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Artigo de método

Quantificação de Orofacial nos fenótipos Xenopus

9.3K vistas

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DOI:

10.3791/52062

⸱

6 de novembro de 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

Neste artigo

Resumo

Um método para quantificar o tamanho e forma orofacial de embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Neste protocolo, as medições de tamanho tradicional são combinados com morfometria geométrica para permitir análises mais sofisticadas de desenvolvimento orofacial e defeitos.

Resumo

Xenopus tornou-se uma ferramenta importante para dissecar os mecanismos que regem o desenvolvimento craniofacial e defeitos. Um método para quantificar o desenvolvimento orofacial irá permitir uma análise mais rigorosa dos fenótipos orofaciais mediante revogação com substâncias que podem manipular geneticamente ou molecularmente a expressão do gene ou a função da proteína. Usando imagens bidimensionais dos chefes embrionárias, dimensões, tais como tamanho tradicional orofacial largura, altura e área- são medidos. Além disso, uma medida de arredondamento da abertura da boca embrionária é usada para descrever a forma da boca. Morfometria geométrica destes dois imagens tridimensionais também é executada para fornecer uma visão mais sofisticada de mudanças na forma da região orofacial. Marcos são atribuídos a pontos específicos na região orofacial e coordenadas são criados. A análise de componentes principais é usada para reduzir coordenadas marco para componentes principais que, em seguida, discriminam o tratamentogrupos. Estes resultados são exibidos como um gráfico de dispersão em que os indivíduos com formas orofaciais semelhantes se agrupam. Também é útil para executar uma análise da função discriminante, que compara estatisticamente as posições dos pontos de referência de entre dois grupos de tratamento. Esta análise é apresentada em uma grade transformação, onde mudanças na posição do marco são vistos como vetores. A grade é sobreposto a estes vetores para que um padrão de deformação é exibido para mostrar onde as posições marco significativas mudaram. As mudanças de forma na análise da função discriminante baseiam-se numa medida estatística, e, por conseguinte, pode ser avaliada por um valor de p. Esta análise é simples e acessível, necessitando apenas de um estereoscópio e software freeware, e, portanto, será um recurso valioso de pesquisa e ensino.

Introdução

Entre os tipos mais prevalentes e devastadores de defeitos congênitos humanos são aqueles que afetam a boca e face, tais como fendas orofaciais um. Crianças com estruturas orofaciais malformados passar por várias cirurgias ao longo da sua vida e luta com desfigurações faciais, voz, audição e problemas alimentares. Portanto, facilitando novas pesquisas no desenvolvimento crânio-orofacial e é fundamental para a prevenção e tratamento destes tipos de defeitos congênitos em humanos. Xenopus laevis surgiu como uma nova ferramenta para dissecar os mecanismos que regem o desenvolvimento craniofacial (alguns exemplos incluem 2,3,4 -11). Portanto, um método quantitativo para analisar tamanho e forma as mudanças durante o desenvolvimento da cabeça e do rosto desta espécie poderia ser muito poderosa 3.

Aqui, apresentamos um método desse tipo; combinando medidas tradicionais de tamanho, com morfometria geométrica adaptados de um estudo Xenopus 12 e uma riqueza de estudos que analisam forma facial humana 13-15. O objetivo deste protocolo é permitir que pesquisadores para quantificar o tamanho e formas facial para distinguir entre diferentes fenótipos orofaciais durante o desenvolvimento normal e anormal. Essa análise permitirá uma melhor diferenciação entre defeitos craniofaciais sutis, como os decorrentes de efeitos sinérgicos de genes e / ou fatores ambientais. Além disso, este método de quantificação também poderia revelar até mesmo ligeira melhoria ou resgate de um defeito orofacial. Este, portanto, faz com que seja um guia útil na análise de potenciais terapias.

A combinação das medidas faciais e morfometria geométrica que apresentamos aqui permite uma análise estatística mais abrangente, tanto em tamanho e forma da região orofacial do que os protocolos actuais, que utilizam, em grande parte apenas um ou outro 15-18. Além disso, apresentamos uma forma simples de avaliar tanto a medial e planos laterais deo rosto sem a necessidade de equipamentos de imagem tridimensional sofisticado usado em estudos atuais 13,19.

Demonstramos esse protocolo em Xenopus laevis embriões tratados com um inibidor do receptor do ácido retinóico que induz o desenvolvimento orofacial anormal e um 2,3 fenda palatina mediana. A quantificação das dimensões e forma da região orofacial nestes embriões revelou mudanças no terço médio da face, que é análogo aos seres humanos com fissuras palatinas semelhantes e modelos de mouse 20,21. No entanto, este protocolo pode ser utilizado para avaliar os efeitos de outros compostos no desenvolvimento orofacial substâncias naturais, tais como, herbicidas, ou proteínas, tais como factores de crescimento. Além disso, o tamanho e forma alterações orofaciais decorrentes de perturbação da expressão génica por via da perda ou ganho de experiências de função (utilizando morpholinos anti-sentido ou Crispers / Talens) pode também ser quantificada usando este protocolo. Por fim, desenvolvemos este método specificalmente para avaliar a morfologia de Xenopus; no entanto, é facilmente modificado para análise de qualquer vertebrado. Outras aplicações também poderia incluir o uso deste protocolo para a comparação de espécies estreitamente relacionadas para estudos evolutivos ou ecológicos. Embora o exemplo que fornecemos aqui utiliza este protocolo para descrever a análise da região orofacial, que poderia ser facilmente modificado para análise de outras regiões, órgãos ou estruturas.

Este protocolo quantificação orofacial vai se tornar um recurso valioso para a comunidade de pesquisa, bem como uma excelente ferramenta de ensino para os alunos de graduação como uma demonstração em vídeo.

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Protocolo

Todos os experimentos realizados utilizando Xenopus laevis foram aprovados pelo IACUC (protocolo nº AD20261).

1. Reagentes Preparar e materiais necessários

  1. Reagentes:
    1. Faça 1 L de 10x MBS (Modificado salinos de Barth) solução 22. Adicionar NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7,8), e NaHCO3 (25 mM) a 1 L de água destilada. Ajustar o pH para 7,8 com NaOH.
    2. Adicione 1 L de 1x MBS diluindo 100 ml de 10x MBS solução em 900 ml de água destilada. Adicionar 0,7 ml de uma solução M de CaCl2.
    3. Adicione 1 L de MBS 0,1x diluindo 100 ml de solução 1x MBS, em 900 ml de água destilada. Para 1 L de solução de MBS 0,1x, adicionar 1 ml de 10 mg / ml de solução de gentamicina para uso na cultura do embrião.
    4. Adicione MBS elevadas de sal por dissolução de 4 ml de 5 M de NaCl em 100 ml de 10x MBS. Em seguida, adicione água destilada até que o volume total é de 1 L.
    5. Faça etanol 70% por diluição de 100% eThanol de etanol a 70% com água destilada.
    6. Adicione BMS-543 por preparação de uma solução stock de 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO).
    7. Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) por adição de 4 g de paraformaldeído em pó a 50 ml de água destilada. Aquecer numa placa de aquecimento a aproximadamente 65 ° C, altura em que adicionar 5 NaOH M gota a gota, até que a solução limpa.
      1. Uma vez que a solução limpa, retire do fogo e adicione 50 ml 2x PBS e 100 mL de Tween-20. Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente em gelo. Ajustar o pH a entre 7,2 e 7,5 utilizando HCl.
    8. Adicione uma solução salina tamponada com fosfato com Tween (PBT) por dissolução de 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, e 0,24 g de KH 2 PO 4 em 800 ml de água destilada. Usando HCl, ajustar o pH para 7,4. Adicionar 2 ml de Tween-20. Ajustar o volume final com água destilada até 1 L. igual
    9. Faça uma solução de cisteína dissolvendo 1 g de cisteína em 50 ml de água destilada ou 0,1x MBS. Adicionar 1,5 mL de 5 M NaOH umnd ajustar o pH para 7,8.
    10. Adicione uma solução estoque de 10% de benzocaína através da adição de 10 g de pó de benzocaína a 100 ml de EtOH a 100%. Para eutanásia de adultos do sexo masculino e embriões prontos para fixação, diluir a uma solução de 0,05%.
    11. Adicione uma solução de armazenamento dos testículos por adição de 1 ml de soro de vitela a 9 ml de tampão de L15.
  2. Ferramentas necessárias e Equipamentos:
    1. Obter o equipamento listado na tabela de materiais e equipamentos, mostrada na Figura 1.
    2. Modificar uma ferramenta pipeta. Colocar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro para uma chama de um queimador de Bunsen. Gire a ponta da pipeta até que derreta e forma uma extremidade selada arredondado.
    3. Nivelar modelagem da argila para o fundo de uma placa de Petri de plástico, alisando-se a cobrir a totalidade da placa (qualquer tamanho pode ser utilizada) (Figura 1Aiv).
      1. Pressione levemente uma agulha provocação direto para o prato forrado de argila em um ângulo de 45 °. Segure a agulha lá, e mova lentamente a Petriprato horizontalmente para criar uma linha deprimida (Figura 1bi). Repita o procedimento para o número desejado de linhas.
      2. Utilizar a extremidade de uma ferramenta de pipeta de vidro para tornar superficiais, depressões circulares em cada linha do prato alinhado com argila para colocar cabeças de embrião (Figura 1Bii) e ajuda na organização dos embriões, enquanto que fotografa.
      3. Para a fotografia, preencher prato com PBT (Figura 1Biii). Entre os usos, lavar muito bem o prato e a superfície da argila com água esterilizada, seguida de etanol a 70%.

2. Xenopus laevis Embrião Cultura e Inibidor Tratamentos

  1. A fertilização in vitro e cultura de ovos de Xenopus:
    1. Obtenha e cultura Xenopus laevis embriões usando métodos padrão publicado 22,23.
    2. Resumidamente, a eutanásia um macho adulto por submersão em uma solução de benzocaína 0,05%. Dissecar testículos e armazenar na memória de armazenamento testículos. Injetarfêmeas adultas com gonadotrofina coriónica humana (HCG), a recolha de ovos em MBS elevados de sal, e fertilizar in vitro com testículos dissecados (Figura 2A, B).
    3. Cultura de embriões em MBS 0,1x a 15 ° C até à fase desejada é atingida (embriões nos estágios de acordo com a tabela normal de Xenopus laevis por Nieuwkoop e Faber 24,25).
      1. Aqui, os embriões de cultura até o estágio 22 (após a fertilização 24 hr (hpf)), e remover a membrana vitelina sob microscópio estereoscópico usando dois pares de fórceps afiadas. Transferência de embriões com um padrão, descartável pipeta de transferência para uma placa de Petri limpo (100 mm de diâmetro) contendo 30-40 ml de 0,1x MBS.
  2. Inibidor de tratamentos de embriões de Xenopus (ilustrados na Figura 2):
    1. Encha as cavidades necessárias de uma placa de cultura de 24 cavidades com 1 ml de MBS 0,1x utilizando uma pipeta calibrada pelo homem. Demarcar o exterior do poço com uma marca de ponta finaer (Figura 2D, inserção). Use também o marcador para rotular os conteúdos a serem adicionados a cada poço 24 na tampa bem prato de cultura. Copie esta informação em uma página de 24 poços set-up no caderno de laboratório.
    2. Transferir 5-10 embriões em cada poço usando um padrão, descartável pipeta de transferência (Figura 2C). Inserir o mesmo número de embriões em cada poço.
    3. Atestar ou remover os MBS 0,1X para que ele fique ao nível do 1 ml linha marcada (Figura 2D). Adicionar o volume apropriado de DMSO (de modo que o volume final de DMSO é de 1%) e agitar suavemente. Ter cuidado de não adicionar DMSO demasiado perto dos embriões, e evitar o contacto dos embriões com a superfície do tampão.
    4. Adicionar o volume adequado de produto químico aos poços e agitar suavemente novamente. Aqui, adicionar 1 ul de 10 mM de BMS-453 (um antagonista do receptor de ácido retinóico) e 9 mL de DMSO a 1 ml de MBS 0,1x.
    5. Se o produto químico é sensível à luz, vagamente embrulhar o culprato tura em papel alumínio. Embriões em cultura a 15 ° C incubadora até o estágio desejado. Neste exemplo, o tratamento de embriões para 16-18 hr.
  3. Lavar embriões fora do tratamento e criação até estágios de girinos:
    1. Remover um meio a três quartos da solução com uma pipeta de transferência descartável. Tenha cuidado para não perturbar os embriões. Usando uma nova pipeta, encher o bem com 0,1X MBS. Repita isto 3-6 vezes.
    2. Embriões de transferência para uma grande placa de Petri (150 mm de diâmetro) contendo 100 ml de MBS 0,1x com gentamicina (1 mL / L). Incubar os embriões a 15 ° C até atingirem a fase de 42-45 (hpf 82-100).
    3. Alterar o MBS 0,1X solução contendo gentamicina diariamente, e remover embriões mortos imediatamente para evitar a contaminação ou a morte de outros embriões. Anote o número de embriões mortos em caderno de laboratório.
  4. Fixação de embriões em paraformaldeído (PFA):
    1. Fix embriões entre os estágios 42 e 45 (82 e 100hpf, respectivamente), transferindo-os para um novo 24 bem placa de cultura contendo 1-2 ml de MBS 0,1X. Rotular a tampa com a mesma informação que o tratamento set-up descrito acima (seção 2.2.1).
    2. Remover o máximo MBS 0,1X de cada bem quanto possível, ao mesmo tempo deixando embriões abrangidos e garantir o mínimo de contato para evitar lesões. Adicionar 1-2 ml de solução de 0,05% de benzocaína em MBS 0,1x e incubar os embriões até já não são sensíveis a estímulos.
    3. Adicionar 1-2 ml de 4% PFA. Alternativamente, coloque embriões em tubos de microcentrífuga marcados para fixação, se preferir.
    4. Incubar embriões em PFA durante 24 horas a 4 ° C num agitador rotativo. Remover PFA realizando 3-4 lavagens com PBT longo de um período de 3-5 horas.

3. Fotografar Região Orofacial de Xenopus girinos

  1. Preparação pré-fotografia (isto é ilustrado na Figura 3):
    1. Coloque embriões fixas em uma grande placa de Petri (150mm de diâmetro) contendo cerca de 100 ml de PBT.
    2. Faça duas incisões para cortar a cabeça do corpo (Figura 3A, sólidas linhas pretas). Em primeiro lugar, segurar o embrião com um par de pinças e fazer uma incisão no lado posterior do intestino com um bisturi estéril (Figura 3B). Fazer uma segunda incisão no lado anterior do intestino, perto do coração, para remover completamente a cabeça (Figura 3C).
    3. Pipeta cortou cabeças de embriões em um prato forrado de argila (parte 1.2.2) usando um padrão, descartável pipeta de transferência.
      1. Para vistas frontais, use dois pares de fórceps para posicionar as cabeças de embriões lado posterior para baixo dentro das depressões circulares. Usando a pinça para manipular, tanto na cabeça do embrião e a argila circundante, embriões de posição de tal modo que eles estão voltados para a câmara e não são inclinadas para trás ou para os lados (Figura 3D). Com cuidado, empurre o barro circundante ao redor da cabeça usando uma pinça e / ou o vidroferramenta pipeta para proteger a cabeça no lugar.
      2. Para vistas laterais, use uma pinça para posicionar as cabeças de embriões dentro das depressões circulares de tal forma que eles estão do seu lado, de frente para a mesma direção, e são planas contra o barro. Manipular a cabeça do embrião e a argila circundante de modo a que as glândulas de cimento de todos os embriões estão posicionados para baixo no mesmo ângulo (Figura 3E). Use as linhas desenhadas com a agulha provocação como um guia para garantir a precisão quando se toma medidas laterais.
  2. A captura de imagens da cabeça de girino:
    1. Fotografe o chefe do girino usando qualquer microscópio de dissecação com uma câmera digital ligado e o software da câmera correspondente. Utilizar a maior ampliação que pode ser mantido constante para todos os embriões.
    2. Centralize embriões e enfrentá-los todos na mesma direção. Capturar imagens usando as melhores condições de iluminação que permitem a imagem mais precisa da região orofacial. Posiçãoluzes para evitar sombras excessivas. Salve as imagens como arquivos .tiff com a maior resolução possível.

4. Medição e Análise Facial Tamanho Dimensões em Xenopus girinos

  1. Medir dimensões orofaciais (resumidos na Figura 4):
    1. Determinar a largura da face. Identificar os pontos em que a parte ventral de cada olho de reunir as periferias da face (Figura 4A, setas), e medir a distância entre estes pontos (Figura 4A, linha vermelha).
    2. Determine a altura da face. Primeiro, determinar a linha média, medindo a distância entre cada olho e cálculo da metade da prova. Em seguida, desenhe linhas horizontais que marcam os dorsais maioria das bordas dos olhos eo ponto mais dorsal da glândula de cimento (Figura 4B, linhas brancas). Na linha média, medir a distância entre as linhas horizontais (Figura 4B, linha vermelha).
    3. Determine tele orofacial. Use as mesmas linhas horizontais que marcam as bordas dorsal dos olhos e da glândula de cimento para orientar medidas de área (Figura 4C, linhas brancas). Iniciar no ponto onde a marcação a parte superior da glândula cimento linha horizontal encontra na periferia do lado esquerdo da face (Figura 4ca).
      1. Seguir ao longo da orla da face englobando o olho até ao ponto em que a marcação de topo dos olhos linha horizontal encontra a periferia da face (Figura 4BC). Continue a traçar ao longo desta dorsal linha mais horizontal até o ponto onde se encontra com a periferia do lado direito da face (Figura 4cc).
      2. Seguir a baixo ao longo da orla da face englobando o olho até ao ponto em que a marcação de topo da glândula cimento ventral linha horizontal mais satisfaz a periferia do lado direito da face (Figura 4CD). Continue a traçar ao longo desta linha unt horizontal inferioril se encontra com o ponto em que o rastreamento começou. Use software de edição de fotos para calcular a área dentro do traçado.
    4. Determine o comprimento do focinho. Nas imagens laterais, faça uma linha vertical que marca o anterior do olho. Em seguida, medir a distância horizontal a partir do ponto mais anterior, onde o cara encontra a borda dorsal da glândula de cimento para a marcação do segmento anterior do olho (Figura 4D) linha vertical.
    5. Determinar a largura da boca. Medir a distância horizontal entre os pontos esquerdo e direito, onde os superiores e inferiores "lábios" da boca abrindo meet (Figura 4E). Estes poderiam ser considerados o sapo equivalente das comissuras labiais.
    6. Determine o arredondamento boca. Calcule boca redondeza como uma proporção inversa em que (4   ×   [Área]) / (π   ×   [Eixo principal] 2 >).
      1. Use a ferramenta Lasso em uma foto-editor para traçar as bordas da abertura da boca, como mostrado na Figura 4F. Selecione Analisar na barra de ferramentas principal, e escolher Medida. Em alternativa, o cálculo circularidade partir da medição da área e do diâmetro da abertura da boca.
  2. A análise dos dados das dimensões faciais:
    1. Entrada as medições de dimensões faciais em um programa de análise de dados para comparar o grupo de tratamento com o controlo. Determinar a média de cada medida para ambos os grupos experimentais e de controle para criar gráficos de barras. Determinar o desvio padrão, a fim de criar as barras de erro. Realizar testes t de Student para comparar estatisticamente os grupos.
      NOTA: Esta informação pode ser bastante variável, devido aos ligeiramente diferentes ritmos de desenvolvimento entre os embriões.

5. Análise Quantitativa Forma Orofacial e Morfometria

  1. Marcos lugar e creaarquivo te marco de coordenadas (ilustrada na Figura 5A).
    1. Escolha Marcos essas que eles captam a forma da imagem de alvo, e pode ser repetidamente colocada no mesmo local relativo em todas as amostras a serem analisadas. Se a estrutura não existe em todas as amostras, não coloque um ponto de referência sobre essa estrutura.
      1. Aqui, colocar 24 pontos de referência para representar o terço médio da face com marcas distintivas, tais como os olhos, narinas e boca. Para manter a consistência, coloque marcos no meio do caminho entre os marcos colocados anteriormente (por exemplo, marcos boca, Figura 5AI).
    2. Capturar coordenadas marco e criar "marco coordenar arquivo". Abrir a primeira imagem de uma face girino (por exemplo, o primeiro embrião de controlo).
      1. Selecione a aba Plug-ins na barra de ferramentas principal e escolha Pointpicker no menu suspenso. Selecione a guia somar pontos e colocar marcos em locais desejados como marcos aparecerá como cruzes multicoloridas ( Figura 5AI).
      2. Mova locais marco após a colocação selecionando a ferramenta Mover cruzes. Quando todos os marcos foram colocados sobre a imagem, selecione a guia Exibir resultados na barra de ferramentas principal e escolha Show (Figura 5Aii) para visualizar as coordenadas marco e copiar para um programa de planilha (Figura 5Aiii).
      3. Ao colar essas coordenadas deste primeiro embrião para um programa de planilha, deixe uma linha vazia acima dos dados. Na coluna B desta linha vazia (linha 1), tipo "LM =" com o número de pontos de referência da amostra. Aqui, digite "LM = 24", já que 24 marcos foram criados (Figura 5Aiii, caixa vermelha).
      4. Na linha abaixo do pontos de dados, tipo "ID =" com um nome de identificação da amostra. Aqui na Figura 5Aiii, digite "ID = CON1", já que este é coordenar o marco dados do primeiro embrião de controle (Figura 5Aiii, seta vermelha).
      5. Repita este processo com as caras de cada embrião no experimento (experimental e controle) até que todas as coordenadas do marco foram inseridos na planilha.
        NOTA: É importante que cada embrião é dado um nome único no "ID =" linha. Aqui, por exemplo, o seguinte conjunto de coordenadas marco é dado o ID de "CON2", uma vez que foi o segundo embrião no grupo de controle.
      6. Copie todo o segunda e terceira colunas em um documento de texto e salvar como um arquivo .txt.
  2. Configure o programa de software para análise de dados de morfometria (ilustrada na Figura 5B).
    1. Aqui, selecione Criar novo conjunto de dados no menu principal do programa de software de morfometria. Nomeie o arquivo e os dados constantes nas caixas apropriadas (por exemplo, "Ácido retinóico inibição" e "marcos faciais", respectivamente) na tela pop-up (Figura 5Bi). Importe o arquivo como um TPS, e select o arquivo de texto de coordenadas para criar o conjunto de dados (Figura 5Bi, seta vermelha).
    2. Alinhamento de dados e procrustes caber:
      1. Realizar um ajuste procrustes e alinhamento. Destaque o conjunto de dados na guia Árvore de Projetos, escolha Preliminares na barra de ferramentas principal, e New Fit Procusto no menu suspenso.
      2. Escolha Alinhar por Principal Axis e selecione Executar Procusto Fit na parte inferior da caixa (Figura 5Bii, seta vermelha). Volte para as preliminares menu drop-down, selecione Gerar Covariance Matrix (Figura 5Biii) e selecione Executar.
      3. Ver as correlações da matriz de covariância na guia Resultados.
    3. Crie um arquivo "classificador", atribuindo a cada amostra no conjunto de dados para a variável classificador apropriado para distinguir se ele pertence no grupo experimental e no grupo controle.
      1. Rotular duas colunas em uma planilha. Rotular o cabeçalho da primeira Column com "ID" e introduzir o mesmo do ID fornecido para cada amostra (por exemplo, CON1, RARINHIB1, e assim por diante; A Figura 5Biv). Rotular o cabeçalho da segunda coluna com "tratamento" e de entrada em cada célula o grupo de tratamento que corresponde ao exemplo listado na ID da célula adjacente.
      2. Aqui, use etiquetas "Controle e RAR INIBIDOR" como classificadores (Figura 5Biv). Copie em um arquivo de texto e salvar como um arquivo .txt. Variáveis ​​Import Classificadores para o programa de software de morfometria. Escolha do jogo por Identifier, e abra o arquivo de texto (Figura 5Bv).
  3. Criar uma análise de componentes principais (PCA) dispersão, selecionando no menu suspenso e escolher Variação Análise de Componentes Principais (Figura 6AI). Em seguida, selecione a guia Gráficos para ver três guias adicionais: muda de forma PC, autovalores e dezenas de PC (Figura 6Aii). A guia pontuações PC exibe a bivariate diretor scatterplot componente do ajuste de dados marco Procusto (Figura 6Aii).
    1. Para mudar os componentes principais são traçados, abrir o menu pop-up no espaço enredo e selecionar o eixo desejado para mudar (Figura 6Aiii, seta vermelha).
    2. Selecione a ferramenta de Pontos de Dados Color (Figura 6Aiii). Selecione classificadores importado anteriormente (Seção 5.2.2) no segundo menu pop-up que aparece para determinar a cor de cada categoria (Figura 6Aiv).
    3. Ver a quantidade de variância capturada por cada componente principal na guia Resultados (Figura 6AV). Gráfico de exportação como um arquivo .bmp.
  4. Criar uma grade transformação análise da função discriminante (DFA) no programa de software de morfometria escolhendo Análise de função discriminante na aba Comparação (Figura 6BI). No menu pop-up, certifique-se de que o conjunto de dados apropriado é selected eo tipo de dados é as coordenadas Procrustes-fit.
    1. Destaque os pares de grupos a serem comparados e executar 1.000 testes de permutação (Figura 6BII).
    2. Sob Graphics, ver o mapa do vetor das coordenadas na guia Forma Diferença (Figura 6Biii). Se a imagem é invertida, abrir o menu pop-up no espaço plano para virar o diagrama na orientação correta (Figura 6Biii).
    3. A direção dos vetores reflete a diferença forma a partir do primeiro grupo em relação ao segundo, que é exibida no menu Função discriminante antes de executar a análise (Figura 6BII). Para inverter a direção dos vetores, abrir o menu pop-up no espaço trama e mudar o sinal do fator de escala de modo que é negativo (Figura 6Biii, iv). O valor da escala é definida como um fator de dez que melhor representa as diferenças estatísticas na posição marco between os dois grupos sem distorção, e geralmente é deixado no padrão (Figura 6Biv).
    4. Também no menu pop-up, mudar o gráfico para uma grade transformação para sobrepor os vetores dentro de uma grade (Figura 6Biii, v).
    5. Especifique o número de linhas horizontais e verticais da grade no menu pop-up (Figura 6Biii, v).
    6. Exportar o gráfico como um arquivo .bmp.
    7. Ver as distâncias Procusto e Mahalinobis e p-valores sob a guia Resultados (Figura 6Bvi).
  5. As análises morfométricas adicionais que são úteis para a avaliação de mais do que um grupo de tratamento
    1. Criar uma análise de componentes grade transformação diretor. The Shape PC Muda guia exibe o mapa vetor de mudanças de forma representando variação dentro de cada grupo da amostra. Use o menu pop-up na área de plotagem para orientar a imagem corretamente e sobrepor vetores dentro de uma grade de transformação. Defina o fator de escalapara o valor no eixo dos x do gráfico de contagens de PC que corresponde ao centro estimado do grupo de controlo. Exporte a imagem como um arquivo .bmp.
    2. Criar um gráfico de dispersão CVA. Sob a guia de comparação na barra de ferramentas principal, selecione Canonical análise de variáveis, e destacar o conjunto de variáveis ​​classificador que foi importado anteriormente (ver Secção 5.2.3). Selecione 1000 iterações para testes de permutação e selecione Executar. Selecione a guia pontuação CV para ver o gráfico de dispersão CVA bivariada. Este é codificados por cores com base nos classificadores carregados. Alterar o esquema de cores, trazendo até o menu pop-up no espaço parcela (ver Secção 5.3.3). Exportar como um arquivo .bmp.
    3. Criar uma grade transformação CVA. Uma grade de transformação dos resultados CVA pode ser gerado quando se compara mais de dois grupos. Sob a guia Gráficos, escolha muda de forma CV para visualizar a grade de transformação das coordenadas de referência. Abra o menu pop-up no espaço plano para mudara direcção do vector, sobrepor os resultados para uma grelha de transformação, e especificar o número de linhas de grelha. Exportar o gráfico como um arquivo .bmp.

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Resultados

Aqui, foi demonstrada uma análise quantitativa do tamanho e forma orofacial para comparar os embriões tratados com um inibidor do receptor do ácido retinóico (RAR inibidor) a controlos não tratados. Os embriões foram tratados com uma concentração de 1 uM de inibidor químico esta fase de 24 a 30 anos (26-35 hpf), lavou-se para fora, e fixado em fase 42 (82 hpf). Eles foram, em seguida, processada e analisada como descrito no protocolo. Os resultados são dados originais, mas consistente com as observações em publicações a...

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Discussão

Xenopus laevis tornou-se uma ferramenta útil para dissecar os mecanismos de desenvolvimento de desenvolvimento orofacial subjacente; no entanto, atualmente não há protocolos que descrevem tamanho e forma as mudanças desta região em sapos. O método aqui descrito vai contribuir significativamente para o campo do desenvolvimento orofacial, permitindo a quantificação mais rigorosa dos fenótipos orofaciais em Xenopus e outros vertebrados.

O primeiro aspecto, mais crítico de exec...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Start-up verbas para A. Dickinson de VCU apoiaram este trabalho.

Os autores gostariam de agradecer Dan Nacu por seu talento artístico na criação da ilustração esquemática.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio de dissecaçãoZeissequipado com câmera AxioCamICC1
Dumont #5 Pinça de inoxFine Science Tools11251-10
Bisturi estéril e descartávelSklar06-2015
Placa de 24 poçosFisher Scientific087721
Standard Pipetas de transferência descartáveisFisher Scientific13-711-7M
Placas de Petri de 150 mm x 15 mmFalcon351058
IncubadorasEctotermaajustadas para 15 &graus; C ou 20 & C
Argila de modelagemPremo, ou outra argilaem preto ou branco
Agulha de provocação retaThermo Scientific19010
Tubo capilar (para agulhas)FHC30-30-1Borosil 1,0 mm OD x 0,5 mm ID/Fibra, 100 mm cada
Extrator de agulha, Modelo P-97Sutter Instrument Co.Extrator de agulhas: P-97 Extrator de micropipeta flamejante/bown Filamento: FB300BPara filamentos, use filamentos de caixa quadrada Sutter de 3,00 mm, 3,0 mm de largura.
PipetadoresGilsonF144802, F123600, F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
CisteínaSigma-Aldrich52-90-4
Paraformaldeído em póSigma-Aldrich158127
placas de PetriFalcom353003, 351058100 mm de diâmetro e 150 mm de diâmetro
100% etanolVWR89125-170
de modelagem não tóxica

Referências

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