da artéria carótida comum (ACC), incluindo a forma de avaliar a enfarte pelo método Cavalieri precisa utilizando um software de estereologia.

A primeira abordagem para caracterizar as subpopulações de células mielóides do cérebro isquémico é um método de estereologia com base na abordagem de fraccionamento óptico 5. Este é o maiscomumente usado sonda estereologia em ciências da vida e fornece um alto grau de precisão, com baixos coeficientes de erro 5-7. Esta é a melhor escolha para quantificação celular quando o tecido é cortado em secções, uma vez que evita o viés sobre a estimativa da célula devido à fragmentação do tecido em secções. Este método é uma forma muito poderosa para caracterizar os números, a dinâmica e as mudanças fenotípicas de subpopulações de neutrófilos infiltrados do tecido isquêmico 8.

A segunda abordagem baseia-se na caracterização de um protocolo modificado a partir Campanella e colaboradores 9 que proporciona um modo simples para isolar suspensões cerebrais de leucócitos e para os caracterizar por citometria de fluxo. Em contraste com técnicas de imunohistoquímica convencionais, citometria de fluxo caracterização permite a diferenciação entre microglia (CD45 lo CD11b +) e infiltrado células mielóides (CD45 oi CD11b +) com base em sua diffos níveis de expressão de CD45 erent 9-13. Além disso, os monócitos pró-inflamatórias (CD45 oi CD11b + Ly-6G - Ly-6C oi), neutrófilos (CD45 oi CD11b + Ly-6G +) e outros subconjuntos de leucócitos no tecido isquémico podem ser distinguidos. Esta abordagem proporciona um ensaio rápido e fiável para avaliar neuroinflama�o em modelos de isquemia cerebral. No entanto, o processamento de tecidos podem influenciar o estado de activação e os números das diferentes populações de células presentes no tecido isquémico fornecendo uma caracterização semi-quantitativa.

Protocolo

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NOTA: Todos os protocolos experimentais aderiram às orientações do Comitê da Universidad Complutense Animal Welfare (seguindo as directivas da UE 86/609 / CEE e 2003/65 / CE).

1. Cerebral Isquemia Modelo

NOTA: O modelo de isquemia cerebral neste artigo envolve a oclusão permanente ou transitória de ambos CCA (artéria carótida comum) e MCA (artéria cerebral média) por ligação com um fio de náilon.

  1. Preparações pré-cirúrgicos
    1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave ou esterilizador com uma conta de vidro. Desinfectar a área cirúrgica com etanol a 70%, bem.
    2. Anestesiar rato com anestésicos apropriados. Atingir a indução por isoflurano 2,5% e manter com pelo isoflurano 1,5% em uma mistura de 80% de ar / 20% de oxigénio utilizando um vaporizador. Aplicar lágrimas artificiais para os olhos ratos para prevenir o ressecamento e sob anestesia.
    3. Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento que está ligado a uma taxadispositivo Dback com uma sonda de temperatura colocado no reto e ajustar a temperatura em níveis fisiológicos (36,5 ± 0,5 ºC) durante o procedimento cirúrgico.
  2. Oclusão da artéria carótida comum por ligação
    1. Posicione o mouse em decúbito dorsal e imobilizar com fita adesiva. Desinfectar a pele com etanol a 70% ou povidona-iodeto e cortar o cabelo da parte ventral superior.
    2. Sob um microscópio cirúrgico, fazer uma incisão na linha média cerca de um centímetro da superfície ventral do pescoço.
    3. Puxe tecidos de parte todas moles (tecido glandular incluindo sub-maxilar, sublingual e glândulas parótidas) e identificar deixou a artéria carótida comum (CCA), que está localizado lateralmente à traquéia. Retrair os músculos e expor CCA esquerda. Dissecar cuidadosamente do nervo vago.
    4. Uma vez dissecada, ocluir o CCA deixada por uma ligadura com uma sutura 6/0 nylon. Ligadura com um nó permanente ou um nó corrediço (para permitir a reperfusão se um modelo de isquemia cerebral transitória é desejado).
    5. Colocar o tecido glandular para a sua posição original e fechar a incisão na pele do pescoço com uma sutura de nylon 6/0.
      NOTA: animais Sham são submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico como animais MCAo mas o CCA não está obstruído.
  3. Oclusão da artéria cerebral média por ligadura distal
    1. Posicione o mouse sobre o seu lado direito e imobilizar com fita adesiva. Desinfectar a pele da cabeça com etanol 70% ou povidone-iodeto e cortar o cabelo da cabeça do rato (remover o cabelo após o corte).
    2. Sob um microscópio cirúrgico, fazer uma incisão na pele entre o olho e a orelha. Mova a pele longe e segure-o com fita adesiva.
    3. Adicione uma incisão horizontal no músculo temporal da direita para a esquerda. Em seguida, faça uma segunda incisão vertical no lado direito do músculo temporal (ter cuidado para evitar veia temporais corte). Separar o músculo temporal do crânio e segurá-la com uma sutura para manter uma superfície limpa crânio.
    4. Limpe a superfície do crâniocom solução salina estéril frio para detectar a posição exacta da artéria cerebral média esquerda (MCA) por meio de transparência crânio. Realizar uma craniotomia round (1 mm de diâmetro) com uma rebarba de aço inoxidável no lobo frontal entre o arco zigomático e osso squamosal. Retire cuidadosamente o crânio e expor a MCA.
    5. Aplicar uma pequena quantidade de solução salina estéril frio para a superfície do cérebro e remover as meninges (e dura-máter aracnóide) usando uma pinça.
    6. Execute ligadura da ACM esquerda no tronco distal pouco antes da bifurcação entre o frontal e ramos MCA posteriores. Ocluir o MCA deixada por uma ligadura com uma sutura 9/0 nylon. Ligadura com um nó permanente ou um nó corrediço (para permitir a reperfusão se um modelo de isquemia cerebral transitória é desejado). O período de tempo entre o CCA e oclusão MCA é de aproximadamente 10-20 minutos, dependendo da experiência do operador.
    7. Inserir o músculo temporal para a sua posição original e fechar a incision na pele do pescoço com uma sutura 6/0 nylon.
    8. Retorne o mouse para a gaiola para se recuperar da anestesia (geralmente 5-10 min) e injetar o mouse com buprenorfina intraperitoneal (IP) (0,3 mg / kg).
      1. Monitorar o mouse para várias horas para detectar qualquer tipo de desconforto (não deixar o mouse sem vigilância até que recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal). Desde peso pós-cirúrgico perdido é geralmente observado, coloque comida triturada em uma placa de Petri para facilitar a alimentação.
    9. Quando o animal está totalmente recuperado, volte para a companhia de outros animais.
    10. Se um modelo MCAO transiente for desejado, anestesiar o rato novamente e remover o nó corrediço da ACC e da MCA para permitir a reperfusão (geralmente entre 0,5-2 horas (Figura 1)).
      NOTA: animais Sham são submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico como animais MCAo mas o MCA não está obstruído.

2. Perfusão e Sectioning do Tecido Cerebral

  1. 24 ou 48 horas após MCAO, sacrificar o mouse com uma dose letal de anestésico (por exemplo, pentobarbital de sódio, IP 86 mg / kg ou uma overdose com isoflurano).
  2. Perfundir o rato com tampão fosfato 0,1 M, seguido por paraformaldeído a 4% (PFA) em tampão fosfato (pH 7,4).
  3. Remover o cérebro como se segue:
    1. Decapitar o animal apenas acima da medula espinhal.
    2. Faça uma incisão póstero-anterior na pele da cabeça para expor o crânio. Fazer dois cortes laterais na junção das paredes laterais e a base do crânio e remover o pequeno pedaço de osso.
    3. Faça um corte através do crânio ao longo da sutura sagital.
    4. Retire o crânio que recobre cada hemisfério usando uma pinça para expor o cérebro. Use uma espátula para separar o cérebro do crânio e transferi-lo para solução PFA 4%.
  4. Post-correção para 3 horas em solução PFA 4% a 4 ºC.
  5. Remova a solução PFA e incubatÊ O cérebro por 48 horas em solução de sacarose 30% a cryoprotect cérebro.
  6. Retirar a solução de sacarose e congelar o cérebro rapidamente em isopentano frio (-40 ºC). Loja congelado a -80 ºC cérebro.
  7. Obter seções do cérebro coronal (30 mm) com um micrótomo de congelamento. Colete dez conjuntos de série em uma solução de criopreservação. Cada conjunto de série é composta por cerca de 14-16 cortes coronais com uma distância de 300 mm interslice que provar adequadamente o cérebro do rato entre 1,94 e -2,46 posterior ao bregma.

3. Nissl e Infarct Volume Estimação

  1. Por coloração de Nissl violeta de cresilo
    1. Seções do cérebro montado em uma lâmina de microscópio SuperFrost. Para a determinação de volume de infarto pelo método de Cavalieri em seções Nissl coradas, use uma fração de 1/20 fatia-sampling (02/01 seções de um dos dez conjuntos de série recolhidas no passo 2,7; aproximadamente, um número total de 7-8 seções com uma distância de 600 μ interslice; M são utilizados). Tenha o cuidado de manter a orientação ântero-posterior adequada (área infartada é colocado no lado direito).
    2. Realização da coloração de Nissl convencional como se segue:
      1. Permitir seções montadas-slide para secar por várias horas.
      2. Rehidratar secções em lâminas e se coram com solução de violeta de cresilo a 0,1% durante 5 min.
      3. Desidratar com uma série graduada de EtOH (70%, 90% e 100%; 5 minutos por mudança). Limpe as seções montadas-slides com xileno, adicione distrene-80 plastificante xileno (DPX) meios de montagem e cobrir com uma lamela de vidro.
  2. Usando o software da estereologia para estimar o volume de infarto pelo método de Cavalieri em Nissl manchada cortes seriados
    1. Use parâmetros mostrados na Tabela 1 para quantificar o volume de enfarte pelo método Cavalieri 14 e um sistema de estereologia, que consiste de um microscópio equipado com uma câmara, uma fase computador XYZ motorizados, e software de estereologia (O principalinstruções fornecidas abaixo estão relacionados com PCs, mas as direções podem divergir para outros sistemas operacionais).
    2. Ligue PC, microscópio, controlador de fase e câmera na ordem apropriada. Inicie o software estereologia.
    3. Mova o objetivo 10X no lugar e selecione a 10X a partir da queda objetivo de menu para baixo.
    4. Movimente-se a primeira seção manchada de Nissl e encontrar um ponto de referência adequado. Clique com o mouse para estabelecer o ponto de referência (para se movimentar é necessário o botão livre alegria ativa).
    5. Estime a "espessura de corte montado" (a espessura de corte real tendo em conta o encolhimento). Pressionar o botão "Posição do Foco Meter" e calcular a espessura da parte inferior para a parte superior da secção.
    6. Criar uma ferramenta de contorno para o contralesional e áreas ipsilesional e da área infartada.
      1. Clique no menu "Display" e selecione "Configurações de vídeo". Isto abre tele exibir as configurações de diálogo.
      2. Selecione a aba "Contornos" e clique no botão "adicionar o tipo de contorno".
      3. Criar um contorno para cada região de quantificar e torná-los visíveis no contorno no menu suspenso. Clique em OK.
    7. Criar uma ferramenta de marcador para o contralesional e hemisférios ipsilesional e da área infartada.
      1. Clique no menu "Display" e selecione "Configurações de vídeo" para abrir a caixa de diálogo Configurações de vídeo.
      2. Selecione a aba "Marcadores" e mudar os marcadores nome clicando duas vezes sobre os marcadores disponíveis. Torná-los visíveis no Bar do marcador. Clique em OK.
    8. Ative o gerente de seção.
      1. Clique no menu "Ferramentas / Serial Seção Manager". Adicionar uma nova seção com o botão "novo capítulo". Este botão abre a caixa de diálogo "Setup Seção Serial".
      2. Defina o "Block Antecipada", como 30 mm. Defina o"Espessura de corte montado" com o valor estimado na etapa 3.2.5.
      3. Defina o "intervalo de avaliação", como 20. Use uma fração de amostragem 1/20 fatia.
      4. Defina "o número da seção de partida" como 1. Defina o "valor do eixo Z para a parte superior da primeira secção" como 0. Clique em OK.
    9. Desenhe um contorno para delinear o hemisfério contralateral.
      1. Selecione a ferramenta hemisfério contralesional (criado anteriormente na etapa 3.2.6) do contorno no menu suspenso.
      2. Desenhe um contorno para delinear o hemisfério contralateral.
      3. Para terminar o traçado do hemisfério contralesional, clique com botão direito do mouse e selecione "close contorno".
    10. Estimar o contorno hemisfério contralesional por Cavalieri.
      1. Clique no menu "Probes" e selecione Cavalieri Estimador. Defina "Grid Espaçamento" como 100 um. Defina "Grid Rotation", como 0. Defina o "Bbloquear Antecipada ", como 30 mm. Clique em OK.
      2. Selecione "The contralesional hemisfério" botão do Bar Markers. Botão direito do mouse dentro do contorno hemisfério contralesional.
      3. Selecione "Modo de pintura Cavalieri Marcadores". Botão direito do mouse dentro do contorno hemisfério contralesional novamente e selecione "Marcadores de pintura em Contour".
      4. Desativar Cavalieri Estimador clicando em sondas e Cavalieri Estimador e desativar o botão marcador contralesional do bar marcador.
    11. Repita o mesmo procedimento para o hemisfério ipsilesional e da área infartada (passos 3.2.7 e 3.2.8). Guardar os dados após a estimativa da área de cada secção.
    12. Calcular as áreas contralateral, ipsilesional e infartados no resto da seção Nissl-manchada.
      1. Criar uma nova seção como no passo 3.2.6. Não modifique os valores inseridos na caixa de diálogo "Serial Setup seção". Clique em OK.
      2. Repita os passos 3.2.7-3.2.8 na nova seção.
    13. Exportar os resultados da quantificação de um arquivo de planilha.
      1. Clique em "Probes" no menu Investigador Stereo. Selecione "Display Probe Run List". Isso abre a "Estereológica Anterior Executa Dialog".
      2. Selecione todas as seções, clicando sobre eles. Pressione o botão "Exibir resultados" Button. Isso abre "o Cavalieri Estimador resultados", onde a área e volume estimado para cada região são exibidas.
      3. Para exportar os resultados para um arquivo de planilha, clique em "Copiar todos os resultados para área de transferência" e colar para um arquivo do Excel com os principais resultados obtidos a partir de cada região (Tabela 2).
    14. O volume expresso infarto como mm 3 ou como% do hemisfério que é infartada (% IH) usando a fórmula 15% IH = InfVol / ContrVol * 100, onde
ove_content "> InfVol (Infarto volume de tecido) = ΣInfArea i,
ContrVol (Hemisfério contralesional Volume) = ΣContrArea i

4. Quantificação do Estereológica infiltrada Neutrófilos Após Isquemia Cerebral pelo Fracionador óptica

  1. A coloração das secções de cérebro:
    1. Para estimar o número total de neutrófilos infiltrados após MCAO pelo fraccionamento da óptica 16, utilize uma fração de amostragem 1/10 fatia. Neutrófilos imunocoloração usando técnicas de imunofluorescência convencionais com o rato anticorpo anti-Ly6G (1A8) e o anticorpo secundário direito em seções de livre flutuação. Além disso, uma contracoloração com uma máquina nuclear DAPI ou Topro como, embora não seja necessário para a identificação de neutrófilos, pode tornar mais fácil para detectar a área enfartada.
    2. Seções do cérebro montado em uma lâmina de microscópio SuperFrost com a área infartada colocado no lado direito.
  2. Quantificção de leucócitos infiltrados no cérebro isquêmico pelo fraccionamento da óptica
    1. Utilização parâmetros mostrados na Tabela 3 para quantificar os leucócitos infiltrados no cérebro isquémico pela abordagem de fraccionamento com um sistema óptico de estereologia. Repita os passos 3.2.1-3.2.5 da seção 3.
    2. Criar uma ferramenta de contorno para a área de enfarte, tal como foi descrito no passo 3.2.6 da secção 3.
    3. Criar uma ferramenta marcador para os neutrófilos, que foi descrito no passo 3.2.7 da secção 3.
    4. Ative o gerente de seção e criar uma nova seção que no passo 3.2.8. Neste caso, defina o "intervalo de avaliação", como 10 (a fração de amostragem 1/10 fatia é usado para estimar o número de neutrófilos).
    5. Selecione a opção "Infarto Area" ferramenta de contorno (criado anteriormente na etapa 4.2.1) do contorno no menu suspenso. Desenhe um contorno para delinear a área infartada em 10X objetiva. Alterar o objetivo de 100X para executar neutrophil quantificação (não se esqueça de selecionar a 100X a partir da queda objetivo de menu para baixo).
    6. Clique no menu "sondas" e selecione a opção "Fracionador Optical". Defina o "XY Colocação de quadros de contagem", como 230 para ambos X e Y tamanho da grade. Defina "Grid Rotation", como 0. Defina o "Block Antecipada", como 30 mm. Clique em OK.
    7. Selecione o botão "neutrófilos" do Bar do marcador. Mark manchado neutrófilos na área infartada. Depois de terminar, desativar a sonda Fracionador Optical clicando em "Probes" e "Fracionador Optical". Desativar o botão de neutrófilos a partir da barra do marcador.
    8. Repita o mesmo procedimento para cada seção (4.2.4-4.2.9).
    9. Exportar os resultados da quantificação de um arquivo de planilha.
      1. Clique em "Probes" no menu Investigador Stereo. Selecione "Exibir Lista Run Probe" para abrir o "Runs estereológicos anteriores"diálogo.
      2. Selecione todas as seções, clicando sobre eles. Pressione o botão "Exibir resultados" para abrir "Os resultados Fracionador ópticos", onde o número estimado de neutrófilos é exibida.
      3. Exportar os resultados para um arquivo de planilha clicando no botão "Copiar todos os resultados para área de transferência" e cole em um arquivo de planilha.

Análise 5. Cérebro dissociação e Citometria de Fluxo

NOTA: caracterizar subpopulação Mielóide por citometria de fluxo em tecido cerebral fresco pode ser usado como uma alternativa para a caracterização de neutrófilos anterior realizada em secções de cérebro fixos e imunocoradas.

  1. Dissociação cérebro e preparação da suspensão de célula única
    1. Faça 10 ml / animal de um (médio Instituto Memorial Roswell Park) RPMI solução -Percoll contendo 8 ml de RPMI, 1 ml de 30% Percoll e 1 ml de uma 10x PBS (tampão fosfato salino).
    2. Remove cérebro do rato após a MCAO, tal como descrito no passo 2.3.
    3. Sob um microscópio, dissecar core e peri-infarto áreas do córtex ipsilateral do cérebro do rato isquêmica (ou uma região similar para sham e animais ingênuos) a partir do cérebro. Peso do tecido cerebral e colocá-la em 5 ml de meio RPMI arrefecido em gelo-Percoll (o passo de peso pode ser realizada para a normalização entre grupos experimentais).
    4. Dissociar o tecido numa única suspensão de células utilizando um triturador de tecido-Elvehjem de tipo Potter com pilões de teflon.
    5. Transferir as suspensões de células a um tubo de ultracentrífuga 50 ml e adicionar mais 5 ml de solução de meio RPMI-Percoll com as amostras.
    6. Centrifuga-se as suspensões de células a 7800 x g durante 30 min a 25 ºC. Após centrifugação, assegurar uma camada de cor branca que corresponde à mielina aparece no topo da solução.
    7. Remover a camada de mielina cuidadosamente e filtrar as suspensões de células inteiras, incluindo as células peletizadas, através de 40 mm de malha de nylon strainer.
    8. Adicionar 10 ml de meio RPMI no filtro para assegurar que todas as células são filtradas e colocar a solução em um tubo de 50 ml. Adicionar 30 ml de meio RPMI e as centrífuga de 50 ml de suspensão de células a 600 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    9. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de leucócitos com 1 ml de PBS. Adicionar 4 ml de tampão de lise (150 mM de NH4Cl, 10 mM de NaHCO 3 e EDTA 0,1 mM) e incuba-se as células durante 2-3 minutos à temperatura ambiente para lisar os eritrócitos a partir da suspensão celular. Centrifuga-se a solução a 600 xg durante 10 min a 4 ºC.
  2. Coloração celular e citometria de fluxo
    1. Preparar um cocktail de rotulagem para citometria de fluxo, contendo 200 ul de PBS-BSA (1%) 1: 100 Fc-bloco, 1:40 de anti-CD45-PerCP rato, 01:40 anti-Ly6G APC-rato, anti 01:40 CD11b-FITC de rato e 01:40 anti Ly-6C-PE-rato por amostra.
    2. Ressuspender as células do coquetel rotulagem e incubar as amostras durante 45 min em gelo.
    3. Lavar o cocktail de rotulagemcom 1 ml de PBS frio e centrifugar as células a 600 xg durante 10 min a 4 ºC. Ressuspender o sedimento com 100 ul de fluxo FACS e adquirir toda a suspensão de células por citometria de fluxo.
    4. Usar um software de análise de citometria de fluxo para caracterizar e quantificar as populações de células.
      1. Principais subconjuntos de leucócitos correspondentes à rotulagem cocktail preparado neste protocolo pode ser caracterizada da seguinte forma: + CD45 lo CD11b: células microgliais residentes; CD45 oi CD11b + Ly-6G +: neutrófilos; CD45 oi CD11b + Ly-6G - Ly-6C oi: monócitos pró-inflamatórios.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O modelo de isquemia cerebral mostrado aqui gera enfarte observados exclusivamente no córtex sem afectar o tecido estriado uma vez que os ramos lenticulostriatal da MCA que irrigam o corpo estriado não são ocluídas (Figura 1). Por coloração de Nissl, a área danificada pode ser identificado como uma área cortical hipocrômico (Figura 2). Este modelo caracteriza-se por os volumes de enfarte altamente reprodutíveis às 24 horas após a MCAO (IH 15,89% ± 0,28) estimada pelo método de Nissl Cavalieri em secções coradas (Figura 2). A estimativa do volume enfartada pelo método Cavalieri é uma abordagem precisa com um erro de baixo que se reflecte no coeficiente de erros (CE) de Gundersen nos hemisférios contralesional e ipsilesional, bem como na área enfartada (Tabela 2). Volume de tecido danificado pode ser expressa em mm 3, mas também como% IH usando a fórmula na secção 3.2.13. Além disso, a estimativado volume total das regiões ipsilesional contralesional e permitem o cálculo do índice do edema para corrigir o volume com enfarte e para evitar uma sobreavaliação do tecido danificado (Tabela 2).

Dado o processamento cortes seriados do tecido cerebral, o que pode ser aproveitado para realizar uma estimativa exacta do número total de sub-populações de células, como os neutrófilos infiltrados, na área isquémica, utilizando a abordagem Fracionador óptica (Figura 3 e Tabela 4) com os parâmetros apresentados na Tabela 3. Este protocolo prevê um número total de neutrófilos (glóbulos Ly6G-positivos) na área infartada de 23.328 ± 3.623 às 24 horas e 82.856 ± 8.143 em 48 horas em camundongos após pMCAO (Figura 3D). De acordo com estudos anteriores, a infiltração de neutrófilos está diretamente relacionada com o tamanho do infarto (Figura 3E). Estimativa de tele número de neutrófilos pelo método Fracionador óptica é uma abordagem precisa com um erro baixa que é reflectida pela CE de Gundersen (Tabela 4).

O isolamento de leucócitos por citometria de fluxo e caracterização protocolo permite o isolamento de 47.922 ± 23.174 células mielóides do córtex do hemisfério ipsilesional de ratos isquémicos. Este compreende 10-30% do total de eventos encontrados na suspensão de células. A grande maioria dos eventos capturados usando esse protocolo de presente um parâmetro baixo FSC, associado a restos celulares (Figura 4). CD11b coloração mostra que as células CD11b + tem um valor maior do FSC (Figura 4), ​​sugerindo que os detritos celulares não é marcado com este marcador e, como indicado anteriormente, que podem ser excluídos de análises posteriores definindo o limite FSC em 200 9. O montante variável de restos celulares obtidos com este método sugere que as diferenças no processo de amostraing (calendário, conservação de tecidos, a temperatura da amostra, a remoção da mielina eficiente, etc.) podem ser responsáveis ​​por isso. Além disso, também é necessário o uso de filtros de células para evitar a presença de grampos celulares nas amostras; este passo tem de ser feito antes da coloração das células. Usando a estratégia de gating mostrado na Figura 5, que é baseado em CD11b e expressão de CD45, que pode discriminar entre residentes e células mielóides infiltradas no tecido isquémico. Esta população CD11b + aumentos no hemisfério isquêmico quando comparado com o ingênuo e com o grupo sham, em que estas células são geralmente associada a uma baixa expressão de CD45 indicando que microglia está proliferando após isquemia (Figura 4, Figura 5 e Tabela 5) . Esta diferença é provavelmente devido à infiltração de células a partir da periferia, como evidenciado pelo aparecimento de um CD11b CD45 + subpopulação de células oi no cérebro isquémico (Figura 4, A Figura 5 e Tabela 5) que é baixa no número ingênua e em cérebros sham. A contribuição de infiltrados para a população de células CD11b + em isquemia cerebral é um processo muito dinâmico 4. No modelo MCAO por ligadura, que pode variar de 30% a 60% do total de células CD11b +, dependendo do tamanho da lesão e do momento em que a caracterização foi feita. Os neutrófilos, caracterizadas como células Ly-6G +, são a população de células mais numerosas infiltrada encontradas em 24 horas após a MCAO no cérebro isquémico rato usando este modelo de isquemia cerebral, uma vez que compreendem a 70-80% do CD11b CD45 + oi. O restante das células são na sua maioria uma subpopulação de CD11b CD45 + hi Ly-6G - Ly-6C hi monócitos pró-inflamatórias. Neste modelo, a população vai aumentar em número em áreas cerebrais isquémicos de 24 a 48 horas após a MCAO.


Figura 1:. O procedimento cirúrgico para a ligadura MCA (A) Após a retracção do músculo temporal, uma pequena craniotomia é realizada no crânio do rato. MCA é ligado por um nó ou um nó corrediço usando uma sutura 9/0. (B) Imagens representativas da lesão cortical gerado pelo modelo MCAO. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-1
Figura 2: Quantificação do volume de infarto por Cavalieri. (A) Imagens representativas de secções de cérebro coradas Nissl-24 h após a ligadura permanente da MCA. A alta ampliação mostra a área hipocromatic após coloração Nissl queidentifica a área danificada (núcleo) após MCAO. O (PI) região peri-enfarte também é mostrada. (B) Quantificação do volume de enfarte representado como% Hemisfério enfarte (% IH), utilizando o método Cavalieri, em secções coradas Nissl-série, 24 horas após a MCAO (n = 50 murganhos ).

figure-results-2
Figura 3: Estereológica quantificação de neutrófilos na área enfartada 24 e 48 horas após a ligação, utilizando o método Fracionador óptica. (A) Imagem representativa de neutrófilos infiltrados (células Ly6G-positivos) na área isquêmica em 24 horas após MCAO. Delimitação mostra a área enfartada. (B, C) ​​Exemplos de um dissector óptico para quantificação de neutrófilos pelo fraccionador óptico. (D) Quantificação de neutrófilos totais da região enfartada em 24 e 48 h (n = 4 ratos). (E)A correlação entre o número de neutrófilos com o tamanho do infarto em 24 e 48 horas após a ligadura MCA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 4:. Análise dot-gráfico de dispersão representativas de leucócitos cerebrais obtidos a partir de hemisférios naïve, sham e isquémica (24 horas após a MCAO) sobre a base de parâmetros físicos (SSC e FSC) Uma população de eventos que expressam CD11b (vermelho) foi identificado em todos os grupos. Essa população foi fechado e caracterizados de acordo com a expressão de CD45. As células que expressam níveis baixos de CD45 (verde) estavam presentes no córtex isquémico e não-isquémica cerebral e correspondeu às células microgliais. Em contraste, as células que expressam níveis elevados de CD45 (amarelo) foram apenasencontrada no hemisfério isquêmica e em menor grau no grupo sham. Uma análise mais aprofundada da população oi CD11b + CD45 indica que os neutrófilos (Ly-6G + células, azul) e pró-inflamatórios monócitos (células Ly-6C hi, laranja) são os principais subpopulações de células encontradas no cérebro infiltra 24 horas após o AVC. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 5:. Gating estratégias para diferenciar residente de células mielóides infiltradas no tecido isquémico CD11b + células foram primeiro fechado de acordo com a intensidade de fluorescência do isotipo (O). Um gráfico representativo do ponto de suspensões de células do cérebro isquémico é mostrado no canto superior direito do painel. EmAdicionalmente, os valores típicos para o número total de eventos e para o número de CD11b + fenómenos adquiridos usando esta técnica é mostrado (não de células / hemisfério cerebral isquémica;. (A) análise de intensidade de fluorescência de CD45 das células CD11b + é mostrada no painel B. A análise de gráfico representativo do ponto de CD45 e CD11b expressão do CD11b + subpopulação fechado é mostrado no canto superior direito do painel. Além disso, o número típico de células CD45 hi lo CD45 adquiridos por hemisfério cerebral isquêmico usando esta técnica é mostrado (B).

Parâmetros utilizados para o método de Cavalieri
Seção de espessura (t) 30 pm
Objetivo 10X
Fração de amostragem Slice (SSF) 1/ 20
Distância entre as seções 600 pm
Espaço da Grelha 100 pm

Tabela 1: Parâmetros utilizados para a quantificação da estereologia do tecido enfartado.

Resultados Contralesional Ipsilesional Infarto
Área (μm²) 151460000 155060000 22600000
Volume (μm³) 90876000000 93036000000 13560000000
Volume Corrigido para
Ao longo da projeção (μm³) 		89957100000 92046300000 13416600000
Coeficiente de Erro (Gundersen),
m = 0 		0,068 0,077 0,067
Coeficiente de Erro (Gundersen),
m = 1 		0,015 0,017 0,015
Coeficiente de Erro (Gundersen),
alfa (q) 		0,068 0,077 0,067
% Hemisfério Infarto 14.90
Cérebro Edema (Ips Vol / Vol Cont) 1.02

Tabela 2: Exemplos representativos de volumes contralesional, ipsilesional e infarto pelo método de Cavalieri usando o Software Investigador Stereo.

parâmetros usados ​​para o fraccionamento da Optical
Seção Espessura (TSF) 30 pm
Objetivo 100X
Fração de amostragem Slice (SSF) 1/10
Contando Quadro Altura 40 pm
Contando Largura do quadro 40 pm
Tamanho da grade X 230 pm
Tamanho da grade X 230 pm
Safe Guard 2 pm
Optical Disector Altura 14 mm

Tabela 3: Parâmetros utilizados para a quantificação estereológica de neutrófilos infiltrados após isquemia cerebral com a sonda de fraccionamento da óptica usando o Software Investigador Stereo.

Estimativa de neutrófilos pelo Fracionador óptica
Número de locais de amostragem 430
Forma Fator 6.24
Total de marcadores Contado 166
Os neutrófilos estimadas por Fracionador Optical 117,608.03
Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 0 0,22
Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 1 0,09

Tabela 4: Exemplo representativo dos neutrófilos infiltrados estimado após isquemia cerebral com a sonda Fracionador óptica usando o Software Investigador Stereo.

CD11b + Os neutrófilos Os monócitos Microglia
Ingénuo 25.863 ± 4,575.8 473 ± 75,8 525 ± 191,4 19.012 ± 1.523
Sham 24 hr 24.563 ± 5.263 873 ± 192,5 1.124 ± 391,5 23.734 ± 2.910
pMCAO 24 hr 47.922 ± 23.174 4874 ± 748,7 4,826 ± 1,345 35.395 ± 10.833

Tabela 5: Resultados representativos das células mielóides estimados após a isquemia cerebral com a abordagem por citometria de fluxo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O modelo de isquemia cerebral introduzido aqui dá volumes de infarto altamente reprodutíveis determinada 24-48 horas e 7 dias após a ligadura MCA por diferentes abordagens 8,15,17. Este modelo MCAO tem uma baixa taxa de mortalidade (menos de 1%) em comparação com os outros, minimizando o número de animais utilizados nos estudos. Uma etapa fundamental para se obter esta baixa taxa de mortalidade é de manter as condições de assepsia adequadas para evitar infecções que poderiam prejudicar a sobrevivência após a indução acidente vascular cerebral. Este modelo MCAO pode não só ser usado como um modelo MCAO permanente, que é considerado um modelo clinicamente relevante para a investigação de translação 18, mas também como um modelo de transição por ligadura temporária da ACC e da MCA com um nó corrediço e posterior reperfusão no momento desejado 19. Este método tem sido utilizado com sucesso em ratinhos e ratos 17,20. Todas essas evidências indica que MCAO por ligação é um modelo versátil alta de isquemia cerebral com múltiplas aplicações. A critical passo desta técnica é que não requer cirurgia invasiva sob um estereomicroscópio; a craniotomia deve ser realizada com muito cuidado, para não danificar o osso zigomática bem como a MCA. No entanto, a utilização de animais sham (os quais são submetidos ao procedimento cirúrgico e da MCA mas CCA ligadura não é executada) proporciona uma ferramenta útil para discriminar efeitos dependentes de procedimentos cirúrgicos. A extensão da lesão cerebral após esta técnica pode ser quantificada por vários métodos. Nosso protocolo de seccionamento do cérebro, coloração de Nissl e subsequente estimativa do volume por Cavalieri permite uma quantificação exacta da região danificada e minimiza o número de ratos utilizados neste tipo de estudos desde secções de cérebro de série também pode ser utilizado para a análise imuno-histoquímica diferente. Para um melhor desempenho desta metodologia, é importante escolher os parâmetros apropriados utilizados no software estereologia (Tabela 1), que será necessária para a estimativa the volume das diferentes regiões pela fórmula: V = 1 / * ssf um f * t * i ΣP (SSF é a fracção de amostragem fatia, t é a espessura média das secções, uma f é a área do espaçamento da grelha e ΣP o número de pontos que afectam a estrutura).

A MCAO distal por ligação pode ser útil para caracterizar o infiltrado de leucócitos e subpopulações de células imunes que 8,13 participar no processo inflamatório após lesão cerebral 1-4. Aqui, propomos duas metodologias diferentes para a caracterização do cérebro de células imunes, uma abordagem estereológica precisa e uma análise de citometria de fluxo para melhor caracterizar vários leucócitos as subpopulações.

Tirando vantagem da série de corte cerebral, a quantificação do número total de neutrófilos pode ser conseguida pelo método de fraccionamento óptico 16, o qual calcula o número total de células a partir do número de células wit amostradoha aleatoriamente amostradas (SRS) conjunto sistemático de espaços virtuais imparciais contagem abrangendo toda a região de interesse, no nosso caso, a região de infarto, com distância uniforme entre os espaços virtuais de contagem imparciais em direções X, Y e Z. Este método fornece uma ferramenta precisa para estimar o número total de neutrófilos no cérebro isquémico em diferentes momentos após a ligação. Embora ainda não tenha sido demonstrado neste estudo, este protocolo pode também ser usado para a estimativa dos diferentes sub-populações de neutrófilos após isquemia e 21 para uma quantificação precisa de qualquer outra população de células encontradas no cérebro isquémico como outros leucócitos infiltrados (monócitos / macrófagos) e também para estimar neurônios sobreviventes ou mesmo para a neurogênese quantificação após acidente vascular cerebral. O passo mais importante para uma estimativa exacta da área desejada é a selecção dos parâmetros apropriados, como os mostrados na Tabela 3, para a quantificação de neutrófilos na região isquémica.Estes parâmetros serão usados ​​para o software de estereologia para calcular o número total de células positivas para (N), usando a equação N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / tsf (ΣQ- é o número total de células contadas com o de fraccionamento, SSF é a fração de amostragem seção, asf é a área fração de amostragem, e tsf é a espessura fração de amostragem) 5. Embora esta metodologia é mais lento do que outras técnicas de quantificação (por exemplo, análise de marcadores de neutrófilos por mg de tecido, densitometria de imagens ou o número de neutrófilos por campo representativo), que tem a vantagem de ser uma técnica imparcial e um sólido que proporciona uma precisão quantificação do número de células.

A abordagem isolamento de leucócitos cérebro permite uma identificação e quantificação simultânea de vários subtipos de células imunológicas, sem a necessidade de influenciar o sistema por coloração in vivo ou manipulações genéticas. Célula subsequente triagem do mielóide p caracterizadoopulations ou a sua separação imunomagnética pode ser usado para várias aplicações a jusante, tais como outros estudos sobre gene ou expressão da proteína. A caracterização precisa de neutrófilos, monócitos e microglia obtidos com este método proporciona uma elevada especificidade em relação a métodos existentes, tais como os estudos de imuno-histoquímica, uma vantagem que permite a atribuição de funções específicas para as diferentes células mielóides cérebro que medeiam a resposta imune inata. Além disso, ela pode ser alargada de modo a caracterizar outras populações de cérebro com o rótulo adequado, como através do sangue, macrófagos (CD11b CD45 + CD68 + oi), e pode ser aplicado para o estudo de outras patologias do SNC ou ferimentos. Portanto, esta técnica fornece uma ferramenta essencial para explorar a heterogeneidade da resposta inflamatória no cérebro. A principal limitação desta técnica reside na preparação das suspensões de leucócitos a partir de tecido cerebral fresco, o que pode alterar oestado de activação das células ou das suas alterações antigénio. Embora esta técnica permite uma caracterização qualitativa mais detalhada em relação aos estudos de imuno-histoquímica, ele fornece uma quantificação menos precisas com base em isolamento celular. Apesar disso, a eficiência de nosso protocolo de isolamento de células é semelhante a outras metodologias publicadas e 9 pode ser eficientemente usado para detectar diferenças no número de células do sistema imunológico do cérebro entre o controlo e grupos MCAO ou mesmo entre grupos MCAO submetidos a diferentes tratamentos 8.

As etapas críticas do presente protocolo são a dissecção dos tecidos, o procedimento de rompimento do tecido, e a remoção da mielina. Em relação à coleta de tecido, uma etapa de normalização podem ser incluídos (por pesagem do tecido coletado) para evitar a variabilidade devido a diferentes performances de dissecação. Além disso, a normalização entre diferentes grupos MCAO também pode ocorrer através do volume de enfarte (previamente determinada por R Magnéticaesonance). Outra maneira de resolver este problema é a utilização de todo o hemisfério ipsilateral de ambos os grupos isquémicos e de controlo, ou mesmo utilizar o hemisfério contralateral do rato isquémica como controlo, para minimizar o número de animais utilizados. Embora esta abordagem evita a diferenças entre cada dissecção, tem uma desvantagem principal; um factor de diluição é adicionado através do aumento do número total de células, mas não o número de células mielóides, que estão localizados exclusivamente no núcleo e peri-enfarte áreas do córtex ipsilateral. Quanto rompimento do tecido, este protocolo ilustra as etapas para a ruptura mecânica das células do cérebro, evitando tratamentos enzimáticos e prevenir superfície antígeno alteração 9,22, uma questão essencial para posterior análise qualitativa e quantitativa das subpopulações de células inflamatórias. Para além da preparação da suspensão de células de interesse, a remoção de amostras de cérebro de mielina é um passo altamente recomendado para evitar a interferência com downstaplicações resma, como a separação de células imunomagn�ica ou citometria de fluxo 23,24. Isto pode ser realizado através de diferentes métodos, tais sacarose ou gradientes de Percoll, ou grânulos anti-mielina. Aqui, e com base em estudos anteriores que comparam diferentes métodos para isolamento suspensão de células do cérebro, ruptura mecânica em combinação com o uso de Percoll para remover mielina é usado para melhorar a produção e viabilidade celular 25.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por doações do Ministério da Economia e Competitividade da Espanha CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) e RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), e do Governo Local de Madri S2010/BMD-2336 (MAM) e S2010/BMD-2349 (IL). IB e MIC são bolsistas do Ministério da Economia e Competitividade da Espanha.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento Photonic Led F1WPI571329-8
nbsp;Panlab HB 101/2Equipamento
Volvere GXNSKNe22LEquipamento
Microscópio WPIPZMIII-BSEquipamento
Aço Inoxidável BurrsFST19007-14Material cirúrgico
Fórceps Dumont #5/45 FST11251-35Material cirúrgico
Fórceps Dumont #5SFFST11252-30Material cirúrgico
Sutura 6/0LorcaMarin55108Material cirúrgico
Sutura 9/0LorcaMarin61966Material cirúrgico
Nikon Eclipse NikonTE300Equipamento
IsofluranoEsteve571329-8Químico
Pentobarbital de SódioVetoquinol570681
Micrótomo de Congelamento QuímicoLeica Microsystems GmbHSM2000REquipamento
Superfrost slidesThermo Scientific 2014-07 Material delaboratório
Acetato violetaCresyl SigmaC5042Microscópio Químico
 NikonNikon Eclipse TE300Equipamento
XYZ estágio de computador motorizado e controladorLudl electronics ProdutosEquipamento
Sistema de Investigação EstéreoMicrobrightfieldVersão 7.003 SoftwareSoftware
5 ml Moedor de tecidos, Potter-Elv com pilão de teflonThomas Scientific0913X70Material
de laboratório Polipropileno 50 ml Oak Ridge Tubo de CentrífugaNalgene3119-0050 Material de laboratório
PercollSigmap1644-100Químico
RPMI 1640LonzaBE12-702FQuímico
Beckman UltracentrifugueBeckman Coulter Equipamento Beckman Coulter
Rotor de ultracentrífuga 45 Ti BeckmanCoulterEquipamento
Filtro de células estéreis, 40 mícronsBDBD 352340Material
de laboratórioAlbumina de soro bovinoSigmaA3733-500GReagment
FcR bloqueando reagente, camundongoMiltenyi130-092-575Anticorpo
CD11b-FITC, humano e camundongoMiltenyi130-098-085Anticorpo
CD45-PE, camundongoMiltenyi130-102-596Anticorpo
Anti-Ly-6G-APC, camundongoMiltenyi130-102-936Anticorpo
PerCP/Cy5.5 anti-rato Ly-6CBiolegend128012Anticorpo
BD FACS FlowBD342003Reagment
BD FACSCalibur; Equipamento BD 342975 de 4 cores
BD Cell Quest Pro SoftwareBDSoftware
softwareTreestar inc.software
Controlador de Temperatura de & BD FlowJo

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