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Artigo de método

Fluorescent Rápida In Situ Protocolo de hibridação para Xist RNA combinado com imunofluorescência de Histone Modificação na inativação do cromossomo X

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DOI:

10.3791/52053

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26 de novembro de 2014

 ,  ,  ,  , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Desenvolvemos um protocolo de hibridização in situ fluorescente (FISH) específico para fitas facilmente personalizado combinado com imunofluorescência. Isso permite um exame detalhado da dinâmica do RNA com visão simultânea da estrutura da cromatina, organização nuclear e regulação transcricional no nível de célula única.

Resumo

Combinando ARN hibridização in situ fluorescente (FISH) com a imunofluorescência (imuno-FISH) cria uma técnica que pode ser empregue no nível da célula individual para detectar a dinâmica espacial de localização de ARN com visão simultânea para a localização de proteínas, modificações epigenética e outros detalhes que pode ser destacado por imunofluorescência. Inativação do cromossomo X é um paradigma para longo RNA não-codificante (lncRNA) silenciamento gênico mediado. Transcrição específico (Xist) acumulação lncRNA X-inactiva (chamado uma nuvem Xist) em um dos dois X-cromossomas em fêmeas de mamíferos é um passo crítico para iniciar a inactivação do cromossoma X. RNA Xist direta ou indiretamente interage com várias enzimas modificadoras da cromatina e introduz paisagens epigenéticas distintas para os inactivos cromossomo X (Xi). Uma característica conhecida da epigenética Xi representa a histona H3 trimetil-lisina 27 modificação (H3K27me3). Aqui, descrevemos um imuno-FISH simples e rápidaprotocolo para a detecção Xist RNA usando RNA FISH com várias sondas de oligonucleotídeos juntamente com imunofluorescência de H3K27me3 para examinar a localização dos Xist RNA e modificações epigenéticas associadas. Usando sondas oligonucleotídicas resulta em um tempo de incubação mais curto e de detecção mais sensível do Xist ARN em comparação com in vitro transcritos de sondas de ARN (ribossondas). Este protocolo fornece uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica de lncRNAs e sua modificação epigenética associados, estrutura da cromatina, organização nuclear e de regulação da transcrição.

Introdução

Mammalian inactivação do cromossoma X (XCI) é uma estratégia para compensar o desequilíbrio de dosagem do gene ligado ao X e XY entre XX, em que um dos dois cromossomas X em fêmeas é transcricionalmente inactiva 1. Inativação do cromossomo X é um grande sistema modelo para RNA longo não-codificante (lncRNA) pesquisa. Inativação do cromossomo X é regulada por vários lncRNAs, e tem sido amplamente estudado ao longo das últimas décadas para descobrir os mecanismos de crosstalk entre lncRNAs, transcrição, estrutura da cromatina e organização nuclear 2, 3.

O centro X inactivação (XIC) localizado no cromossoma X é um locus genético complexo composto de um número de genes que produzem não codificantes RNAs 4. X-inativo transcrição específico (Xist) lncRNA em mamíferos eutherian é um desses lncRNA que desempenha um papel crucial na inativação do cromossomo X 5,6. Transcrições XIST rodeiam o local do future Xi para iniciar inativação do cromossomo X, e aparecem como uma nuvem quando visualizada usando RNA FISH; esta formação é referido como o "Xist Nuvem" 7. Desde Xist ARN interage com vários enzimas de modificação de cromatina, a co-localização das nuvens XIST com diferentes modificações epigenética para cromatina silenciosa e repressor de transcrição é observado durante a inactivação do cromossoma X 8. Por exemplo, Xist ARN interage com Polycomb complexo repressor 2 (PRC2) que é responsável pela H3K27me3 e induz um estado repressivo 9 cromatina. A ocorrência da nuvem Xist no Xi e sua co-localização com a modificação intensiva H3K27me3 representa uma paisagem heterocromatina facultativa do Xi 10,11.

Técnicas de citogenética, como o DNA / RNA FISH têm percorreu um longo caminho desde o método tradicional utilizando sondas radiomarcados 12 às técnicas recentes e avançados, com maior sensibilidade eimagens fluorescentes usando várias sondas de oligonucleotídeos 13,14. PEIXES ADN / ARN acoplado com a imunofluorescência foi rotineiramente usado como uma ferramenta para compreender citológico organização espaço-temporal nuclear, ARN de localização, a estrutura da cromatina e modificações. A preparação mais padrão sonda para RNA FISH envolve o uso de plasmídeo ou cromossoma artificial (BAC) clones bacterianas e sua rotulagem subsequente quer com tradução nick ou iniciação ao acaso 15. No entanto, cerca de 70% dos genes em ratos e 40% de genes em humanos mostram uma sobreposição de transcritos de sentido e anti-16, exigindo assim um método FISH específico de cadeia, a fim de distinguir o sentido e anti-transcrições. Em sondas de ARN transcritos in vitro (ribossonda ) são frequentemente utilizados para específicos de cadeia de ARN FISH 17,18; No entanto, isto envolve a preparação de um clone de plasmídeo ou com o produto de PCR de T7, SP6 ou T3 promotor e ribossondas sintetizar. Além disso, ribossondas derivado genomic DNA ou cDNA geralmente contêm regiões não-específicas e elementos repetitivos, que resultam em alto ruído de fundo. Outra questão é que ribossondas, que são algumas centenas de nucleótidos de comprimento e contêm vários fluoróforos, não pode penetrar de forma eficiente para o núcleo. Para contornar este, várias sondas de oligonucleótidos mais curtos marcados com um fluoróforo único no final foram desenvolvidos que possuem uma boa sensibilidade, a intensidade do sinal uniforme, e facilidade de purificação e de manuseamento 14. Além disso, os oligonucleótidos de ADN são geralmente mais estáveis ​​do que o RNA. Nós aplicamos uma estratégia similar de usar oligonucleotídeos em Xist RNA FISH 19 com imunofluorescência para entender a dinâmica epigenéticas do Xi induzidas por Xist lncRNA durante o processo de inativação do cromossomo X. Este protocolo descreve a criação de sondas de oligonucleótidos e preparação de células apropriada, bem como a utilização de imunofluorescência e ARN FISH. Xist RNA FISH usando oligonucle múltiplaotides é o custo abordagem eficaz a longo prazo, se Xist RNA FISH é realizada rotineiramente em um laboratório. Esta técnica pode ser usada para identificar lncRNAs em células, ao mesmo tempo mapeando sua co-localização com modificações epigenética ou factores. Uma das principais vantagens do protocolo é a capacidade de modificá-lo facilmente para atender um de interesses de pesquisa.

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Protocolo

1. Preparação Probe

  1. Obter vários oligonucleotídeos únicas em Xist (oligonucleotídeos 20-30 nucleotídeos de comprimento, 63-65 ºC de temperatura de fusão, a Tabela 1) com uma modificação 5'-amino e suspender em água.
  2. Piscina quantidades equimolares de oligonucleotídeos com 5'-amino modificação (total 4,5 g) e etiqueta com corante fluorescente amino-reactivo seguindo as instruções do fabricante.
    1. Dissolve-se os oligonucleótidos reunidos no final de 5 ul de água isenta de nuclease e adicionar 3 mL de 1 M de bicarbonato de sódio à solução de oligonucleótido.
    2. Adicionar 2 mL de DMSO para o frasco de corante e vortex brevemente reactivo com amina.
    3. Misturar a solução de oligonucleótido com o corante reactivo em DMSO e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 1 h no escuro.
  3. Purifica-se as sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência por coluna G-25 seguido de precipitação com etanol.
    1. Centrífuga coluna G-25 a 750 xg durante 1 min para remover o excesso de tampão de armazenamento.
    2. Adicionar 40 ul livre de nuclease de água à mistura de rotulagem produzido no Passo 1.2.3 e aplicar à coluna de G-25. Centrifugar a 750 xg por 2 min.
    3. Adicionar 50 ul de água livre de nuclease, 10 ul de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 250 ul de etanol a sonda purificada a partir do passo 1.3.2. Armazenar a -80 ° C durante 30 min e centrifuga-se a 21.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
    4. Lavar os oligonucleótidos precipitados uma vez com 1 ml de etanol a 70%.
    5. Re-suspender em 50 ul de água isenta de nuclease ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; EDTA 1 mM) para uma concentração final de aproximadamente 10 pM.
  4. Dilui-se as sondas de oligonucleótidos marcados com fluorescência para uma concentração final de 250 nM com tampão de hibridação (formamida a 10%; 2 x SSC [NaCl 300 mM; citrato de sódio 30 mM], 2 mg / ml de BSA, 10% de sulfato de dextrano).
    NOTA: Com este protocolo FISH rápida, oligonucleotídeo pmantos de Xist foram concebidos e utilizados com uma concentração mais elevada do que o protocolo normal de FISH utilizando sondas oligonucleotídicas, a fim de encurtar o tempo de incubação para a hibridação.

2. Deslize Preparação

NOTA: As lâminas podem ser preparados para imuno-FISH utilizando o rato-tronco embrionárias (ES) ou corpo embryoid (EB) diferenciação de células 20, 21 ou por cultivá-las diretamente em um slide tratados com poli-lisina ou usando cytospin com suspensão de células. Aqui, preparação da lâmina por cytospin é mostrado.

  1. Aspirar o meio de cultura em um prato de 6 poços. Lavar com PBS (temperatura ambiente), e aspirado cuidadosamente.
  2. Adicionar 0,5 ml de tripsina para o prato de 6 poços, incubar durante 5-10 min a 37 ° C.
  3. Adicionar 5 ml de meio e dispersar as células por suavemente pipetando para cima e para baixo várias vezes.
  4. Transferir as células para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente.
  5. Descartar o meio de umd suavemente suspender as células em 2 ml de PBS.
  6. Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão celular a 4 x 10 5 células / ml por PBS.
  7. Montar uma corrediça, um cartão de filtro e uma câmara com um grampo e colocá-los dentro das ranhuras adequadas no rotor do cytospin. Adicionar 250 mL de cada amostra preparada no passo 2.6 em cada câmara das unidades montadas na cytospin. Centrifuga-se a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  8. Encher frascos de 3 coplin sobre gelo com 40 mL de cada um de tampão PBS, CSK gelado (10 mM PIPES, pH 6,8; NaCl 100 mM; sacarose 300 mM; MgCl2 3 mM) e tampão CSKT (CSK com tampão de 0,5% de Triton X-100), respectivamente.
  9. Após a citocentrifugação está terminado, rapidamente transferir a corrediça em PBS gelado e incubar durante 5 min.
  10. Transferir as lâminas para tampão CSK gelada e incubar durante 1 min.
  11. Transferir as lâminas para tampão CSKT gelada e incubar durante 5 min.
  12. Transferir as lâminas de volta para gelada CSK buffer e incubar durante 1 min.
  13. Transferir as lâminas em 4% de paraformaldeído em PBS e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.

3. Imunofluorescência

  1. Colocar as lâminas em um frasco coplin com PBST (1x PBS com 0,1% de Tween-20) durante vários segundos.
  2. Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide e colocá-lo em uma caixa de pipeta-tip vazio com água. Sobrepor a lâmina com 40 ul de solução de bloqueio (PBS 1x, 1% BSA, 0,1% de Tween-20), colocar suavemente uma lamela, e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
  3. Retirar as lamelas, remover a solução de bloqueamento e adicionar 40 ul de anticorpo de histona H3K27me3 primário diluído para uma concentração de 1: 500 em solução de bloqueio. Coloque a lamela de volta sobre a lâmina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
    NOTA: Um inibidor RNase na solução de bloqueio pode ser útil para preservar RNA neste RNA FISProtocolo de H quando são utilizados anticorpos policlonais.
  4. Wash deslizar 2 vezes em frascos coplin cheios de PBST, durante 5 minutos cada, agitando suavemente durante a lavagem.
  5. Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta na caixa de ponta. Sobreposição com 40 ul do anticorpo secundário (1: 500) diluídos em solução de bloqueio, colocar uma lamela, e incubar durante 15 min no escuro. Para os passos seguintes, manter o slide no escuro em todos os momentos.
  6. Lavar duas vezes em frascos Coplin com PBST como no passo 3.4.

4. FISH RNA com Oligonucleotide Sondas

  1. Pré-aquecer uma caixa de pipeta-tip vazio com água na parte inferior para evitar slides de secagem a 37 ° C por RNA FISH no passo 4.3.
  2. Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide a partir do passo 3.6 e coloque a lâmina na caixa de pipeta-ponta com water na parte inferior. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem de FISH (10% de formamida em 2 x SSC) sobre a lâmina e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  3. Remover solução de lavagem FISH, adicione 8 mL de sondas de oligonucleotídeos para o slide, coloque uma lamela, e transferir o slide para uma caixa de pipeta-ponta pré-aquecido com água na parte inferior; incubar a 37 ° C durante 1-2 horas.
  4. Coloque 3 frascos coplin pré-aquecido em banho-maria a 37 ° C com tampão de lavagem FISH, tampão de lavagem FISH com DAPI, e 2x SSC.
  5. Depois de 1-2 incubação hr para RNA FISH, coloque o slide no tampão de lavagem FISH pré-aquecido.
  6. Incubar a lâmina durante alguns minutos até que a lamela cai fora da lâmina.
  7. Colocar a lâmina de volta para o tampão de lavagem, e continuar a incubação durante 5 min.
  8. Transferir as lâminas para outro frasco coplin com tampão de lavagem pré-aquecido FISH com 0,5 ng / ml DAPI e incubar por 5 min.
  9. Transferir as lâminas para outro frasco coplin com pré-aquecido 2x SSC e incubar por 5 min.
  10. Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta em uma caixa de ponta seca. Adicione 4 l de antifade com DAPI para o slide e colocar uma lamela.
  11. Selar a lamela com unha polonês e observar ao microscópio. A corrediça pode ser armazenado a 4 ° C no escuro, por alguns meses.

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Resultados

Imagens representativas de rápida imuno-FISH são apresentados na Figura 1A. A co-localização do sinal de Xist ARN nuvem e H3K27me3 no Xi foi detectado na diferenciação das células do sexo feminino. No dia 12 após a diferenciação, mais de 90% das células tinha uma nuvem EB Xist (Figura 1B). Sondas oligonucleotídicas curto eficientemente penetrou nos núcleos, levando a uma visualização de quase todos H3K27me3 sinais co-localizada com Xist ARN (Figura 1C; 97%, n = 150).

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Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo de imuno-FISH rápida, que leva menos de 5 horas para completar a preparação slide, Xist RNA FISH, e imunofluorescência para H3K27me3. Em comparação com a abordagem geral imuno-FISH para Xist RNA de detecção, que normalmente precisa de incubação durante a noite para RNA FISH, este protocolo não só reduz significativamente o tempo gasto, mas também melhora a sensibilidade imunológica-FISH usando sondas de oligonucleotídeos.

Uma vez que é altamente Xist t...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Agradecemos a Hongjae Sunwoo pelos conselhos úteis para o design de oligonucleotídeos em RNA FISH. Agradecemos também a Serenity Curtis pela edição do manuscrito. NY foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado para pesquisa no exterior da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS). Este trabalho foi apoiado pelo NIH (RO1-GM102184), pela March of Dimes Research Foundation (# 6-FY12-337) e pelo Fundo de Desenvolvimento e Subsídio de Curadores do Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati para YO.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
oligonucleotídeos com modificação 5'-aminoIDT
Alexa Fluor 488 Corante ReativoLife TechnologiesA32750
MicroSpin G-25 colunasGE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
Albumina de soro bovino, Grau de Biologia Molecular (para tampão de hibridização)Roche
Histone H3K27me3 anticorpoActive Motif61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, altamente adsorvidoLife TechnologiesA21424
Reagente antidesbotamento ProLong GoldLife TechnologiesP36931
10715859103

Referências

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