Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

Summary

Os principais tipos de células aderentes derivadas do músculo humano são células miogênicas e fibroblastos. Aqui, as populações de células são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo com base no antígeno CD56. A imunomarcação subsequente com anticorpos específicos e o uso de técnicas de análise de imagem permitem a quantificação das características citoplasmáticas e nucleares em células individuais.

Abstract

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites, que são as células estaminais musculares residente. Estes podem ser isolados a partir de amostras de biópsia do músculo humano, utilizando a digestão enzimática e as suas propriedades miog�icas estudadas em cultura. Quantitativamente, os dois tipos principais de células aderentes obtidas a partir da digestão enzimática são: (i) as células satélites (denominados células miogénicas ou células precursoras do músculo), inicialmente identificadas como CD56 ⁺ e mais tarde como células CD56 ⁺ / ⁺ e desmina (ii) músculo- fibroblastos derivados, identificadas como CD56 ^- e TE-7 ^+. Os fibroblastos proliferam de forma muito eficiente na cultura e nas populações de células mistas essas células podem invadir células miogênicas para dominar a cultura. O isolamento e purificação de diferentes tipos de células de músculo humano é, portanto, um aspecto metodológico importante quando se pretende investigar o comportamento inato de qualquer um dos tipos de células em cultura. Aqui nós descrIBE um sistema de triagem baseada na digestão enzimática suave de células utilizando colagenase e dispase seguido por triagem de células activadas magnético (MACS), que dá um alto grau de pureza (> 95% de células miogénicas) e um bom rendimento (2,8 x 10 ~ ⁶ ± 8,87 ⁵ x 10 células / g de tecido depois de 7 dias in vitro) para experiências em cultura. Esta abordagem baseia-se na incubação da população mista de células derivadas do músculo com microesferas contas magnéticas conjugadas com um anticorpo contra CD56 e, em seguida, passando células embora um campo magnético. As células CD56 ⁺ ligadas a microesferas são mantidas pelo campo enquanto que CD56 ^- células transitar livremente através da coluna. As suspensões de células a partir de qualquer fase do processo de triagem pode ser plaqueada e cultivadas. Após um determinado intervenção, morfologia celular, e a expressão e localização de proteínas, incluindo os factores de transcrição nuclear pode ser quantificada utilizando rotulagem de imunofluorescência com anticorpos específicos e uma imagem pRATAMENTO e pacote de análise.

Introduction

A reparação e regeneração do músculo esquelético requer a acção de células satélites ^1, as células estaminais miog�icas ^2,3. In vivo, estas células existir num estado quiescente reversivelmente localizado entre o sarcolema e lâmina basal de cada myofibre, mas tornar-se activado para proliferar, fusível e diferenciar como o tecido muscular danificado, reparado e regenerado ^3. Células satélite pode ser isolado a partir de amostras de biópsia jovens e idosos músculo humano utilizando digestão enzimática ⁴ e suas propriedades pode ser subsequentemente miog�icas estudado em cultura primária ^5. A eficiênci....

Protocol

NOTA: Para os estudos realizados em nosso laboratório de todos os indivíduos deram o seu escrito, o consentimento informado para participar e todos os experimentos foram realizados com aprovação do Comitê de Ética Serviço Nacional de Saúde do Reino Unido (Comitê de Ética em Pesquisa Londres; referência: 10 / H0718 / 10) e de acordo com a Human Tissue Act e da Declaração de Helsinki.

1. Preparação inicial antes da biópsia do músculo (15 min)

1. Adicione meio de crescimento do músculo esquelético humano. Para uma estéril tubo de 50 ml formou adicionar 2,5 ml da mistura de suplemento, 10 ml de soro fetal de vitela, antibióticos (peni....

Results

As células miogénicas purificada e fibroblastos podem ser cultivadas em meio de diferenciação adipogênica durante três dias, seguidos de meio de nutrição adipogénica de qualquer lugar entre 7-30 dias, para avaliar o seu potencial para a adipogénese. Usando as populações de células purificadas, Oil Red O coloração em combinação com a imunomarcação para marcadores de linhagem adipog�icas e miog�icas mostrou que apenas a fracção de fibroblastos era capaz de diferenciação de adipócitos (Figura 2). A acu.......

Discussion

Nós descrevemos um procedimento de triagem immunomagentic para o enriquecimento selectivo de precursores derivadas de músculos humanos a partir de pequenas amostras de material de biópsia do músculo. Esta técnica tem sido valiosa no nosso laboratório para superar a perda de culturas derivadas de músculos humanos para fibroblastos, mas também para a compreensão do comportamento exclusivo das populações distintas de células progenitoras derivadas de músculos. Uma vez que as células miogénicas purificados podem ser investi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colagenase  D	Roche
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Deve ser esterilizado por filtro antes do uso
Tripsina / EDTA	(Gibco) Invitrogen	15400-054
100 &# 956; filtro de células m	BD Biosciences	352360
Solução de colágeno (3 mg/ml em ácido acético a 0,1%)	Sigma, Dorset, Reino Unido	C8919
Filtro de seringa Minisart SRP15 (0,2 μ m)	Sartorius	17573ACK	Membrana de politetrafluoretileno (PTFE)
CD56 microesferas humanas	Miltenyi Biotech	130-050-401	Esteja ciente da vida útil limitada das microesferas
Microesferas anti-fibroblastos, humano	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 μ m Filtros de pré-separação	Miltenyi Biotech	130-041-407
Large Cell Collumns	Miltenyi Biotech	130-042-202	Estas colunas vêm com um resistor de fluxo. O uso do resistor de fluxo não é necessário para obter as altas purezas miogênicas descritas aqui.
Colunas LS	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	Este separador se encaixa na coluna de células grandes, mas não na coluna LS.
MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Deve ser esterilizado por filtro antes do uso
Óleo Red O	Sigma	O0625
Seril fosfato	Sigma	538728
Whatman Paper	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Ashless. Para preparar o filtro, dobre o papel de filtro circular para fazer um semicírculo e, em seguida, dobre o semicírculo ao meio novamente para formar uma forma de cone. Encaixe o cone em um funil para filtragem.
Sondas Moleculares de Reagente Antidesvanecimento ProLong Gold	, Invitrogen	P36930	Isso pode ser comprado com ou sem DAPI e não extingue a fluorescência inicial.
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe (comprado da Pugh Computers)	ADPH16982*