Artigo de método

Técnica para as aquisições de fígado de porco e Transplante ortotópico usando um Active Porto-Caval Shunt

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DOI:

10.3791/52055

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7 de maio de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Multi Organ Transplant Program, Department of Surgery, Toronto General Hospital

Neste artigo

Resumo

A pesquisa experimental em animais desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da prática clínica de transplante. O modelo de transplante de fígado ortotópico suíno (OLTx) se assemelha muito às condições humanas e é frequentemente usado em pesquisas clinicamente orientadas. O protocolo a seguir contém todas as informações para um modelo OLTx suíno confiável usando um shunt porto-caval-jugular ativo.

Resumo

O sucesso do transplante de fígado resultou em uma dramática escassez de órgãos. A cada ano, um número considerável de pacientes na lista de espera para transplante de fígado morre sem receber um transplante de órgão ou é excluído da lista devido à progressão da doença. Mesmo após um transplante bem-sucedido, a rejeição e os efeitos colaterais da imunossupressão continuam sendo as principais preocupações para a sobrevida do enxerto e a morbidade do paciente.

A pesquisa experimental em animais tem sido essencial para o sucesso do transplante de fígado e ainda desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da prática clínica de transplante. Em particular, o modelo de transplante de fígado ortotópico suíno (OLTx) é ideal para pesquisas clinicamente orientadas por sua grande semelhança com o tamanho, anatomia e fisiologia humanos.

A descompressão da congestão intestinal durante a fase anepática do OLTx suíno é importante para garantir a sobrevivência confiável do animal. O uso de um shunt porto-caval-jugular ativo alcança excelente descompressão intestinal. O sistema pode ser usado para experimentos de sobrevivência de curto e longo prazo. O protocolo a seguir contém todas as informações técnicas para um modelo de transplante hepático estável e reprodutível em suínos, incluindo cuidados pós-operatórios com animais.

Introdução

O transplante hepático (transplante hepático ortotópico) é a única opção de tratamento para pacientes com doença hepática em estágio final ou carcinoma hepatocelular avançado. Para os últimos 25 anos, o número de candidatos na lista de espera tem aumentado gradualmente e agora excede em muito o número de enxertos disponíveis. Na maioria das regiões de transplante, de 20 a 30% dos pacientes em lista de espera para transplante de fígado morrem sem receber um transplante de órgão ou são excluídos devido à progressão da doença. Estratégias para aumentar a lista de dadores e, assim, o número de enxertos disponíveis, são desesperadamente necessários. Critérios de alocação de órgãos estendidas, de preservação do enxerto prolongado, e de indução de tolerância imunológica ainda representam grandes desafios clínicos 1-3. Por isso, a investigação experimental transplante hepático ortotópico é fundamental, a fim de otimizar a prática clínica transplante hepático ortotópico.

Porcina transplante hepático ortotópico é um modelo experimental bem estabelecido que se assemelha o transplante hepático ortotópico humana em muitos aspectos, incluindo a Ltamanho iver, anatomia, fisiologia e 4-6. Assim, tornou-se um método experimental padrão em campos de pesquisa, tais como técnicas cirúrgicas, fisiologia, imunologia, preservação e lesão de isquemia-reperfusão. Numerosas técnicas de aquisição de enxerto, hepatectomia destinatário e, em particular, a reconstrução vascular, foram descritos na literatura 5. A escolha da técnica apropriada varia de acordo com a preferência do pesquisador e capacidade técnica.

Em contraste com a situação humana, congestão splanchnic durante a fase anepática representa um problema importante no transplante hepático ortotópico porcino. Isquemia intestinal subsequente e dano vascular congestiva pode causar instabilidade hemodinâmica grave, comprometendo a sobrevivência de porco e, assim, o sucesso da experiência 7-9. Portanto, a descompressão intestinal suficiente é obrigatória, especialmente em ambientes experimentais tecnicamente menos refinados.

Nósing um ativo shunt porto-cava-jugular para a duração da fase de anepática é uma opção confiável para evitar o congestionamento intestinal. O sistema pode ser usado para as experiências iniciais de reperfusão, bem como cenários de sobrevivência a longo prazo. O protocolo a seguir contém todas as informações para um modelo estável e reprodutível transplante de fígado em suínos, incluindo os contratos fígado do doador, operação destinatário, incluindo hepatectomia e técnicas de reconstrução navio end-to-end, e cuidados pós-operatórios.

Protocolo

Todos os animais receberam cuidados de acordo com os '' Princípios do Laboratório Animal Care '' formuladas pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e da '' Guia para o Cuidado de Animais de Laboratório '' publicado pelo National Institutes of Health, Ontario, Canada . O Comité do Instituto Geral de Toronto Research Animal Care aprovado todos os estudos.

1. Órgão Retrieval

  1. Casa do sexo masculino porcos Yorkshire entre 30 e 35 kg no centro de pesquisa para uma semana antes do transplante para evitar uma reação física induzida por estresse (que pode alterar o resultado da perfusão 10,11) e para aclimatar os animais para as condições de habitação. Jejuar o porco por um período mínimo de 6 horas antes da indução da anestesia.
  2. Anestesiar do porco dador por uma injecção intramuscular (im) injecção de uma mistura de cetamina (25 mg / kg), a atropina (0,04 mg / kg) e midazolam (0,15 mg / kg).
  3. Antes de intubação, garantir o porco respira espontaneamente 2 L de oxigênio doseado com 5% de isoflurano. Em decúbito dorsal, pulverizar as cordas vocais com lidocaína a 2% 2 min antes da intubação para evitar espasmos nas cordas vocais. Para um 35 kg porco, usar um tubo traqueal 6,5 Fr. Bloquear o tubo traqueal com 3-5 ml de ar ambiente.
  4. Após a intubação, use capnometria para confirmar a intubação correta. Monitorar a freqüência cardíaca e saturação de oxigênio por oximetria de pulso em rabo de porco. Abaixe o vaporizador isoflurano a 2%.
    1. Ajustar a profundidade de anestesia por valores de concentração alveolar mínima (MAC); apontar para 2-2,5 MAC. Definir o ventilador para 14-16 respirações / min e um volume corrente de 10 - 15 ml / kg de peso corporal.
  5. Inserir um 18 L intravenosa (iv) do cateter numa das veias da orelha para permitir a infusão de solução de Lactato de Ringer (200 ml / h). Esfregue o porco e cobri-lo com campos estéreis.
  6. Depois de garantir condições estéreis, fazer uma laparotomia mediana folloconduzido por uma extensão lateral esquerda. Use uma toalha para cobrir grandes e pequenas intestinos antes de movê-los para o lado esquerdo.
  7. Divida o ligamento falciforme eo ligamento triangular usando um cautério.
  8. Solte o fígado a partir do diafragma do lado direito usando um eletro-cautério; usar a tesoura para a parte superior, entre a veia e diafragma. Dissecar a veia infrahepatic baixo para o ramo da veia adrenal no lado direito ea veia renal do lado esquerdo.
  9. Separa-se a cava e na aorta distai infrahepatic um do outro; ligadura ramos da aorta para a coluna; isolar e artérias renais livres do tecido aderente. Cerque cada artéria renal com um empate 2-0.
  10. Craniana à veia renal esquerda, dissecção da aorta e da artéria mesentérica. Cerque a artéria mesentérica com um empate 2-0.
  11. Depois de abrir o crânio peritônio à artéria mesentérica, siga com atenção a aorta para o tronco celíaco. Dissecar o tronco celíaco caudalmente ao portal veno; rodeiam as artérias esplênica e gástrica esquerda, que posteriormente sucursal fora do tronco celíaco. Dissecar o tronco celíaco fora da veia portal.
  12. Solte a veia porta por uma incisão peritoneal entre o pâncreas ea veia portal. Tie fora veias de drenagem do pâncreas para a veia porta.
  13. Separe o ducto biliar do ligamento hepatoduodenal e dividi-lo distally após a ligadura.
  14. Ligadura dos vasos linfáticos dentro do ligamento hepatoduodenal para evitar vazamento linfático. Divida a artéria gastroduodenal e artérias gástrica direita entre laços. Ligadura veias menores.
  15. Dissecar a aorta por trás do diafragma entre o coração eo tronco celíaco. Coloque um empate 2-0 ao redor da aorta cranial para o tronco celíaco.
  16. Remover a vesícula biliar e cauterizar o sangramento do leito da vesícula biliar.
  17. Abra o diafragma. Administrar 1000 UI / kg de peso do dador de heparina intracardial ou iv Definir isoflurano a 5% (> 2,5 MAC), a fim de alcançarum nível maior do anestésico. Para um doador após a morte circulatório (DCD) modelo, induzir uma parada cardíaca por injeção intracardíaca de 40 mval KCl 3 min após a administração de heparina. Definir parada cardíaca como o ponto de partida da isquemia quente.
  18. Amarre os laços previamente definidos em todo o renal, baço, mesentérica, e artérias gástricas esquerdas. Tie fora da aorta, distalmente entre renais e artérias ilíacas e canular a aorta com uma linha de limpeza de órgãos.
  19. Tie fora da veia porta como proximal possível e canular-lo com outro órgão resplendor linha.
  20. Depois de fechar o empate pré-definido ao redor da aorta proximal, lave o fígado com 2 L de frio Universidade de solução (UW) Wisconsin usando dupla perfusão via aorta (saco de pressão) e veia porta (orientada por gravidade).
  21. Extirpar o fígado, deixando os restantes navios de comprimento. Deixe um aro diafragmática generoso ao redor da veia supra-hepática. Inserir o fígado para um saco estéril de órgãos em gelo.
  22. Durante back-mesa preparação, clamplificar a veia suprahepática usando uma braçadeira Satinsky e lave o fígado uma segunda vez com cerca de 0,5 L de solução de UW retrogradamente através da veia cava inferior até que a saída inferior da veia portal é clara.
  23. Empate fora todos os ramos arteriais da aorta e tronco celíaco. Executar uma perfusão pressão arterial back-mesa com os restantes 0,5 L de solução UW 12.
  24. Lave o ducto biliar usando solução UW.
  25. Apare o patch diafragmática para um tamanho decente. Feche todas as veias frênico - geralmente 3, 1 cada esquerda e direita, e um posterior - usando 4-0 pontos de monofilamento de polipropileno.
  26. Feche o saco e armazenar o órgão fígado em gelo.

2. Destinatário Hepatectomia

  1. Anestesiar do porco receptor através de uma injecção intramuscular de uma mistura de cetamina (25 mg / kg), a atropina (0,04 mg / kg) e midazolam (0,15 mg / kg).
  2. Coloque o porco em posição supina numa mesa cirúrgica em cima de um tapete de aquecimento. Cubra o wi-gusath um cobertor de circulação de calor.
  3. Antes de intubação, garantir o porco respira espontaneamente 2 L de oxigênio doseado com 5% de isoflurano. Pulverizar as cordas vocais com lidocaína a 2% 2 min antes da intubação para evitar espasmos nas cordas vocais. Para um 35 kg porco, usar um tubo traqueal 6,5 Fr. Bloquear o tubo traqueal com 3-5 ml de ar ambiente.
  4. Após a intubação, use capnometria para confirmar a intubação correta. Monitorar a freqüência cardíaca e saturação de oxigênio por oximetria de pulso em rabo de porco. Coloque e fixar uma sonda de temperatura no focinho do porco. Abaixe o vaporizador isoflurano a 2% (o objectivo para 2-2,5 MAC). Definir o ventilador para 14-16 respirações / min e um volume corrente de 10 - 15 ml / kg de peso corporal.
  5. Use pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
  6. Utilize uma técnica de Seldinger 13 para inserir um indutor bainha (8,5 Fr) na veia jugular externa esquerda. Utilize este cateter mais tarde para uma derivação portal-cava-jugular ativa.
  7. Use Seldinger technique inserir uma nutrição parentérica (NPT) cateter total (9,5 Fr) na veia jugular externa direita.
  8. Sob condições estéreis, dissecção da artéria carótida direita e inserir um cateter de polipropileno (18 L) para monitorização da pressão arterial invasivo. Cerque a artéria com um empate 2-0 seda para permitir a ligação de emergência.
  9. Desligar o vaporizador isoflurano a 1% (1,5-2 MAC) e adicionar o propofol (5-8 mg / kg / h IV) para manter a profundidade da anestesia. Para analgesia, utilização em infusão contínua iv de citrato de fentanil (mais preferido, 2 ug / kg / h) ou de remifentanil (segunda escolha, 15 ug / kg / h).
  10. Antes de incisão na pele, dar 1,000 mg de cefuroxima e 500 mg de metronidazol iv. Configurar uma bomba de infusão usando Lactato de Ringer com glicose a 5% em 150 ml / hr.
  11. Coloque o cobertor de circulação de calor para a área da cabeça e pescoço. Esfregue o porco e cobri-lo com campos estéreis.
  12. Sob condições estéreis, fazer uma laparotomia mediana. Insira um r abdominaletractor para ter acesso suficiente para o quadrante superior direito.
  13. Divida o ligamento falciforme eo ligamento triangular com bisturi.
  14. Em várias etapas, dividir o ligamento hepatoduodenal perto do fígado entre laços. Identificar, dividir, e marcar os ramos da artéria e ducto biliar hepática.
  15. Dissecar a artéria hepática retrógrado até à divisão da artéria gastroduodenal. Certifique-se que uma braçadeira bulldog se encaixa em torno do comum proximal da artéria hepática com a artéria gastroduodenal para mais tarde aperto.
  16. Liberte a veia portal a partir de tecido aderente.
  17. Mobilizar a veia cava do retroperitônio no lado direito usando um eletro-cautério. Use a tesoura para a parte superior, entre a veia e diafragma. Dissecar a veia infrahepatic baixo para o ramo da veia adrenal no lado direito ea veia renal do lado esquerdo.
  18. Exponha o hilo do baço. Aproximadamente a meio caminho ao longo do comprimento do baço, cuidadosamente clara def a artéria e veia esplênicas de camadas peritoneal aderiram. Cerque tanto artéria e veia esplênicas com 4 2-0 gravatas de seda.
  19. Insira um 8,5 Fr indutor bainha com dois furos adicionais na ponta do cateter na veia esplênica, apontando para distal para a veia portal. Fixe o cateter distal à sua inserção com uma das 2-0 laços e fechar a veia próxima à inserção com outro 2-0 empate. Deixe os outros dois vínculos aberto.
  20. Extrair sangue do cateter, lavá-la com 10 ml de solução salina, e fechar a braçadeira do cateter.
  21. Encha salina num desvio constituído por uma cabeça da bomba centrífuga, um tubo jugular (3/16 "), e uma entrada de ambos ramo portal (3/16") e um ramo da veia cava (1/4 ", um conector Luer Lock em proximal abertura). Coloque um grampo tubagem sobre a extremidade proximal do tubo de cava.
  22. Ligue o portal e a abertura do canal de derivação jugular para ambos os cateteres bainha (Figura 1) e selar o connecção com um anel braçadeira metálica. Coloque a cabeça da bomba centrífuga para a sua posição da bomba.
  23. Dê 1.000 mg de ácido tranexâmico e 10.000 UI de heparina 3 min iv antes de pinçamento. Reduzir a taxa de perfusão de propofol a 2 mg / kg / h durante o tempo da fase de anepática. Ajuste a concentração de isoflurano para a pressão arterial ea reatividade do porco.
  24. Abra os grampos de ambos os cateteres bainha do introdutor e de pinçamento da veia portal. Certifique-se de que o sangue está correndo através do desvio passivamente.
  25. Inicie a bomba centrífuga a cerca de 1.500 rounds / min. Continue pinçamento se a) o porco é cardiovascularly estável e b) o desvio está sendo executado em cerca de 500 ml / min. Se o porco não tolera o pinçamento, o volume substituto (cristalóides ou colóides) e agentes inotrópicos (norepinefrina no pequeno bolo).
  26. Cruz braçadeira veia cava infrahepatic apenas craniano para as veias renais, usando uma braçadeira De Bakey-Beck. Aplique uma pressão firme sobre as tiss fígadoue para espremer uma porção do sangue remanescente. Cross-braçadeira veia cava supra-hepática incluindo um aro diafragmática utilizando uma braçadeira Satinsky enquanto retraindo o fígado caudalmente.
  27. Corte a veia cava suprahepática diretamente na sua fronteira com o tecido do fígado. Em seguida, corte a veia portal perto do hilo hepático.
  28. Aproximadamente 4 cm cranial do grampo infrahepatic cava, cortado um furo na parede anterior da veia cava. Dentro deste buraco, posicione o conector da abertura de bypass da veia cava 'com o bloqueio Luer enfrentando anteriormente.
  29. Prenda o conector na veia infrahepatic com 1-0 gravatas de seda. Em seguida, abra a braçadeira de tubulação do ramo da veia cava do bypass.
  30. Finalmente, abrir o grampo infrahepatic cava para permitir um desvio cava-jugular, para além do desvio-jugular existente. Aumentar a velocidade da bomba de cerca de 2500 voltas / min de modo a que a saída de desvio no lado da jugular é entre 900 - 1100 ml / min.
  31. Extirpar o fígado no seu c remanescenteONEXÃO cranial ao conector de desvio infrahepatic, garantindo que os laços que prendem a ligação de desvio não são cortadas. Posicione o desvio de tubagem com cuidado para evitar vincada. Dar 500 mg de metilprednisolona para inicializar imunossupressão.

Reconstrução 3. Vessel

  1. Usando 4-0 polipropileno monofilamento, feche todos os 3 óstios das veias frênico do lado do destinatário na abertura da cava supra-hepática. Costure suturas duplas-armado polipropileno monofilamento 4-0 de dentro para fora em ambos os cantos da veia supra-hepática no lado do destinatário.
  2. Retire o saco de órgãos de doadores da caixa de gelo. Abrir o saco de órgãos, remover o fígado doador, e colocá-lo dentro da cavidade abdominal.
  3. Para uma anastomose fim-de-final da veia supra-hepática, aparar o doador da veia cava supra-hepática para caber lado do destinatário. Usando as agulhas para dentro dos pontos de canto do lado receptor, fazer um ponto de canto interior-fora em cada um dos lados do suprahcava doador epatic.
  4. Tiro ambas as extremidades da sutura juntos direita. Aproximar ambos os óstios de receptor e doador cava, em seguida, amarre as duas finais da sutura esquerda.
  5. Tiro o final mais curto e fazer um ponto fora-dentro da cava destinatário volta parede ao lado do empate. Correr sobre a parede de trás, idealmente eversão das paredes da veia cava.
  6. Adicionar 2-3 pontos da parede frontal com a mesma sutura uma vez que o lado direito foi alcançado, em seguida, atirou esse final de sutura. Correr sobre a parede frontal usando a sutura restante do canto esquerdo. Unir ambas as suturas utilizadas para as costas e paredes frontais. Amarre os outros dois finais de sutura no canto direito.
  7. Após o corte da veia portal de dador para um comprimento adequado, a anastomose veia porta extremidade-a-extremidade do mesmo modo, utilizando suturas 6-0 de monofilamento de polipropileno. Pouco antes de terminar com a parede frontal, entubar o lúmen da veia infrahepatic com outra linha de limpeza e lavar a solução UW com 1 L de solução salinaà TA através da veia cavaportal infrahepatic.
  8. Complete a anastomose e amarre as suturas, deixando aproximadamente 0,5 cm de fator de crescimento. Dito de outra De Bakey- Beck são fixados na parte cava doador infrahepatic.
  9. Abra a braçadeira cava supra-hepática e verificar se há sangramento. Em seguida, reperfundir o fígado através da abertura do grampo de portal.
  10. Utilize suturas de polipropileno monofilamento 6-0 para pontos hemostáticos. Diminuir a velocidade da bomba manual para cerca de 1.500 rounds / min e feche a braçadeira do introdutor de cateter portal bainha.
  11. Reclamp lado o destinatário da veia cava infrahepatic e colocar uma braçadeira de tubulação por parte cava do bypass. Parar a bomba centrífuga.
  12. Cortar os laços do conector cava e removê-lo. Devolver o sangue restante do manual para o porco através do cateter jugular.
  13. Feche a braçadeira do cateter jugular e desconecte o desvio. Dar 100 mg de sulfato de protamina para antagonizar a heparina. Tome especial cuidado do pihemodinâmica do g durante estes passos; usar catecolaminas para suporte de pressão e bicarbonato de sódio substituto para a acidose metabólica.
  14. Executar uma anastomose extremidade-a-extremidade da veia infrahepatic novamente do modo descrito acima, utilizando 5-0 suturas de monofilamento de polipropileno. Reperfundir a cava inferior infrahepatic liberando ambas as braçadeiras.
  15. Apare um remendo da aorta ao redor do tronco celíaco do doador. Tie fora da artéria gastroduodenal destinatário junto à artéria hepática comum. Coloque um grampo de bulldog para a artéria hepática comum proximal à junção da artéria gastroduodenal. Cortar um pequeno pedaço arterial com uma tesoura Potts, usando o tecido vascular em torno da junção.
  16. Lave a artéria hepática doador com 10 ml de solução salina heparinizada e colocar outro bulldog apertar ainda mais distalmente para evitar voltar a sangrar. Anastomosar o fim-de-final óstios arterial em uma técnica de pára-quedas em execução, usando um fio de polipropileno monofilamento 6-0. Reperfundir pela primeira opeNing distal e, em seguida, os grampos de buldogue proximais.
  17. Anastomose extremidade a extremidade-para-dois do ducto biliar com 6-0 suturas de monofilamento de polipropileno, utilizando a técnica de execução acima descrito. Certifique-se que grandes porções de tecido peribiliary estão incluídas porque o ducto biliar suíno é muito frágil e rasga facilmente.
  18. Depois de verificar para hemostasia, remover o cateter introdutor da veia esplênica. Feche as extremidades proximais e distais com os restantes 2 empates.
  19. Feche a parede abdominal com uma sutura absorvível monofilamentos tamanho 1. Feche a pele ou com um grampeador pele ou qualquer executando 2-0 sutura.

Fase 4. Pós-operatório

  1. Use a almofada de aquecimento e cobertor de circulação de calor para aquecer o porco.
  2. Gases sanguíneos de exemplo a cada hora. Ajustar a desidratação através do aumento da taxa de infusão.
  3. Desmamar a anestesia. Ventilar o porco por mais 2 horas.
  4. Remover o introdutor de cateter da jugular esquerda ve. Pressione firmemente por alguns minutos para evitar sangramento.
  5. Túnel do cateter por via subcutânea TPN para o lado do pescoço do porco. Prenda-o com 2-0 suturas.
  6. Remova a linha arterial após 2 horas se o porco é estável hemodinamicamente, sem apoio de catecolaminas. Certifique-se de que o lado da punção não está sangrando. Caso contrário, fazer um 6-0 bolsa-corda ponto em torno do buraco arterial sem fechar a artéria. Feche o local da incisão.
  7. Parar a ventilação assim que o porco é capaz de respirar de forma independente. Desconecte o tubo de ventilação do tubo traqueal. Repetidamente verificar se o porco está respirando suficientemente.
  8. Coloque o porco em uma posição propensa em um único curral provido de uma lâmpada de aquecimento. Extubação uma vez que o porco é capaz de manter-se a cabeça de forma independente. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Casa do porco separadamente para todo o período pós-operatório.
  9. Forneceriv medicação para a dor suficiente no pós-operatório (por exemplo, buprenorfina 0,01-0,05 mg / kg a cada 6 horas).
  10. Se o porco não bebe de forma independente, substituir o suficiente iv de volume
  11. Continue metilprednisolona como imunossupressão (dia 250 mg de pós-operatório (POD) uma manhã e, em seguida, 125 mg diariamente). Iniciar a cefalosporina de 2 mg / kg PO duas vezes por dia a partir POD2 diante.
  12. Administrar 500 mg de metronidazole e 1000 mg duas vezes por dia de cefazolina, bem como 20 mg de pantoprazole de uma vez por dia até Pod3.
  13. Monitorar o porco de perto. Não hesite em sacrificar-lo se ele mostra sinais de sofrimento (por exemplo, letargia, refusion para beber, acidose persistente ou hipoglicemia, ou sinais de hemorragia ou peritonite). Por eutanásia, desangrar o porco sob anestesia profunda isoflurano (5%,> 2,5 MAC) cortando a veia supra-hepática.

Resultados

Em um primeiro estudo de transplante, um modelo de dador bater-coração (HBD, n = 5) foi comparado com um modelo TDC (n = 10) expostas a 45 min de isquemia quente in situ. Em ambos os grupos, os enxertos foram preservados em gelo durante 10 horas após a aquisição.

No grupo HBD, 100% dos porcos receptores sobreviveu até ao fim do acompanhamento no dia 5 após o transplante. No grupo DCD, apenas 50% dos receptores sobreviveu porcos durante 5 dias, devido a problemas de coagulação ou descompensação metabólica, como resultado da diminuição da função do fígado pós-operatório.

Todas as amostras de sangue foram coletadas a partir do cateter venoso central. Após centrifugação, as amostras de soro foram obtidas e analisadas para a lesão hepatocelular (aspartato aminotransferase, AST), a função biliar (bilirrubina e fosfatase alcalina total), e função hepática (INR). O curso de tempo de cada marcador é mostrado nas Figuras 2-5.


Figura 1. Esquema do shunt porto-cava-jugular. O bypass é preenchido com solução de Ringer com lactato. Em seguida, a parte da veia cava é presa com uma pinça tubulação, as partes jugulares e esplênicos estão ligados aos cateteres pré-estabelecidos, o desvio é aberto, e da bomba centrífuga é iniciado após o pinçamento da veia porta. Após a ressecção do fígado, a parte da veia cava do bypass é inserido e fixado na infrahepatic coto da veia cava, cranial para as veias renais. A braçadeira de tubo é libertado para permitir a descompressão da veia cava, para além da descompressão porta.

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Figura 2. aspartato aminotransferase (AST) (HBD n = 5, n = 10 DCD). AST é um marcador sensível da lesão hepatocelular. A ré picoer 24 horas é inferior no HBD do que no grupo DCD, sugerindo lesão de reperfusão menos hepática; o menor desvio padrão mostra resultados mais homogêneos no grupo HBD.

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Figura 3. A bilirrubina total (HBD n = 5, n = 10 DCD). A bilirrubina total, como um marcador de depuração biliar e integridade do ducto biliar, mostra uma tendência estável e homogénea com valores inferiores a 10 mmol / L no grupo de HBD. A curva de bilirrubina no grupo DCD aumenta gradualmente ao longo do tempo e mostra um desvio-padrão elevado, sugerindo lesão biliar em apenas uma porção do grupo experimental.

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Figura 4. A fosfatase alcalina (HBD n = 5, n = 10 DCD). A fosfatase alcalina ié um indicador de lesão biliar. Os valores para o grupo de HBD são mais baixas do que a do grupo DCD, o que implica menos lesão biliar.

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Figura 5. INR (HBD n = 5, DCD n = 10). Um valor alto indica INR função hepatocelular diminuída devido à diminuição da liberação de fatores de coagulação. Em ambos os grupos HBD e DCD, os valores de INR regresso aos valores normais de 5 dias após o transplante, sugerindo que a recuperação da função do fígado. Os valores para o grupo de HBD aparecem inferior.

Discussão

Experimental suína transplante hepático ortotópico é um procedimento desafiador para um ambiente de pesquisa, sem os recursos de terapia intensiva de um cenário clínico. Complicações possíveis incluem instabilidade hemodinâmica, hemorragia, isquemia de órgãos, hipotermia, e metabólica, bem como respiratória, descompensação. Para qualquer grupo de pesquisa, formação processual suficiente da técnica cirúrgica 5, bem como a anestesia 14,15 porco é obrigatória a fim de alcançar resultados representativos e reprodutíveis.

Muitos subtilezas técnicas têm sido descritos na literatura, especialmente em relação à fase de reconstrução vascular 5. O protocolo de transplante hepático ortotópico descrito acima fornece as informações necessárias para um modelo de substituição de cava que assemelha-se o transplante hepático ortotópico humano. Os resultados fornecidos demonstrar sobrevivência do animal confiável e recuperação do enxerto em ambos os modelos HBD e DCD. O protocolo é aplicável em cenários de sobrevivência de curto prazo utilizados na reperfusão do enxerto experiments, por exemplo, bem como em modelos de sobrevivência a longo prazo, tais como estudos de tolerância.

Um grande obstáculo de suíno transplante hepático ortotópico é relativamente pobre tolerância de cava e da veia portal pinçamento. Congestão esplâncnica durante a fase anepática provoca hipertensão venosa capilar e danos que podem levar à isquemia intestinal major e instabilidade hemodinâmica, a ponto de um choque irreversível mesmo após reperfusão de órgãos 7. Desde a veia cava é completamente imersos em parênquima hepático, um procedimento piggy-back-preservando cava não é viável. A oclusão total da veia cava, durante a fase de reconstrução cava prejudica a estabilidade hemodinâmica do porco. Embora alguns relatos mostram que o transplante hepático ortotópico suína pode ser realizado durante a cava e da veia portal oclusão total de menos de 25 min 16,17, uma técnica de bypass porto-cava-jugular para o tempo de reconstrução vascular é a opção mais segura e mais prática 7- 9,18. Em thexperiência e dos autores, uma derivação porto-jugular passivo não é o ideal para manter o hemodinamicamente estável porco durante a fase anepática. O modelo de bypass, incluindo descompressão ativa de ambos cava infrahepatic e veia portal, permite uma fase de reconstrução calma das anastomoses cava e portal supra-hepáticas, mesmo com tempo de pinçamento prolongado devido a complicações imprevistas. Ao contrário do que relatórios anteriores 7, uma esplenectomia não é obrigatória quando o cateter de derivação portal é removido. Ambos artéria e veia esplênicas estão fechados sobre a meio caminho ao longo do comprimento do baço deixando a metade proximal suficientemente perfusão. Complicações como hemorragia ou embolia devido a desvio de desconexão são evitáveis, garantindo que o desvio é colocada com cuidado e protegido adequadamente.

Em sobrevivência a longo prazo transplante hepático ortotópico experimentos, a anastomose do ducto biliar é considerado um ponto fraco, devido à sua alta taxa de complicações 19. O tecido biliar é muito frágil e needs cuidado especial quando está sendo manipulado. Muitas técnicas de anastomose diferentes têm sido descritas 5,19. Uma anastomose end-to-end é tecnicamente fácil e associado com o mínimo de complicações 19. Uma sutura contínua com uma agulha de não corte, incluindo grandes secções do tecido conjuntivo peribiliary parece ser superior a um sutura interrompida. O ducto biliar é colocado sob tensão desnecessária quando os pontos únicos de sutura interrompida estão atadas. Isso pode resultar em lágrimas de tecidos e vazamentos biliares consecutivos. O material de sutura - absorvível ou não absorvível - geralmente não é importante, dada a sua duração limitada até que o porco é encerrado. Para os modelos de sobrevivência a longo prazo ao longo de vários meses, suturas absorvíveis - como no transplante hepático ortotópico humano - são preferíveis.

Cuidados específicos devem ser tomados com o pós-operatório follow-up. Alimentação suficiente e de fornecimento de fluido, um protocolo de alívio da dor de confiança, e uma imunossupressão adequadaregime são obrigatórios. Para as experiências de longo prazo, a imunossupressão parece particularmente importante. Em comparação com outros mamíferos, os porcos mostram uma surpreendentemente baixa taxa de rejeição imunológica após o transplante hepático ortotópico 20,21. Infiltrações de células redondas são máxima durante a segunda semana após o transplante e diminuir espontaneamente, mesmo sem imunossupressão. Rejeição é raramente a causa da morte após o transplante hepático ortotópico suíno 22. No entanto, mesmo com o protocolo de imunossupressão, envolvendo a administração de esteróides IV e inibidores da calcineurina po mencionado aqui, a rejeição do enxerto é indicado por um ligeiro aumento de transaminases a partir de cerca de 4 dias após o transplante hepático ortotópico e confirmada por aparente campo portal de infiltração de células redondas. Inibidores da calcineurina pode ser dada, quer po 23,24 ou iv 25,26; Ambos os métodos têm desvantagens. Mesmo com ajudas aplicação oral, a quantidade real de atingir o trato gastro-intestinal permanece indefinida. Por outro lado, a infusão intravenosa contínua, emcaneta de um porco com um animal ativo é difícil. Assim, a aplicação iv deve ser realizada como um bolus, o que resulta em picos de concentração de droga elevada, juntamente com os potenciais efeitos tóxicos. No entanto, ambos os métodos de aplicação parece permitir a sobrevivência a longo prazo.

Semelhante a um ambiente clínico, recomenda a profilaxia pós-operatório úlcera de estresse. Sangramento pós-operatório de úlceras pépticas é um problema freqüente e pode estar relacionada com uma disfunção hepática 27. Depois de alguns casos de hemorragia digestiva em ambos os grupos transplante hepático ortotópico, os autores começaram a profilaxia regular com pantoprazol e não experimentar qualquer hemorragia gastrointestinal desde então.

Manutenção rigorosa de condições estéreis no intra-operatório, comparáveis ​​com as condições de uma sala de cirurgia, clínica e consequentes profilaxia antibiótica, diminui o risco de complicações infecciosas.

Em conclusão, este artigo pferece informações práticas para o estabelecimento de um programa de transplante hepático ortotópico suína em um ambiente de pesquisa. Dedicação suficiente, prática, e trabalho de equipa é importante, a fim de diminuir o período de aprendizagem, para produzir resultados fiáveis, e para reduzir os custos e o número de animais de pesquisa.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O estudo foi apoiado por bolsas de pesquisa da Roche Organ Transplant Research Foundation (ROTRF) e da Astellas. Markus Selzner foi apoiado por um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira ASTS. Matthias Knaak foi apoiado pela Bolsa de Pesquisa Astellas. Agradecemos a Uwe Mummenhoff e à família Birmingham por seu generoso apoio.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sulfato de atropina 15 mg/30mlRafter 8 Produtos238481
Buprenorfina 0,3 mg/mlRB Pharmaceuticals LDTN/A
Cefazolina 1 gPharmaceutical Partners of Canada Inc.
Solução Oral de Ciclosporina 5.000 mg/50 mlNovartis Pharmaceuticals Canada Inc.
Citrato de Fentanil 0,25 mg/5 mlSandoz Canada Inc.
Heparina 10.000 UI / 10 mlLeo Pharma A / S453811
Isoflurano 99,9%, 250 mlPharmaceutical Partners of Canada Inc.
Cloridrato de Cetamina 5000 mg/50 mlBimeda-MTC Animal Health Inc.
Ringer com lactato' s + 5% Dextrose, 0,5 LBaxter Corporation61131
Lacteted Ringer' s, 1 LBaxter Corporation61085
Metronidazol 500 mg/100 mlBaxter Corporation870420
Midazolam 50 mg/10 mlParceiros Farmacêuticos do Canadá Inc.
Pantoprazol 40 mgSandoz Canada Inc.
Cloreto de potássio 40 mEq/20 mlHospira Healthcare Corporation37869
Propofol 1.000 mg/100 mlPharmascience Inc.
Sulfato de Protamina 50 mg/5 mlParceiros Farmacêuticos do Canadá Inc.
Solução salina 0,9%, 1 LBaxter Corporation60208
Bicarbonato de sódio 50 mEq/50 mlHospira Healthcare Corporation261998
Solu-Medrol 500 mgPfizer Canada Inc.
Ácido Tranexâmico 1.000 mg / 10 mlPfizer Canada Inc.
Solução da Universidade de Wisconsin, SPS-1 Sistemas de Recuperação de Órgãos SPS-1
Xilocaína Endotraqueal 10 mg/50 mlAstraZeneca2003767
Appose ULC 35 W grampeador de peleCovidien Canadá803712
Maxon, 1Covidien Canadá606173
Sofsilk, 0Covidien CanadáS606
Sofsilk, 2-0Covidien CanadáS405
Sofsilk, 3-0Covidien CanadáS404
Surgipro II, 4-0Covidien CanadáVP581X
Surgipro II, 5-0Covidien CanadáVP725X
Surgipro II, 6-0Covidien CanadáVP733X
Cateter i.v, 18 GBD Canadá381147
Cateter TPN Cook, 9.5 FrCook Medical CompanyC-TPNS-9.5-90
PSI Kit para cateter de bainha, 8.5 FrArrow InternationalASK-09803-UHN
Smith Medical ASD Inc.21-0442-25
Conjunto de administração de fígado (linha de descarga)CardioMed Supplies Inc17175
Mallinckrodt, tubo traqueal, 6,5 mmCovidien Canada86449
Tubo de conexão de sucção Med-RxBenlan Inc.70-8120
Bolsa de ÓrgãosCardioMed Supplies Inc2990
Ponta de SucçãoTyco Healthcare Group LP8888501023
Valleylab, Lápis de CauterizaçãoCovidien CanadaE2515H
Valleylab, Eletrodo de Retorno do Paciente Conectorde Bypass Covidien CanadaE7507
3/8" x 1/4"Raumedic AG955083-001
Conector de Bypass 3/8" x 3/8" Luer LockRaumedic AG955163-001
Conector de Bypass Y 3/8" x 3/8" x 1/4"Raumedic AG961360-002
Tubo de Bypass 1/4" x 1/16"Raumedic AG039505-010
Tubo de Bypass 3/8" x 3/32"Raumedic AG039535-005
Bomba Centrífuga RotaflowMaquet-DynamedHC 2821
Anel de Fixação de Mangueira de Aço Inoxidável, 5mmOetiker16700007
Afastador AbdominalMedite GmbHN/A
De Bakey – Beck, braçadeira de cava infra-hepáticaAesculap Inc.FB519R
Deithrich, braçadeira atraumática (veia portal)Aesculap Inc.FB525R
Gregory Bulldog Clamp, curvadoAesculap Inc.FB382R
Gregory Bulldog Clamp, retoAesculap Inc.FB381R
Potts - De Martel, TesouraAesculap Inc.BC648R
Satinsky, braçadeira de cava supra-hepáticaAesculap Inc.FB605R
Codman Instruments198010
Máquina de anestesia, OptimaxModuflex Anesthesia EquipmentSN5180
Medidor de vazão de desvio, HT 110Transonic Systems Inc.
Sonda do medidor de vazão, H6XLTransonic Systems Inc.H6Xl689
Bomba de Terapia de Calor, T / BombaGaymar Industries IncTP500-G89D19
Bomba de Infusão 3.000SIMS Graseby LTD.
Vapor de Isoflurano 19.1Draeger Medical Canada Inc.N / A
Monitor, Datex AS 3Instrumentarium Corp. / HitachiD-VHC14-23-02
Unidade de acionamento centrífugoRotaflow Maquet-Dynamed952301
Rotaflow ConsoleMaquet-Dynamed706035
Almofada de terapia de temperaturaGaymar Industries IncTP26E
Valleylab Force TxValleylab Inc.Ventilador 216151480
, AV 800DRE Medical Equipment40800AVV
Warm Touch, Sistema de Aquecimento do PacienteNellcor/ Covidien Canadá5015300A
2237138215069722404342231929612316224290523067272244379213953723679632064413 Linha de bomba de infusão Braçadeira de tubulação simétrica HT110B11106SN300050447

Referências

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