Aplicação de nanopartículas fluorescentes para estudar Reformas do Sistema Endo-lysosomal por bactérias intracelulares

Nanopartículas fluorescentes (PN), incluindo NPs metálicas, pontos quânticos, o NPS de polímero, o NPS de sílica, pontos de carbono, etc., têm atraído uma atenção considerável nas últimas décadas ^1,2. Em comparação com os corantes orgânicos tradicionais, NPs fluorescentes mostram químicas, propriedades ópticas e mecânicas desejáveis, tais como a potência do sinal forte, a resistência à fotodegradação e elevada biocompatibilidade ^3,4. Essas vantagens tornam o método de escolha para a detecção intracelular e imagens de células vivas. Além disso, uma variedade de NPs elétron-densas são visíveis por microscopia eletrônica (ME), facilitando a sua utilização para análise microscópica correlacionada, que permite combinação de células vivas de rastreamento com microscopia de luz (ML) e maior resolução em nível ultra-estrutural com EM ^5. Por exemplo, NPs de ouro têm sido desde há muito tempo utilizado de forma eficiente em células como biossensores para o diagnóstico sensível vivo, bem como no domínio da ^{imuno-6 de} rotulagem. S recentestudies indicam que nanopartículas de ouro com diferentes tamanhos e formas podem ser facilmente captação por uma grande variedade de linhas de células e transporte de rotina, através da via endossomal, por conseguinte, ter grande potencial de ser aplicada para o transporte intracelular de seguimento da vesícula e do sistema de rotulagem de ^endo-7,8 lisossomal .

Os agentes patogénicos microbianos, tais como Salmonella enterica, Shigella flexneri e histeria monocytogenes, têm desenvolvido diversos mecanismos para invadir as células hospedeiras não fagocíticas ^9. Depois de ser internalizado, os agentes patogénicos, quer localizadas no citosol ou sequestrados nos compartimentos ligados à membrana, interage bastante com os seus ambientes de hospedeiro e modulam estes favorecem a sua própria sobrevivência ^10. Por exemplo, Salmonella enterica reside e replica dentro de um compartimento phagosomal intracelular denominada -contendo vacúolo Salmonella (SCV) por infecção ^11. O SCV amadurecimentotrafega em direção ao aparelho de Golgi, passando por interações contínuas com a via endocítica, e induz a formação de estruturas tubulares extensas, tais como Salmonella filamentos induzidas (SIF), seleção túbulos nexin, Salmonella transportadora secretora induzida por proteínas de membrana (3) SCAMP3 túbulos, etc . ^12-14. Estudar como estas bactérias patogênicas manipular vias de células do hospedeiro é essencial para a compreensão de doenças infecciosas.

Aqui, NPs de ouro-BSA-rodamina foram utilizados como marcadores de fluido para rotular o sistema celular hospedeiro endo-lisossomal, e o agente patogénico humano gastrointestinal Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) foi utilizado como um modelo de bactéria para estudar as interacções entre o agente patogénico com o hospedar via endocítica. NPs de ouro-BSA-rodamina intracelulares em células não infectadas e células infectadas com WT ou estirpes mutantes de Salmonella foram fotografadas por um microscópio de varrimento a laser confocal (CLSM).Então Imaris software foi utilizado para quantificar a distribuição de NPs, indicando que a infecção por Salmonella induzida extremo rearranjo dos endossomas / lisossomas. Seguindo a descrição do presente método, as experiências análogas pode ser concebido para controlar destino a longo prazo das NPs internalizadas e para investigar a influência de várias substâncias exógenas ou factores endógenos na via endocítica de células eucarióticas.

1. Síntese de 10 nm Nanopartículas de Ouro (Gold PN) ¹⁵

1. Preparar a solução A: adicionar 2 ml 1% de cloreto de ouro aquosa para 160 ml Milli-Q, ou bidestilada, água.
2. Preparar a solução B: adicionar 8 mL de 1% de tri-citrato de sódio x 2 _H2O e ácido tânico 160 ul de 1% em 32 ml de Milli-Q, ou duas vezes destilada, água.
3. Aquecer a solução A e B a 60 ° C e misturá-los com agitação. Observe a cor azul escuro imediatamente. Observe cor vermelha depois de cerca de 15 min. Em seguida, aquece-se a 95 ° C, mantém-5 min e arrefecer a solução para a TA.
4. Adicionar uma gota de suspensão de NP para uma grelha revestida de carbono e deixa-se secar ao ar. Verifique o tamanho e morfologia de NPs por microscopia eletrônica de transmissão.

2. Revestimento de Ouro NPs com BSA e Marcando com Rhodamine N-hidroxisuccinimidilo Ester (NHS) ¹⁶

1. Adicionar 900 ul NPs de ouro para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml, de centrifugação a 15.000 xg durante 30 min. Opnalmente, preparar vários tubos podem ao mesmo tempo.
2. Rejeitar o sobrenadante, re-suspender o sedimento em 900 ul esterilizadas água Milli-Q e adicionar 100 ul de 2 mg / ml de BSA / PBS, mistura-se num Vortex a 800 rpm durante 30 min.
3. Para remover o excesso de BSA, centrifugar a preparação a 15.000 xg durante 60 min.
4. Desprezar o sobrenadante e re-suspender as NPs de ouro-BSA em 125 mL PBS, adicionar 12,5 mL de 1 M de bicarbonato.
5. Imediatamente antes da utilização, preparar uma solução 10 mg / ml de rodamina NHS / DMSO, adicionar 30 ul de solução de rodamina / NHS DMSO a 1 ml da suspensão de ouro-BSA PN. Incubar a reacção durante 2 horas (ou O / N) à temperatura ambiente durante 800 rpm, mistura, evitando a exposição à luz.
6. Purificar as NPs de ouro BSA-rodamina através de diálise contra PBS a 4 ºC com 5 alterações no buffer durante o período de 36 - 48 h.
7. Para estabilizar NPs, adicionar 10 ul de 200 mg / ml de BSA / PBS em cada 1 ml de NPs de ouro-BSA-rodamina. Para remover a centrífuga livre ou liberado BSA-rodamina, aos 15,000 xg durante 60 min. Ressuspender o sedimento em 2 mg / ml de BSA / PBS, medir a OD _520, e armazenar a 4 ° C, evitando a exposição à luz.
8. Diluir os PN 10 vezes com Milli-Q ou água bidestilada, adicionar uma gota sobre uma grelha revestida de carbono, e deixar secar ao ar. Verifique o tamanho e morfologia de NPs por microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
   Nota: Todos os materiais utilizados para a preparação de NP foram esterilizadas e a operação foi conduzida em uma capa de cultura celular ou em um banco ao lado de uma chama.

3. Cultura de células HeLa

1. Células HeLa que expressam permanentemente LAMP1-GFP são cultivadas em DMEM com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e cultivadas a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO _2.
2. Semear as células a uma densidade de 50.000 por cavidade em uma lâmina de câmara de 8 poços (Ibidi) e incubar S / N.

4. Cultura de Bactérias

1. Use Salmonella enterica sorotipo Typhimurium NCTC 12023 wild-type (WT) tensão. Para efeito de comparação, use cepas mutantes Δ ssaV defeituosos no SPI2-T3SS e Δ sifa falta efetoras chave sifa para SIF. Use cepas abrigando plasmídeo pFPV25.1 de expressão constitutiva de GFP reforçada.
   NOTA: As estirpes bacterianas são rotineiramente cultivadas em caldo de Luria-Bertani (LB) com adição de 50 ug / ml de carbenicilina (WT) e LB com adição de 50 ug / ml de carbenicilina e / ou 50 ug / ml de canamicina (Δ ssaV, Δ sifa ) do necessário para manter os plasmídeos.
2. Inocular uma única colônia de bactérias em 3 ml de LB com antibióticos apropriados e crescer O / N a 37 ºC em condições que agitam para aeração, então diluir 1:31 em fresco LB e continuar o crescimento para 3,5 horas. Neste ponto de tempo, as culturas atingem a fase de log tardia e bactérias são altamente invasivo. A 'drum rolo' é conveniente para incubar culturas tubo de ensaio com arejamento.

5. A infecção das células HeLa pelaSalmonella e Gold-BSA-Rodamina NPs Pulso perseguição de rotulagem (ver Figura 1 para o esquema)

1. Medida _OD600 das bactérias sub-cultivada e dilui-se a OD ₆₀₀ = 0,2 em 1 ml de PBS (~ 3 x 10 ⁸ ufc / mL), adicionar quantidades apropriadas de bactérias às células HeLa em lâminas de câmaras de 8 poços para atingir uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100.
2. Incubar durante 30 minutos na incubadora de células, lava-se 3 vezes com PBS para remover as bactérias não-internalizadas (este ponto de tempo foi definido como 0 horas após a infecção, ou 0 h pi). Adicionar 300 ul de meio de cultura fresco contendo 100 ug / ml de gentamicina e manter durante 1 hr. Em seguida substituir o meio com meio fresco contendo 10 ug / ml de gentamicina durante o resto do tempo de incubação.
3. Depois de incubação com meio de cultura contendo 100 ug / ml de gentamicina, durante 1 hora, o meio é substituído por meio de imagiologia (Eagles MEM sem FCS, L-glutamina, bicarbonato de vermelho de fenol e de sódio, com HEPES 30 mM, pH 7,4) containing 10 ug / ml de gentamicina. NPs de ouro-BSA-rodamina são adicionadas a células HeLa para obter uma concentração final de OD ₅₂₀ = 0,1.
   NOTA: NPs de ouro-BSA-rodamina também podem ser adicionados a células antes da infecção, ou em vários pontos de tempo pi
4. Após 1 hora de incubação, remover o meio, lavar 3 vezes com PBS, e adicionar 300 ul de meio fresco contendo imagiologia FCS a 10% e 10 ug / ml de gentamicina durante o resto do tempo de incubação.
   NOTA: A duração da incubação pode variar em função da concentração de PN e linhas celulares utilizadas. Para RAW264.7 de macrófagos, observou-se que 30 minutos de incubação com PN a uma concentração de OD ₅₂₀ = 0,05 permitido interiorização suficiente.

6. Criação de Imagens

1. Usar um sistema de imagiologia confocal, como um laser de varredura confocal (CLSM) ou de disco rotativo (SD) microscópio com uma câmara de ambiente humidificado para imagem de alta resolução a diferentes pontos de tempo.
2. Ligue a temperatura control sistema e esperar até que ele é estável. Otimizar as configurações de imagem, como a ampliação, velocidade de digitalização, a resolução, Z-stack etc. Use as configurações de excitação / emissão adequadas para GFP e NPs ouro-BSA-rodamina. Para este protocolo, use uma velocidade de digitalização de 400 Hz, resolução de 512 x 512 pixels e tamanho Z-passo de 0,25 m. Excitar GFP e ouro-BSA-rodamina usando um laser de Ar (488 nm) e um laser de HeNe (543 nm), respectivamente. Incluir uma imagem de campo brilhante (BF) de canal para observar a forma das células. Para outros sistemas de microscopia e condições de infecção, a definição tem que ser ajustado em conformidade.
   NOTA: Use o mesmo laser Ar como fonte de luz de canal e sinal BF foi detectado com um detector multiplicador foto (PMT).
3. No indicada pontos temporais pi, montar as lâminas de câmara de 8 poços contendo células infectadas no palco microscópio e gravar imagens.

7. Análise de Imagens

1. Use microscopia software de análise de imagem (veja Salmonella intracelular. Abra os dados clicando em 'Open' e escolher o arquivo.
   NOTA: Como alternativa, os pacotes de software de código aberto, como ImageJ ou FIJI pode ser utilizado para a imagem de análises quantitativas.
2. Na barra de ferramentas objetos do clique Ultrapasse vista sobre o ícone para adicionar um novo item de superfície. Clique em (Next).
3. Para analisar uma região de interesse (ROI), selecione um segmento de ROI. Em uma área de visualização, uma seção delimitada-retângulo sobreposto na imagem está representando o ROI. Digite os valores no x- correspondente, y, e os campos Z-, ou clique diretamente nas setas no retângulo de visualização para modificar o tamanho ea posição do ROI. Em seguida, clique = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (Next).
4. Como um canal de origem, selecione o canal 3 (sinal for Gold-BSA-Rhodamine NPS). Verifique a opção suave para configurar a lisura da superfície resultante. Defina um valor manualmente ou aceite o valor gerado automaticamente. Para Threshold, selecione a opção de intensidade absoluta.
5. Para o ajuste de limiar, selecione a opção manual e definir um valor. Na área de visualização, uma prévia limiar superfície é exibido em cinza.
6. Na guia Classificar Surfaces a superfície resultante pode ser filtrado por vários critérios. Um filtro padrão é 'número de voxels> 10', e outros filtros também podem ser incluídos, clicando em "adicionar". Se a filtragem não é necessário, em seguida, elimine todos os filtros, clicando no botão excluir. Clique (Next).
7. Para concluir a criação do Surface, clique em/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). Na lista de objetos, agora desmarque a caixa para o Volume item e nova superfície criado é exibido na área de visualização.
8. Exportar as estatísticas. Agora, na vista Ultrapassar a cor dos indivíduos, variar de púrpura para vermelho de acordo com a sua área. E a mesa 'Números Plot Area' mostra a informação de estatísticas (por exemplo, número de identificação e área de objetos). Exportar todas as estatísticas de superfície 1 para um arquivo do Excel através de um clique (Save).

NPs de ouro foram gerados por meio de um método bem estabelecido através da redução de ácido cloroáurico por citrato e ácido tânico. Como mostrado na Figura 2A, as NPs de ouro foram sintetizados quase-esféricas com um tamanho de aproximadamente 10 nm. BSA-revestimento e rotulagem rhodamine não influenciou sua morfologia ou tamanho (Figura 2B).

Tem sido relatado que NPs de ouro pode ser prontamente retirado pelas várias células de mamífero e terminou-se nos sistemas de endocitose 7. De acordo com trabalhos anteriores, os sinais vermelhos brilhantes fluorescência foram observadas em células HeLa após 1 hora de incubação com NPs de ouro-BSA-rodamina (Figura 3, WT 5 h pi), indicando a internalização efectiva dos PN pelas células. A maioria dos sinais vermelhos foram encontradas co-localizada com sinais verdes, mostrando que os PN foram confinados em endossomas ou lisossomas final. No entanto, ao contrário de uma distribuição uniforme da PN em endossomos tardios / lisossomosem células não infectadas (Figura 3, simulação), foram em grande parte as suas localizações rearranjado em células infectadas pelo WT Salmonella. Na fase precoce da infecção (Figura 3, WT 5 h pi), Salmonella replica dentro do VCR e SIF sofrer extensão movimento rápido ou contracção. Neste ponto de tempo, uma fracção dos PN foi encontrada em SCV e SIF, enquanto a outra fracção foi ainda localizado em endossomas tardios livres / lisossomas. Às 8 horas pi (Figura 3, WT 8 h pi), uma rede estabilizada de SIF foi formado, e a maioria das NPs foram encontrados acumulado dentro das estruturas tubulares, enquanto que apenas uma porção muito pequena permaneceu localizado em endossomas tardios livres / lisossomas. As cepas mutantes Δ ssaV e Δ sifa exibiram comportamentos distintos. Como mostrado na Figura 3 (Δ ssaV), às 8 horas pi, Δ ssaV foi confinado dentro SCV enquanto não há estruturas SIF foram formados. Alguns NPs foram observadas em torno Salmonella dentro do SCV, mas a maioria dos PN ainda estavam localizados em gratuitas final endosomes / lisossomos. Para a estirpe Δ Sifa (Figura 3, Δ Sifa), escape de Salmonella no citoplasma ocorrido, e não foi observada associação entre PN e bactérias.

Em nosso estudo anterior, verificou-se que são apresentados SIF propriedades altamente dinâmicas na fase inicial da infecção (3-5 hr pi), mas tornar-se estabilizou no período posterior (> 8 h pi) 12. Por isso, estamos querendo saber se Salmonella em fases precoces e tardias da infecção tem capacidade comparável para reorganizar a distribuição de NPs intracelulares. Como mostrado na Figura 4, NPs de ouro foram incubadas com células HeLa S / N antes da infecção, ou em diferentes pontos de tempo após a infecção (1-7 h pi) durante 1 hora, em todos os casos a maior parte das NPs internalizados foram observados acumulados em SCV ou SIF.

Observ microscópicações revelou que a infecção por Salmonella em resultados rearranjo maciça do sistema endo-lisossomal de células hospedeiras. Como passo seguinte, foi utilizado o pacote de software para analisar Imaris Salmonella induzida fenótipos de células hospedeiras de uma forma quantitativa. Usando a imagem de uma infecção de células HeLa em 8 h pi como um exemplo, uma instrução de passo-a-passo para uma análise quantitativa é mostrada na Figura 5. Através de um limiar de intensidade de 15 e um 'número de voxels> 10' do filtro, 3D objetos foram extraídos do arquivo da imagem original. Os objetos foram supostamente estruturas intracelulares em que o ouro-BSA-rodamina NPs localizados com. Neste exemplo, 67 objectos foram extraídos no total, com uma área resumido como 1,974.64 mm 2. A maior objeto, que co-localizada com a rede de SIF, tem uma área de 1,836.23 2 mm, enquanto que os outros são menores do que 50 mm 2. Para efeitos de comparação, um exemplo que mostra a quantitative resultado da análise de uma célula não-infectada foi cedido. Aqui, 431 objectos foram extraídos no total, dentro do qual o valor médio da área é 2 5 mm e o maior objecto tem uma área de 34 mm 2. A área resumida dos objectos é 2,252 mm 2, que é comparável com o de células infectadas na Figura 4 (1,975 mm 2). No entanto, o número de objectos é muito maior do que o outro (431 e 67 objetos, respectivamente), o que indica grande medida fusão das vesículas com as estruturas tubulares induzidas por Salmonella.

Figura 1. Esquema para a preparação de células HeLa de imagem de células vivas. As células HeLa foram semeadas em lâminas de câmara, falsamente infectadas ou infectadas com diferentes estirpes de Salmonella durante 30 min, lavadas 3 vezes com PBS, em seguida, incubat ed com meio contendo 100 ug / ml de gentamicina, durante 1 h. Subsequentemente, o meio foi substituído por meio contendo imagiologia NPs de 10 nm de ouro-BSA-rodamina (OD 520 = 0,1) e 10 ug / ml de gentamicina, incubadas durante 1 hora, e, em seguida, perseguido por meio de NP-livre para o resto da experiência . Imagens de células vivas foi realizada em diferentes momentos após a infecção (pi). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagens TEM de ouro coloidal PN antes (a) e depois de rotulagem (b). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. A acessibilidade do sistema de endo-lisossômico em diversas fases da infecção por Salmonella. HeLaAs células foram pulsadas com 10 nm de ouro PN-BSA-rodamina (OD 520 = 0,1) O / N infecção anterior, ou durante 1 hora a vários pontos de tempo, como indicado pi. Imagens de células vivas foi realizado em 8-9 hr pi projeções de intensidade máxima de MCVL Z-stacks são mostrados. Barras de escala, 10 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. instruções passo a passo para a análise quantitativa por Imaris usando uma imagem de uma célula HeLa infectadas a 8 h pi como um exemplo. (A) Abra os dados clicando em 'Open' e escolher o arquivo. (B) Na barra de ferramentas objetos da visão Ultrapasse adicionar um novo item superfície. (C) Para analisar um ROI, em seguida, selecione um segmento de ROI. (D) Digite os valores no x- correspondente, y, e z-campos ou (E) clicar diretamente nas setas no retângulo de visualização de modificar o tamanho ea posição do ROI. Neste exemplo, um ROI não foi precisa e toda a imagem foi analisada. (F) Como um canal de origem selecionar o canal 3 (sinal de Gold-BSA-Rhodamine NPS). Verifique a opção suave para configurar a lisura da superfície resultante. Defina um valor manualmente ou aceite o valor gerado automaticamente. Aqui, utilizou-se 0,1 mm. Para "Threshold", selecione a opção 'intensidade absoluta'. (G) Para o ajuste limiar selecionar a opção manual e definir um valor (neste exemplo 15 foi usado). Na área de visualização uma prévia limiar superfície é exibido em cinza. (H) Na guia "Classifique Surfaces", a superfície resultante pode ser filtrado por vários critérios. Um filtro padrão é 'número de voxels> 10'. Ofiltro pode ser ajustado por introduzir um novo valor e outros filtros podem ser adicionados. Neste exemplo, mantivemos o "número de voxels> 10 'filtro. (I) para concluir a criação da superfície, clique em "Concluir". Na lista de objetos agora desmarque a caixa para o Volume item e nova superfície criada é exibida na área de visualização em vermelho. (J) Na visão Superar a cor dos temas variam do roxo ao vermelho de acordo com sua área. (K) O 'Números Plot Area' tabela mostra as informações estatísticas. As estatísticas de exportação para um arquivo Excel. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. resultado da análise quantitativa de uma célula não-infectada. ( (B) A nova superfície criada. (C) A nova superfície na visão Ultrapasse. (D) O 'Números Plot Area' tabela mostra as informações estatísticas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não há conflitos de interesse declarados.