Um manual de tela pequena molécula Aproximando de alta capacidade Usando embriões Zebrafish

Summary

O peixe-zebra é um excelente organismo experimental para estudar os processos de desenvolvimento de vertebrados e modelo da doença humana. Aqui, nós descrevemos um protocolo sobre como executar uma tela química Manual de alto rendimento em embriões de peixe-zebra com um todo-mount hibridização in situ (desejo) de leitura.

Abstract

Peixe-zebra tornaram-se um organismo modelo amplamente utilizado para investigar os mecanismos que estão por trás da biologia do desenvolvimento e estudar patologia da doença humana devido ao seu elevado grau de conservação genética com os seres humanos. Genética química envolve testar o efeito de que as moléculas pequenas têm em um processo biológico e está a tornar-se um método de investigação de translação populares para identificar compostos terapêuticos. Peixe-zebra são especificamente atraente para usar para a genética químicas devido à sua capacidade de produzir grandes garras de embriões transparentes, que são fertilizados externamente. Além disso, os embriões de peixe-zebra pode ser facilmente tratados com fármaco pela simples adição de um composto para a mídia embrião. Usando todo o monte de hibridização in situ (DESEJO), expressão de mRNA pode ser claramente visualizado dentro de embriões de peixe-zebra. Juntos, utilizando a genética químicos e desejo, o peixe-zebra torna-se um contexto organismo inteiro potente em que para determinar o celular e fisiológicaos efeitos de pequenas moléculas. Avanços inovadores têm sido feitos em tecnologias que utilizam procedimentos de triagem baseados em máquinas, no entanto, para muitos laboratórios de tais opções não são acessíveis ou permanecem custo proibitivo. O protocolo aqui descrito explica como executar uma tela genética manual de alto rendimento químico que requer recursos de base e pode ser realizado por um único indivíduo ou pequena equipe em um período eficaz de tempo. Assim, este protocolo proporciona uma estratégia viável que pode ser implementado por grupos de pesquisa para executar a genética químicos no peixe-zebra, o que pode ser útil para a obtenção de conhecimentos fundamentais em processos de desenvolvimento, mecanismos de doença, e para identificar novos compostos e as vias de sinalização que têm aplicações clinicamente relevantes .

Introduction

A identificação de drogas terapêuticas eficazes para tratar a doença humana é o fim do jogo para muitos pesquisadores da área biomédica. Enquanto a identificação e caracterização de potenciais agentes farmacológicos para aplicações clínicas tem valor óbvio para a saúde, ele permaneceu como um desafio significativo. Em última análise, o desenvolvimento de muitos compostos terapêuticos vem a partir do conhecimento de como os tipos de células específicas, quer desenvolver ou função. O peixe-zebra, Danio rerio, é um teleósteo de água doce da família Cyprinidae, que se tornou um modelo dominante organismo em biologia do desenvolvimento ^1. Peixe-zebra são geneticamente vertebrados tratáveis ​​que são fáceis de manter e manipular para estudos científicos ^2,3. O embrião do peixe-zebra é transparente, fertilizado externamente, e pode ser produzido por centenas de um único par de acasalamento adulto em apenas uma semana ^2,3. Além disso, os principais sistemas de órgãos de peixe-zebra partes e possuem uma grande degree de similaridade genética com os mamíferos, incluindo seres humanos ^4. Surpreendentemente, 70% dos genes humanos têm um ortólogo ⁴ peixe-zebra. Devido a esta semelhança, peixe-zebra ter sido um sistema experimental altamente relevante para o estudo dos mecanismos de desenvolvimento dos vertebrados e fisiologia, e têm sido empregados para recapitular uma multiplicidade de doenças humanas ^5-7. Estas razões, entre outras, fizeram o peixe-zebra um candidato ideal para continuar interrogatórios genéticos e resultou em uma valorização cada vez maior para o utilitário de peixe-zebra na pesquisa biomédica ^6,7.

Ao longo das últimas décadas, uma abundância de ferramentas genéticas têm sido desenvolvidos no peixe-zebra. O genoma do peixe-zebra é passível de mutagênese e transgênese ^3. Até à data, uma pletora de estudos para a frente e reverso genéticas têm sido realizadas, conduzindo à geração de mais de 9.000 mutantes ^3. Além disso, inúmeras linhagens transgênicas tem seen criado, que permitiram a rotulagem e isolamento de tipos específicos de células ^3. Houve esforços significativos em curso para centralizar e distribuir esses recursos para a comunidade de pesquisa, que são acessíveis para os laboratórios em um relativamente baixo custo por meio do Centro Internacional de Recursos peixe zebra (Zirc) ^8. Além disso, um extenso repositório de informação biológica e ferramentas moleculares, que vão desde padrões de expressão gênica para morfolino- sequências e protocolos, foram progressivamente anotada na Rede de Informação de peixe-zebra (ZFIN) ^11/09. Estas infra-estruturas de investigação de peixe-zebra tem sido possível graças ao apoio significativo NIH e defesa deste modelo animal ^8. Esse cache de mutantes de peixe-zebra, linhagens transgênicas, e informações pertinentes continua a ser de valor excepcional para a comunidade de pesquisa biológica em geral. No entanto, enquanto peixes-zebra são agora um organismo modelo bem estabelecido e pré-eminente, eles representam a largely reservatório inexplorado de estudar a biologia do desenvolvimento e da doença através do uso de telas genéticos químicos.

Genética química é o uso de pequenas moléculas, tais como fármacos ou outros compostos, para afectar um processo biológico dentro de um sistema de estar ^12. Genética químicos podem ser implementadas para compreender os mecanismos moleculares da função do gene, tais como para identificar agentes que salvamento ou exacerbar um defeito genético específico ^{de 12.} Além disso, a genética químicos representa uma importante avenida para realizar pesquisa translacional ^12. Enquanto telas genéticos para a frente tradicionais em modelos animais têm sido tremendamente poderoso na ligação entre genes específicos a doenças, falta-lhes uma dimensão temporal, tornando difícil ou mesmo impossível de observar fenótipos que surgiriam após a embriogênese. Além disso, a redundância gene pode fazer dos resultados obtidos com a genética para a frente de difícil interpretação. Alternativamente, telas genéticos químicospermitir o controle temporal bem e, simultaneamente, proporcionar um valioso ponto de partida para a descoberta de medicamentos ^12,13.

Genética químicos podem ser realizados utilizando sistemas in vitro (por exemplo, linhas celulares, proteínas) ou utilizando um sistema in vivo, tal como um organismo inteiro. Usando um sistema in vitro para a genética químicos pode ser benéfico, pois é mais simples do que um sistema organismo inteiro, mais fácil de trabalhar com a grande escala, menos dispendiosa e menos demorada. Como resultado, os sistemas in vitro, tanto para permitir que a triagem de alto rendimento (HTS) e um rastreio de alto-teor (HCS). Há um número de vantagens de se utilizar um sistema in vitro que devem ser considerados quando se aproxima genética químicos, mas também limitações significativas. Uma limitação importante ao uso de uma linha celular é que as moléculas pequenas podem ser eficaz e não tóxica de uma linha celular específica, mas tornam-se tóxicos quando introduzido num organismo inteiro. Assim, o cerneda questão é que os sistemas in vitro não captam o amplo contexto de um organismo e, portanto, nem sempre são capazes de imitar com precisão o que acontece em um organismo inteiro. Embora o teste composto em organismos inteiros pode contornar esses problemas, o uso de modelos de mamíferos organismo inteiro apresenta uma série de limitações físicas e éticas. Por exemplo, a seleção da droga no mouse é logisticamente prejudicado pelo espaço e os custos necessários para testar uma amostra de dimensão adequada. Além disso, as questões de desenvolvimento podem ser difíceis de estudar, devido ao fato de que os mamíferos desenvolver no útero. Finalmente, embora a conduta da pesquisa biomédica tem valor social imenso, há, no entanto, as necessidades substanciais para proteger bem-estar animal, limitando intensos estudos e aliviar a dor eo sofrimento dos animais utilizados para pesquisa. Zebrafish proporcionar um substituto viável para trabalhar com os vertebrados superiores, como mamíferos, e, além disso, muitos temas podem ser estudados utilizando a genética químicos noos estágios embrionários e larvais quando o processamento neurológico está ausente ou operativa em um nível baixo ^12,13.

Até à data, uma miríade de telas genéticos químicas foram realizadas utilizando embriões de peixe-zebra, em particular, como a entrega composto pode ser realizado por imersão embriões em meios contendo a droga de interesse ^12-15. Além disso, tem havido inúmeros avanços científicos e tecnológicos para fazer telas genéticos químicos possível e gerenciável ^16-20. Peterson e seus colegas foram os primeiros a usar peixe-zebra em uma tela genética química em 2000, e mais tarde, em 2004, identificou um composto que suprimiu uma mutação CoAo em peixe-zebra ^21,22. Telas químicos já foram implementadas para estudar vários tecidos em desenvolvimento (por exemplo, o coração, sangue, vasos) ^23-25, funções fisiológicas (por exemplo, bases neurológicas para o comportamento) ^26, a regeneração adulto ^27,28, e diseas modelos eletrônicos (por exemplo, distrofia muscular e câncer) ^29,30. De entre essas telas químicas peixe-zebra, a descoberta de que as prostaglandinas regular as células-tronco hematopoiéticas foi levado para testes clínicos em humanos, demonstrando o poder de mover-se de "tanque de cabeceira" ^23,31-33 (NIH, Trials.gov Clínica, NCT00890500; NCT01627314). Mais recentemente, prometendo terapêutica candidatos surgiram para órgãos complexos como o rim, que remediar patologia celular na doença renal policística (PKD) ³⁴ e lesão renal aguda ^27,35, embora estes ainda têm de se deslocar para ensaios clínicos. Estas telas genéticos químicos amplamente demonstrar a utilidade de testar compostos pequenos no peixe-zebra desenvolvimento ea capacidade de aplicar genética químicos para interrogar a função do tecido adulto. Além disso, há uma lista crescente de coleções de farmacologia comercialmente disponíveis que estão disponíveis para estudos acadêmicos ^19.

ove_content "> Nos últimos anos, houve avanços importantes na tecnologia química triagem genética, incluindo a utilização de sistemas automatizados de robôs para dispensação e manipulação de medicamentos, juntamente com sistemas de imagem automatizados ^36-38. Tais sistemas permitem a possibilidade de testar milhares de compostos para alcançar ambos os HTS e HCS ^36-38. Infelizmente, a empresa de telas genéticos químicos com estas empresas robóticas inovadoras geralmente exigem recursos consideráveis. Estes tipos de recursos são um entrave significativo para muitas instituições que não possuem o capital para adquirir , operar e manter tal instrumentação. Ao estabelecer a infra-estrutura para o manuseio robótico de bibliotecas químicas, incluindo a transferência de embriões para vestidos placas, permanece custo proibitivo para muitos laboratórios, tratamento de imagens e análise automatizada é geralmente mais acessível ^12. screening imagem automatizada permite a quantificação de re transgénico fluorescenteporteiros e facilita a análise fenotípica específica ^12,15.

Embora os sistemas automatizados representam avanços tecnológicos úteis, muitas questões podem ser abordadas por telas manuais mais focadas, como a consulta de vários milhares de compostos biologicamente ativos em um processo de desenvolvimento com um conjunto de montagem de hibridização in situ (desejo) de leitura ^39. Além disso, enquanto um número crescente de laboratórios invocaram telas químicas peixe-zebra para investigar uma questão de pesquisa, poucos saturação (se houver) esforços têm alcançado e muitos temas ainda têm que ser quebrado usando a genética químicos. Telas químicos podem ser executados usando uma pequena colônia de peixe-zebra que consiste em apenas alguns tipo selvagem ou tanques de transgênicos. Portanto, essa forma de interrogatório genética deve ser atingível pela maioria dos grupos de pesquisa do peixe-zebra interessados ​​em expandir / diversificação para esta arena. Bibliotecas químicas de tamanhos variados podem ser adquiridos a partir de um distribuidor comercial e / ou collaborators. Por estas razões, a genética químicos pode ser economicamente viável, mesmo em climas de financiamento duras. No entanto, existem obstáculos para começar uma tela genética químicos, tais como a forma de planejar os aspectos logísticos da tela: por exemplo, o número de pessoal necessário para uma tela bem sucedida, a colocação de tempo dedicada e montando um protocolo físico manualmente amostras de processo o número das centenas a vários milhares. Aqui, nós pormenor um protocolo de alto rendimento manual para realizar genética químicos no embrião do peixe-zebra com o desejo como uma leitura. Este método envolve o tratamento de embriões de peixes-zebra de droga, seguida por detecção ribossonda de transcritos de mRNA. Usando este protocolo, uma pequena equipe ou mesmo um indivíduo pode razoavelmente tela e analisar uma biblioteca química modesto aproximadamente 600 compostos no período de 9 semanas.

Protocol

Os procedimentos para trabalhar com peixe-zebra descrito aqui foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade de Notre Dame. Um guia para o projeto de pesquisa para este manual tela pequena molécula no peixe-zebra é fornecida (Figura 1). Uma visão geral das metodologias descritas no presente protocolo é fornecido como um fluxograma (Figura 2). Por favor consulte o sistema de rotulagem exemplo (Figura 3) para planear as etapas de processamento de embrião descritos nas Partes 4-10. Para o desenvolvimento do embrião, por favor, consulte a Série encenação zebrafish ^40, e para a preparação de ribosondas antisense DESEJO utilizado em peças 10/09, referem-se a métodos publicados recentemente ^41.

1. Preparação de peixe-zebra acasalamento Chambers

1. Coloque um peixe-zebra adulto masculino e um peixe-zebra fêmea adulta em uma câmara de acasalamento, separados pelo divisor de câmara O / N.
   NOTA: acasalamentos em massa, como ums aqueles que utilizam grupos de 2-3 fêmeas e machos de 2-3 pode gerar mais embriões individuais em comparação com acasalamentos emparelhados, e pode ser realizado utilizando câmaras de acasalamento de tamanho apropriado.
2. Repetir o Passo 1.1 de tal modo que um total de 25 pares de peixe-zebra são set-up para cada placa de 96 poços de pequenas moléculas que vão ser testadas.

2. Coleta de embriões de peixe-zebra

1. No dia seguinte, retire a divisória que separa cada par de peixe e depois de 1 hora, recolher embriões de peixe-zebra usando uma peneira de malha fina e colocá-los em uma placa de Petri contendo meio de embrião E3 (ver lista de materiais para a receita).
   NOTA: Coleta de embriões após 1 hora garante que os embriões estão em estágios de desenvolvimento semelhantes.
2. Use uma pipeta de plástico para remover os resíduos (por exemplo, alimentos e resíduos sólidos). Em seguida, use uma lupa para observar cada ninhada de embriões e remover quaisquer ovos não fertilizados.
3. Decantar a mídia embrião E3 e substituir por nova E3, em seguida, coloque cada dish de embriões em uma incubadora de 28,5 ° C. Depois de 2 horas observar cada ninhada de embriões usando um microscópio estereoscópico e remover quaisquer ovos não fertilizados.
   NOTA: Os ovos não fertilizados podem envenenar outros embriões e vai aparecer para estar no estágio de célula única ou opaco.
4. Continue a acompanhar o progresso do desenvolvimento dos embriões usando um microscópio estereoscópico até atingirem 40% epiboly. Observe a forma de esfera do embrião que parece ser composto por duas camadas separadas na fase epiboly 40% ^40.

3. Chemical Diluição Preparação

1. Remova a placa de biblioteca química de armazenamento a -80 ° C, cobrir com folha de alumínio e descongelar à temperatura ambiente.
   NOTA: Diferentes bibliotecas irá descongelar em diferentes taxas dependendo principalmente do solvente a ser utilizado. Tipicamente, uma biblioteca química congeladas a -80 ° C irá ser completamente descongelado em cerca de 3 horas à temperatura ambiente. Placa (s) descongelamento loja em um local seguro com rotulagem de materiais perigosos apropriado. Usar umeyewear ppropriate, uma bata de laboratório, e dois conjuntos de luvas ao manusear produtos químicos.
2. Use uma pipeta multicanal de 8 canais para adicionar 99 mL de E3 em colunas 12/02 de uma placa de 96 poços.
   NOTA: A partir de nossa experiência, uma gama adequada de drogas início é entre 10 mM - 50 mM, e também conforme descrito nos protocolos atuais ^39. Aqui demonstramos um tratamento 10 mM se estiver usando uma biblioteca química placa estoque 1 mM.
3. Use uma pipeta multicanal de 8 canais para adicionar 1 ml de cada composto ao seu respectivo bem com E3.
4. Usar uma pipeta de 1 a P10 ul de DMSO (ou o solvente apropriado) na coluna de controlo (aqui, coluna 12).
5. Cobrir a placa de diluição química com folha de alumínio, como a folha de alumínio irá proteger quaisquer compostos sensíveis à luz na biblioteca, e devolver a placa biblioteca de materiais químicos para a temperatura de -80 ° C durante o armazenamento.

4. arraying embriões Zebrafish

1. Escolher uma placa de Petricontendo embriões de peixe zebra na fase de epiboly 40%. Usando uma pipeta de transferência, coloca cuidadosamente cerca de 10 embriões dentro de cada poço de uma (1,1 ml) de profundidade placa de 96 poços. Dispensar embriões em colunas 2-12 da profunda placa de 96 poços.
   NOTA: O pesquisador deve selecionar o ponto de tempo de adição de drogas que está melhor adaptado para o processo de desenvolvimento que pretendem interrogar. A utilização de uma pipeta de transferência de plástico pode minimizar o dano embrião. Como o tratamento de drogas antes de 40% epiboly pode resultar em aumento da mortalidade do embrião, desenvolver os embriões por mais tempo antes da exposição à droga, especialmente quando os processos posteriores de desenvolvimento estão sendo examinados. Colocando mais de 15-20 embriões em cada poço pode levar a um atraso no desenvolvimento devido à aglomeração e deve ser evitado. É importante notar que a profundidade placa de 96 poços contendo os embriões é diferente da diluição química placa de 96 poços.
2. Usar uma pipeta de transferência de vidro para remover o excesso de E3 de cada poço, e expelir o excesso de E3 emum recipiente de resíduos líquidos.
   NOTA: Este processo demora tipicamente de 30 minutos a 1 hora dependendo da velocidade do investigador, de modo que os embriões são entre 50% e 60% por epiboly conclusão, que é o estágio de desenvolvimento alvo para além da diluição química descrita aqui. A placa pode ser inclinado a um ângulo de 45 ° para fazer com que os embriões para cair para o fundo do poço de modo a que a ponta da pipeta pode ser pressionado contra o fundo do poço para retirar o excesso de E3.

5. A adição de tratamentos químicos

1. Use uma pipeta multicanal de 8 canais para transferir as 100 diluições químicas ul aos seus respectivos poços no fundo placa de 96 poços contendo embriões de peixe-zebra dispostas.
   NOTA: Assegurar que a localização original bem do composto corresponda com a localização do poço profundo na correspondente placa de 96 poços (por exemplo, a localização B1 poço na placa de diluição química é pipetado para o local B1 bem no fundoPlaca de 96 poços).
2. Umedeça uma toalha de papel e coloque-o em um recipiente sensível à luz suficientemente grande para conter uma placa de 96 poços.
   NOTA: A toalha de papel molhada vai ajudar a evitar a evaporação da diluição do produto químico.
3. Em seguida, use um tapete de vedação para selar o fundo placa de 96 poços, coloque-o em um recipiente sensível à luz, e incube-o em 28,5 ° C.
   NOTA: Deixe os embriões de peixe-zebra desenvolver até a manhã seguinte. Alternativamente, deixar os embriões desenvolver até o estádio de desenvolvimento apropriado para o processo a ser analisada.

6. Eliminação de Substâncias Químicas

1. Usar uma pipeta de canais múltiplos de 8 canais para adicionar 300 ul de E3 para cada linha dos poços tratados com fármaco. Desenhe e descartar a diluição / química E3 de cada linha de poços. Lavar os embriões 3 vezes com 300 ul de E3.
   NOTA: Descarte droga-lixo em um recipiente rotulado utilizados apenas para esta finalidade. Para facilidade de lavagens, use uma bacia de vidro cheio de E3 ampla o suficiente para usar o multIChannel pipeta.

7. Pronase e Fixação embriões Zebrafish

1. Transferência de embriões de peixe-zebra, utilizando uma pipeta de plástico em quatro placas de 24 poços, em seguida, remover todos os embriões mortos. Rotular os poços 24 para que eles correspondem às localizações bem droga originais. Coloque a pipeta em frente de um fundo escuro após cada poço transferência para visualizar a pipeta em embriões e para evitar embrião bem cruzado.
2. Usar uma pipeta de transferência de plástico para retirar E3, de modo que os embriões são praticamente submerso no líquido.
3. Usar uma pipeta de vidro para adicionar 2 gotas de estoque de pronase (50 mg / ml) a cada poço. Vamos incubar os embriões em pronase durante 5 min e, em seguida, agitar os poços para fazer com que o cório se quebre. Alternativamente, pronase os embriões antes que eles estão no estágio de desenvolvimento desejado para análise.
4. Usar uma pipeta de transferência de plástico para lavar os embriões duas vezes com E3.
5. Uma vez que os embriões estão na fase de análise desejado, completely aspirar e eliminar o restante E3.
6. Usar uma pipeta de transferência de plástico para adicionar fresco 4% PFA / PBS a cada poço. Incubar os embriões a 4 ° CO / N para corrigir. Use recém-descongelado PFA para corrigir inicialmente embriões.
   NOTA: Vá para realizar o seu ensaio tela de interesse. Detalhado aqui nas Seções 10/08 é um procedimento para processar chapas de tela com desejo. Métodos alternativos podem ser substituídos, como desejado, em seguida, vá para a Seção 11 e avaliar os resultados.

8. Embryo Permeabilização

1. Usar uma pipeta de transferência de plástico para a tiragem de 4% PFA / PBS a partir dos embriões e lavar os embriões duas vezes com 1x (solução salina tamponada com fosfato-Tween) PBST. Transferir os embriões em placas de 48 poços, depois aspirar a 1x PBST dos embriões. Rotular os poços 48 para coincidir com os locais bem originais da profunda placa de 96 poços.
2. Lave pela adição de 100% de metanol para os poços utilizando uma pipeta de plástico, em seguida, retirá-lo e adicionar 100% metanotaxoll novamente para os embriões.
3. Colocar os embriões a -20 ° C, e incubar durante pelo menos 20 min. Alternativamente, manter os embriões em 100% de metanol a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
4. Remover o metanol 100% e lavar os embriões com 50% de MeOH / 1x PBST, em seguida, 30% MeOH / 1x PBST, e, finalmente, duas vezes com PBST 1x.
   NOTA: Os embriões mais velhos do que 24 horas após a fertilização (hpf) pode ser branqueada neste momento para remover a pigmentação ^39.
5. Adicionar 15 ul de proteinase K estoque descongelado (10 mg / ml) a 50 ml de 1x PBST para se preparar uma proteinase K (5 ug / ml) solução de trabalho.
6. Remover o 1x PBST a partir dos embriões e adicionar a solução de trabalho de proteinase K. Remover a proteinase K após 4 min.
   NOTA: O experimentador deve trabalhar rapidamente durante este passo para evitar a degradação do embrião. Concentração de proteinase K e período de incubação devem ser variada dependendo da idade dos embriões a ser tratado ^41. Os parâmetros descritos aqui referem-se a embriõesque são 24 hpf.
7. Lave os embriões com 1x PBST, em seguida, adicione gelada 4% PFA / PBS. Vamos incubar os embriões em PFA a 4% / PBS durante 20 min à temperatura ambiente.

9. Sonda de hibridação e de remoção

1. Usando uma pipeta de vidro de transferência de remover a 4% PFA / PBS e lavar os embriões duas vezes com PBST 1x. Substituir o PBST 1x com 500 ul de HYB ⁺ e incubar os embriões durante 4 horas a 70 ° C.
   NOTA: Pré-hibridação pode ser realizada por tão poucos como 2 horas, 4 horas, mas é ideal. Além disso, diferentes temperaturas de hibridação e lavagem podem ser ideal para certas sondas, tais como 65 ° C, mas deve ser testado numa base individual.
2. Gerar ribossondas marcadas com digoxigenina correspondentes ao gene (s) de interesse ^41.
3. Adicionar 16 ug de ribossonda para 16 ml de HYB ^+. Pré-aqueça o ribossonda / ⁺ HYB solução a 70 ° C durante pelo menos 20 minutos antes de usar. Se estiver usando várias sondas, adicione 16 g de cada sonda com o mesmo HVolume de YB ⁺ (16 ml).
4. Usando uma pipeta de transferência de vidro, remova o HYB ⁺ e usar um P1000 para adicionar 200 ul da ribossonda / ⁺ HYB mistura. Inverta a ribossonda / HIB ⁺ cocktail imediatamente antes da utilização e pipetar para cima e para baixo uma vez, antes de adicionar a mistura em cada poço. Utilizar pontas de pipetas de barreira para adicionar a ribossonda / ⁺ solução HYB, isso impede que o vapor de mistura de entrar na pipeta.
5. Incubar os embriões no riboprobe / HIB ⁺ cocktail a 70 ° CO / N. Utilize uma película adesiva para cobrir os poços da placa para o O / N a incubação da sonda e todos os seguintes lavagens quentes.
6. Prepare 50% formamida / 2x SSCT, 2x SSCT e 0,2x SSCT e pré-quente a 70 ° CO / N.
7. Usando um P1000, remover a ribossonda / HIB ⁺ e armazenar a mistura a -20 ° C. Opcionalmente, re-utilizar o riboprobe / HIB ⁺ mistura até três vezes. Antes de cada reuso, adicionar em 3 mg de riboprobe ao ribopr originaisobe / HIB ⁺ mistura.
8. Usando uma pipeta de transferência de vidro, lava-se duas vezes com embriões formamida a 50% / 2x SSCT durante 30 min a 70 ° C. Lavar os embriões uma vez com 2x SSCT durante 15 min a 70 ° C. Lavar os embriões duas vezes com 0,2x SSCT durante 30 min a 70 ° C. Remover o SSCT 0,2x e lavar os embriões com MABT duas vezes à TA.

10. Anticorpo Anti-digoxigenina Incubação e detecção

1. Usar uma pipeta de transferência de vidro para remover o MABT de cada poço. Usando uma pipeta de transferência de plástico, adicionar solução fresca do bloco para cada poço. Vamos incubar os embriões em bloco durante 4 h à TA. Adicionar 8 mL de anticorpo anti-digoxigenina a 40 ml de solução de bloqueio (diluição de 5000 vezes).
2. Usando uma pipeta de plástico, substitua a solução bloco com a solução de anticorpo / bloco. Adicionar solução de anticorpo / bloco suficiente para cobrir completamente os embriões.
3. Cubra a 48 placa bem com papel alumínio, de modo que nenhuma luz pode penetrar através de embriões. IncUbaté os embriões O / N a 4 ° C. Usando uma pipeta de vidro, remover a solução de anticorpo / bloqueio e lavar os embriões 10 vezes com MABT durante 5-10 min cada.
   NOTA: As lavagens MABT pode ser realizada de forma contínua, uma vez que irá levar o pesquisador 5-10 min para remover MABT de cada placa e dispensar MABT fresco para dentro dos poços.
4. Gerar dois tubos de 40 ml (80 ml no total) de tampão de pré-coloração. Adicionar 180 ul de NBT (50 mg / ml) e 140 ul de BCIP (50 mg / ml) a um dos tubos preparados de tampão de pré-coloração para criar a solução de coloração.
   NOTA: Esta solução de coloração irá gerar um substrato de cor púrpura.
5. Substituir o MABT com tampão de pré-coloração e deixar os embriões incubar à TA durante 5 min.
6. Substituir o tampão de pré-coloração com a solução de coloração e deixe em temperatura ambiente. Monitorar a reação colorimétrica cada 15 minutos usando um microscópio estereoscópico.
   NOTA: reações manchando pode levar de alguns minutos a várias horas, dependendo da sonda.
7. Repate a solução de coloração com 1x PBST após a reacção de coloração é completa e, em seguida, lavar os embriões duas vezes com 1x PBST, durante 5 min.
8. Retire a 1x PBST e adicione 4% PFA / PBS para fixar os embriões.
   NOTA: Como alternativa, realizar um desejo duplo para detectar ribosondas marcados com um anticorpo anti-fluoresceína. Se a execução de uma dupla in situ, pular adição de 4% PFA / PBS (Passo 10.9) após a lavagem 1x PBST (Etapa 10.8) e lavar os embriões duas vezes durante 15 min com 0,1 M de glicerol, duas vezes durante 15 minutos com lavagens MABT, e, em seguida incubar os embriões para 30 minutos em quadra. Em seguida, adicione no anticorpo correta O / N e realizar Passos 10,3-10,9 usando a solução de coloração correta. Para detectar a ribossonda marcada com fluoresceína, preparar uma solução de coloração com BCIP e INT para observar um substrato vermelho (Passo 10.1).

11. Pontuação das Placas Embrião tela Chemical

1. Realizar pontuação visual dos resultados utilizando-se um estereomicroscópio para avaliar o embrião SAMPLes no ensaio de fenótipo.
2. Usando uma pipeta de transferência de plástico, transferir os embriões a partir das placas de poços 48 para placas de 12 poços para melhor visualização. Rotular os poços 12 para que eles correspondem às localizações bem da profunda placa de 96 poços original. Quando a transferência estiver completa, ver sob o microscópio estereoscópico.
   NOTA: embriões representativos pode ser selecionado a partir de placas de 12 poços e fotografada em lâminas de vidro sob uma cobertura de vidro ^41.

Results

A abordagem manual aqui descrito permite a um único pesquisador de forma eficiente e com sucesso para realizar uma high-throughput pequenas genética químicos da molécula tela utilizando o modelo de embrião do peixe-zebra (Figura 1). Usando este método, é prático para uma única pessoa para executar uma tela genética químicos, de modo que, ao longo de nove semanas uma pessoa (o compromisso de uma semana de trabalho de 40 horas) pode realizar um levantamento de aproximadamente 600 compostos (Figura 1) . Assim, o tempo de banco de uma pessoa pode ignorar a necessidade de equipamentos de alta exigência de recursos, sistemas automatizados como. O trade-off é que uma tela manual necessita de várias semanas de esforço dedicado. Em contraste, o uso de sistemas automatizados pode comprimir o tempo envolvido em 1-2 semanas de tempo de robótica, e pode implicar esforço relativamente mínima pesquisador global. Uma maneira de aumentar a eficiência e / ou extensão de uma tela manual é se alistar 2-3 pesquisadores, no total, o que permitiria a triagem de mcompostos de minério, a concentração de composto variando, e / ou triagem durante um período de tempo mais curto.

Os passos principais envolvidos no protocolo para completar uma tela genética em embriões de peixe-zebra químicos com um desejo de leitura são ilustrados como um fluxograma (Figura 2). As tarefas experimentais podem ser divididos em dois tipos de semanas de trabalho: (1) exposição a produtos químicos e de rotulagem do embrião, e (2) de análise e de imagem. Na semana de trabalho exposição a substâncias químicas, estas medidas incluem a criação de adultos peixe-zebra (dia 1), coleta de embriões, embriões arraying e tratamento da toxicodependência (dia 2), preparando embriões para hibridização in situ (dia 3) e hibridização in situ (Dia 4 -6). Na semana análise / criação de imagens, o pesquisador analisa a expressão do mRNA para marcar embriões e hits de imagem (dia 11/07).

Uma parte crítica de realizar uma tela genética química é consistente e precisa marcar bem os locais. Como a tela genética químicos processo detalhado aqui envolve a transferência de conjuntos de embriões a partir de um poço de uma placa para um poço numa placa várias vezes diferente, a necessidade de rotulagem precisa e clara é primordial, de modo que quando um acerto química é marcado pode ser linear e facilmente rastreada a sua identidade dentro da biblioteca química (Figura 3). Uma maneira fácil de assegurar isto é a rotular as placas de tal modo que a qualquer momento a localização do poço para um conjunto de embriões tratados por um composto corresponde directamente a biblioteca placa droga bem localização do composto utilizado para tratar os embriões química (figura 3). Aqui, um duplo sistema de etiquetas de codificação de cores e numéricos é utilizado para organizar as amostras, que foram adicionados às placas de tela usando marcadores permanentes (Figura 3).

Ao analisar os resultados de um rastreio de elevado rendimento, há uma necessidade crítica de desenvolver um método para organizar correctamente, anotar e analisar o potencial pequena moléculasucessos. Por isso, uma tela genética químicos devem ter um sistema de classificação completa e clara que é cuidadosamente projetado e rigorosamente respeitados. Tal sistema deve ser facilmente e completamente transmitir a dinâmica importantes de um composto e fornecer uma maneira concisa para apresentar os resultados da tela acabado. Uma maneira de construir um sistema desse tipo é a embriões de grau, utilizando um sistema de classes, o que explicaria a gravidade morfológica geral e confiança de um hit. Além disso, as categorias de classe pode ser acoplado com um ⁽⁺⁾ ou ^(-) para descrever tanto um efeito expansivo ou redutor sobre a região (s) de interesse. Aqui, os embriões de peixes-zebra foram submetidos a compostos individuais de uma biblioteca bioactivo (Enzo Chemicals) a partir de 50 a 24% epiboly hpf, e, em seguida, ensaiadas por deseja usando um cocktail de três ribossondas para detectar segmentos de nefrónios (Figura 4A). Como um sistema de classificação exemplo, um poço que contém um grupo de embriões que tinham um convolu proximal alargada dramaticamenteted túbulo (PCT) das pronephros, o rim embrionário do peixe-zebra, iria fazer com que o composto utilizado para tratar a que assim seja classificado como (Classe I), que neste caso seria representam a classe associada com o defeito mais severa e mais alto nível de confiança no fenótipo observado (Figura 4B). O composto pode então ser anotado com (PCT) e A ^(+), sendo a notação completa (Classe I - PCT ⁺⁾ (Figura 4B). Este conceito de classificação proporciona uma maneira simples e rápido para descrever um tesouro de informação relativa a uma pequena molécula de interesse, incluindo a gravidade do efeito de compostos sobre o organismo, a região que é afectado pela droga e da maneira em que a região é afectada (Figura 4B).

Figura 1. & #160;. Manual de estratégia tela química embrião de peixe-zebra Um pesquisador puderem testar uma placa de 96 poços de produtos químicos em embriões de peixe-zebra e executar o processamento DESEJO posterior durante uma única semana. Execução de duas semanas de testes químicos (Semana 1 (dia 06/01) e Semana 2 (dia 12/07)) pode ser emparelhado com uma terceira semana dedicada a provar análise. Cerca de duas placas de 96 poços no valor de amostras de tela pode ser marcado e fotografada Semana 3 (dia 13-17). Este cenário eleva-se a o rastreio de aproximadamente 200 compostos num período de tempo de três semanas, o que equivale a uma pequena biblioteca de aproximadamente 600 compostos completamente visionados em 9 semanas. Esta estratégia manual pode ser modificada dependendo dos recursos disponíveis. Por exemplo, três pesquisadores pode reduzir o tempo para completar uma tela de aproximadamente 600 compostos de três semanas, em comparação com as nove semanas que levaria com um pesquisador. Estratégias de triagem pode ser adaptado através da atribuição de pesquisadores para aspectos específicos da tela, como tratamento de drogasmento e hibridação in situ ou direcção de investigadores, independentemente, para executar todo o processo de triagem em partes separadas da biblioteca química.

Figura 2. Fluxograma:. Quebra de fluxo de trabalho de tela 6 dias O processo de triagem química pode ser discretamente dividido em seis dias. Dia 1 consiste em criar pares de acasalamento do peixe-zebra (= /> 25) para fornecer embriões para cada placa de 96 poços para ser exibido. Dia 2 envolve a recolha de embriões a partir das câmaras de acasalamento e arraying-los em uma placa de 96 poços profundos, seguido por tratamento de droga. No Dia 3, os embriões estão preparados para desejar, incluindo dechorionation, fixação do tecido, e desidratação do embrião. Por fim, desejo é realizada em embriões com o dia 06/04. Por favor, note que os procedimentos de coloração alternativas sobre espécimes fixados pode ser prontamente substituted para DESEJO.

Figura 3. Placa rotulagem transferência esquemática. Embriões de peixe-zebra são agrupadas e tratados com fármaco em uma placa de 96 poços, em seguida, transferida para uma placa de 24 poços para a remoção de detritos e exposição de pronase. Os embriões são, então, mudou-se para placas de 48 poços para a preparação embrião, desejo, e fixação do tecido. Em seguida, os embriões são transferidos para placas de 12 poços de pontuação, de imagem e armazenamento. Arraying precisa de embriões é realizado através da utilização de um sistema de codificação de cores que permite ao pesquisador a manter o controle do produto químico de origem para cada amostra de teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Exemplo de sistema de classificação:. Ensaio segmentação renal A experiência DESEJO permite que o pesquisador manchar tipos específicos de células com base na identidade das sondas que são selecionados, permitindo a avaliação das alterações nos fenótipos de embriões de acordo com mudanças de local de transcrição do mRNA e / ou níveis. Como um exemplo, três segmentos do rim embrionário do peixe-zebra, os pronephros, foram marcadas usando mistura de tela 1. Mistura de tela 1 é um cocktail de sondas consistindo de wt1b, que se localiza especificamente nos podócitos (P), que marca o slc20a1a convoluto proximal túbulo (PCT), e slc12a1 que rotula o segmento de ⁴⁷ distal precoce (DE). Um símbolo ⁽⁺⁾ ao lado de uma região da etiqueta é usada para anotar a expansão ou mudança positiva de que a região, enquanto que a ^(-) é usado para ditar a diminuição de uma região. Aqui, EMbryos droga tratadas com 13-cis RA tem um túbulo convoluto proximal alargada e uma perda completa do segmento início distal com nenhum efeito aparente sobre os podócitos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Genética químicos no peixe-zebra pode ter um impacto crítico sobre a evolução da descoberta de medicamentos. Este protocolo fornece um método de alto rendimento manual para realizar genética em embriões de peixe-zebra químicos com um desejo de leitura, de forma eficaz permitindo um indivíduo ou pequena equipe para realizar uma pequena tela molécula. Este método mínima estende-recurso a viabilidade da genética químicos de muitos grupos de investigação. Especificamente, esta estratégia tela fornece uma alternativa importante para o uso de instrumentação robótica, como tais sistemas não são amplamente acessíveis em todos os departamentos de pesquisa. Esta tela Manual permite que um único indivíduo para testar uma placa de 96 poços de compostos com uma leitura DESEJO em uma semana de trabalho de 6 dias. Desde peixe-zebra são ovíparos, com os embriões em desenvolvimento fora do pais, e os embriões são grandes o suficiente para ver a olho nu (entre 1-3 mm), eles são passíveis de tratamento manual com instrumentos simples e o pesquisador pode amostras de matriz emplacas multi-poços sem o uso de um microscópio. Além disso, como peixe-zebra se desenvolvem rapidamente, pequena molécula de exposição pode ser eficaz com um único tratamento de um composto, em vez de doses repetidas, o que minimiza ainda mais o processamento manual. Embriões de peixe-zebra são facilmente cultivadas porque sua gema é uma fonte de alimentação até 5-6 dias após a fertilização, o que elimina a complicação de alevinos de alimentação. Além disso, a maioria dos órgãos de larvas desenvolveram-se e tornar-se funcional durante este período, o que proporciona a oportunidade de estudar uma grande variedade de questões de pesquisa. A simples adição de moléculas pequenas para o meio de incubação de embriões é não-invasiva e permite ao pesquisador (s) para seleccionar, para a dose da droga, o tempo de adição e da duração da exposição, assim, proporcionando um controlo apertado sobre muitas variáveis ​​e permitindo que os processos de desenvolvimento específicos de juros a ser consultado. Conforme descrito aqui, a produtividade de pesquisa significativa pode ser alcançada em um curto timeframe utilizando esta metodologia tela manual. Em nossa experiência, há um alto retorno sobre o esforço investido, que pode ser acentuada por meio de uma biblioteca química bioativa conhecido para analisar um processo de interesse, tais como a segmentação de néfrons durante o desenvolvimento renal (Figura 4; Poureetezadi e Wingert, não publicado).

A tela química manual descrita aqui é excepcionalmente versátil, pois envolve um ensaio em amostras de peixe-zebra fixos. Por exemplo, esta estratégia pode ser revista para testar várias placas de compostos em uma semana e, em seguida, para marcar embriões na semana seguinte. Ensaios alternativos em amostras de peixe-zebra fixos, tais como coloração imuno-histoquímica ou outro tecido preparações, também pode ser substituído por o desejo de leitura. Estratégias experimentais para realizar ensaios celulares em peixe-zebra são adaptáveis ​​devido à claridade óptica e transparência dos primeiros estágios de desenvolvimento. Além disso, os pesquisadores podem inibir a pigmentação na tarde stages uso de produtos químicos ou evitar a complicação de desenvolvimento pigmento completamente através do uso de linhas genéticas-pigmento menos como casper ou pura zebrafish ^13. É possível administrar manualmente pequenas moléculas, processar a mancha (s) de interesse, e para marcar manualmente embriões utilizando uma lupa simples. No entanto, é importante ter em mente que a análise de imagem automatizada pode ser realizada, e pode de facto ser necessário para análise de fenótipo alta resolução. Por exemplo, pode ser preferível para parceiro de um sistema de análise de imagem automatizada, com um ensaio directo, tal como um repórter transgénico, como esta simplifica o processamento manual das amostras, quantifica as diferenças não são facilmente discerníveis a olho nu, e elimina pesquisador viés ^15. Felizmente, alguns sistemas de imagem automáticos são ambos amigável e econômica em termos de custos de software ^15. O uso e capacidades de outros sistemas automatizados têm evoluído rapidamente e podeser usado para orientar os organismos, administrar tratamentos com drogas, e até mesmo para mudar organismos ^12,15. Estes sistemas automatizados ter anunciado uma nova era tecnológica de investigação e de ter fornecido soluções inovadoras para manipular grandes quantidades de assuntos de teste e, assim, realizar HTS e HCS abordagens em organismos inteiros ^12,15. Embora tais máquinas são inegavelmente ferramentas úteis, eles também são muito caros e estão fora do alcance de muitos laboratórios de pesquisa básica. Sem o acesso a estes recursos automatizados, pode parecer que as telas químicas não são possíveis. No entanto, este protocolo descreve um guia de como realizar uma tela manual que pode ser usado para completar uma tela genética química de uma forma prática ao longo de um período de tempo razoável.

Existem desvantagens para ambos os de triagem e químicas genética manuais em geral, e deve ser mantido em mente quando se considera uma tela química. Em particular, o método demonstrado aqui exige um grau moderadode destreza física. Esta preocupação é diminuída ou totalmente evitado através da repetição, como destreza irá melhorar com a prática. Além disso, há espaço mínimo para erro grosseiro, uma vez que existem apenas 10 embriões por bem para análise. Pequenas moléculas podem variar de penetrância do fenótipo que é induzida, portanto, um regime de pontuação razoável para identificar compostos de interesse devem ser respeitados. É vital que os pesquisadores que utilizam este protocolo elaborar critérios adequadamente rigorosos para o que eles vão considerar um sucesso. É também importante ter em mente que a natureza desta forma de tela provavelmente irá produzir uma certa porção de falsos positivos, o que pode ser ainda mais demarcados química work-up. Além disso, é crítica para a fase precisamente embriões e para recolher garras para triagem logo após a fertilização, como o desenvolvimento assíncrona pode levar a complicações para avaliar com precisão o efeito de tratamentos com drogas. Além disso, no que diz respeito ao rastreio químico como um experimental estratégia, há uma série de limitações. Composto solubilidade e toxicidade das moléculas transportadoras (por exemplo, dimetilsulfóxido (DMSO)) também pode apresentar um problema e pode ser proibitivo em testar muitas moléculas. O córion também pode atuar como barreira à exposição da droga. Finalmente, apesar do peixe-zebra é um poderoso modelo e de translação para a genética químicas, cuidado deve ser sempre levada ao determinar se uma estratégia alternativa tela química, por exemplo, utilizando um sistema in vitro, tais como uma linha celular, pode ser substituído pelo uso de toda animais. No entanto, o tratamento químico em todo o sistema do peixe-zebra é considerada preferível para a realização de abordagens semelhantes em mamíferos, uma vez que proporciona a vantagem de reunir os efeitos sistémicos dos compostos e pode permitir aos investigadores para fazer a triagem da lista dos compostos a serem testados em um modelo de mamífero.

Até à data, as telas de peixe-zebra químicos têm fornecido uma ferramenta poderosa t experimentalo delinear os mecanismos de desenvolvimento e para verificar agentes farmacológicos candidatos para uso em medicina, tais como a identificação de moléculas capazes de prevenir patologias de doenças. Por exemplo, um estudo realizado por Burns e seus colegas desenvolveram um ensaio micro-bem automatizado para a frequência cardíaca utilizando embriões de peixes-zebra transgénicos que expressam GFP no miocárdio ^42. Eles usaram esta linhagem transgênica para analisar a freqüência cardíaca em desenvolvimento e como ela foi afetada após o tratamento medicamentoso ^42. Outro estudo, testando a densidade populacional de células-tronco hematopoéticas no embrião de peixe-zebra, identificou-se que a prostaglandina E2 regula o nicho HSC ^23. Este achado foi validado no rato, e mais tarde foi implementado para testes clínicos em humanos transplantes de cordão umbilical ^23,31-33 (NIH, Trials.gov Clínica, NCT00890500; NCT01627314). Através de inúmeros estudos recentes, a genética químicos tem provado ser útil no estudo da doença renal utilizando o peixe-zebra 43. O rim do peixe-zebra fornece um excelente paradigma para estudar nefrogênese ou regeneração do nefrónio, a unidade funcional que compreendem o rim durante o desenvolvimento e lesão renal aguda ^43. Nephron estrutura é altamente conservada entre o rim embrionário do peixe-zebra e o rim de mamífero adulto ^44-50. Vários estudos examinaram a rim de embrião de peixe-zebra ilustram claramente o seu potencial translacional inerente quando juntamente com a genética químicos. Uma tela genética química foi realizada em dois mutantes de peixe-zebra que foram mapeados para a PKD2 e ift172 genes, que são conhecidos por serem os principais intervenientes na doença renal policística (PKD) ^34. A tela resultou na identificação da desacetilase de histona-panela (HDAC) inibidor tricostatina A (TSA) como uma pequena molécula que podem anular os defeitos morfológico normalmente vistos nos embriões mutantes. Uma abordagem diferente tomada por de Groh e colegas selecionados para compostos que Inducedema ed em embriões de peixe-zebra do tipo selvagem, o que indicaria uma perturbação da função renal ^35. Depois de identificar PTBA como um sucesso, eles observaram que para além de causar edema, ABT também aumentou a expressão de pax2a, um marcador para células progenitoras renais. É importante ressaltar que um derivado otimizado de PTBA foi então mostrado para diminuir a porcentagem de mortalidade de peixe-zebra adulto que sofreu lesão renal induzida por gentamicina e, além disso, acelerou a recuperação de ratos que sofriam de dano renal ^27. Tomados em conjunto, estes contribuições de genética química de peixe-zebra mostrar os tipos de descobertas que podem ser feitas utilizando o método descrito no presente protocolo.

Embora a genética químicos pesquisa traz mérito substancial, não é sem alguns desafios. Unicamente utilizando uma abordagem genética químicos pode tornar complicada para determinar o gene ou genes específicos que estão a ser afectadas por um composto. Mesmo se um alvo (s) é encontrado, um significant lacuna pode permanecer entre a identificação de compostos e a compreensão do mecanismo (s) de acção em que a pequena molécula comporta. Por exemplo, ela pode ser difícil de determinar o mecanismo em que uma molécula pequena, porque está a actuar um único composto é capaz de ter uma gama de efeitos diferentes dentro de um organismo. No entanto, com o advento de novas tecnologias e telas genéticos mais químicos em fase de conclusão no peixe-zebra, o problema de determinar um mecanismo está encolhendo. Um método para ajudar a determinar os efeitos moleculares de compostos identificados consiste em seleccionar uma biblioteca de fármacos de bioactivos conhecidos para triagem, onde os mecanismos pode ser deduzida a partir de dados potencialmente anteriormente anotados. Além disso, os algoritmos chemoinformatic, como Descoberta portão, estão disponíveis para o uso que se possa comparar semelhanças estruturais de um composto contra um banco de dados de compostos com mecanismos atribuídos ^14. Ainda outra maneira para elucidar o mecanismo de um composto seria gerar uma microarray perfil após o tratamento e, em seguida, consultar este perfil em uma compilação de perfis de drogas microarray, tais como conectividade Mapa, em busca de compostos mecanicamente definidas que provocam um efeito semelhante ^14. Esta abordagem também pode ser utilizada para identificar mutantes genéticos que têm um efeito semelhante como o composto de interesse. Encontrar uma conexão entre um composto e um mutante possa sugerir que o composto funciona molecularmente a montante ou a jusante do gene relacionado, que pode ser delineada por tratamento dos mutantes com o composto e morpholinos. Outra opção seria a espectrometria de massa, que continua a tornar-se mais otimizada para peixe-zebra. Este método pode ser usado para delinear mudanças específicas de proteínas ou modificações pós-traducionais de drogas após o tratamento. Finalmente, pequenas moléculas ou mesmo bibliotecas inteiras são, por vezes, capaz de ser marcado para pull-down de parceiros de ligação. Também vale a pena notar que, embora o mecanismo de como uma pequena molécula funciona is de importação significativa, existem medicamentos aprovados pela FDA para o qual os mecanismos permanecem desconhecidos.

Apesar de peixe-zebra apresentam muitas semelhanças com os mamíferos, tanto geneticamente e fisiologicamente, ainda há um problema de passagem de droga ^14. Um estudo investigou a capacidade de cruzamento dos hits de uma tela de inibidores do ciclo celular em embriões de peixe-zebra ^50. A tela resultou na identificação de 14 hits que eram previamente desconhecido para possuir actividade do ciclo celular. Fora desses 14 compostos, 6 revelaram ter actividade do ciclo celular em ambos os ensaios de cultura de células humanas e de peixe-zebra, 3 mostraram-se soro inactivado em ensaios de cultura de células, foi de 1 activo apenas em células de peixe-zebra, e 4 não teve actividade em nenhum peixe-zebra ou ensaios de cultura de células humanas, mas apenas em todo o organismo do peixe-zebra. Notavelmente, os quatro compostos que só tiveram a atividade no peixe-zebra demonstrar que existem diferenças entre os peixes-zebra e mamíferos que podem prohimordeu o potencial translacional de certos compostos. Esta é uma consideração importante a ter em consideração, no entanto, há exemplos de pequenas moléculas, como PGE _2, que amplia a capacidade de HSCs para enxertar em receptores humanos e ABT-derivados que melhoram a taxa de recuperação renal em mamíferos, proporcionando assim a prova do princípio de que o cruzamento é possível ^23,31-33.

Independentemente dessas armadilhas, genética químicos e esta abordagem mínima de recursos tem muito a oferecer a comunidade de pesquisa. Genética química é particularmente útil no peixe-zebra e vai continuar a desempenhar um papel crítico na via molecular de interrogação e de descoberta de fármacos. Telas químicos baseados em alvos moleculares discretas têm sido historicamente sujeitos a uma elevada taxa de insucesso devido ao que é conhecido como a constelação de adsorção, distribuição, metabolismo, excreção, e toxicológicos (ADMET) Propriedades ^51. Químicas do peixe-zebra utilizando telas defocar um processo, em vez de um alvo discreto, pode contornar problemas vários ADMET e identificar compostos que sejam eficazes no contexto de todo o organismo. Com o aumento do pool de recursos disponíveis para a pesquisa do peixe-zebra, incluindo cepas mutantes atuais ea capacidade de utilizar a edição genoma para criar mutantes genéticos direcionados e transgênicos, há praticamente um número ilimitado de potenciais telas químicas genéticos usando zebrafish. Muitas bibliotecas químicas foram curadoria, coleções e span com bioativos conhecidos, novos compostos, estruturalmente diversas e estruturalmente semelhantes. Estes reagentes fornecer uma riqueza de oportunidades para combinações de ecrãs que estão atualmente disponíveis e tendem a crescer ainda mais nos próximos anos. Com estas possibilidades na mão, este protocolo manual e de alto rendimento fornece uma maneira prática e fácil de usar para aumentar a capacidade de grupos de pesquisa para empreender telas genéticos químicos usando zebrafish.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 - 10 μ l pontas de pipeta naturais	USA Scientific	1111-3800
1x E3			Gera usando 50x E3 e água DI.
1x PBST			Gera 0,1% Tween-20 em 1x PBS.
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
Placa de coloração de 12 poços	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
Placa de 24 poços	BD-Falcon	35-3226
4% PFA/1x PBS			Gera 4% de PFA (p/v) em 1x PBS - ferva e congele e armazene a -20 °C.
Placa de 48 poços	CytoOne	CC7672-7548
50x E3			Gera 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4, 250 mM NaCl e 8,5 mM KCl em água DI.
Placa de 96 poços profundos	VWR	100-11-940
Tapete de vedação de placa de 96 poços	VWR	10011-946
anticorpo anti-digoxigenina	Roche	11-093-274-910	Manter a -20 °C.
Estoque BCIP	Sigma	B8503	Gerar 50 mg / ml usando 100% DMF - congelar e armazenar a -20 ° C.
solução			Gere 50 ml usando 10 ml de BSA (10%), 5 ml de FCS e 35 ml de MABT. (Descongele BSA e FCS a 37 ° C.)
Estoque de BSA (albumina de soro bovino)	American Bioanalytical	AB00448	Gere 10% de BSA mexendo os flocos de BSA em MAB à temperatura ambiente, depois congele e armazene a -20 ° C. (Mantenha os flocos de BSA não utilizados a 4 ° C.)
Reagentes de reação de transcrição in vitro de ribossonda marcados com DIG/FLU	Roche	11175025910; 11685619910	Consulte o procedimento do fabricante.
DMF (dimetilformaldeído)	American Bioanalytical	AB00450
inibidor de DNase 1, 10x DNase 1 tampão	Roche	4716728001
placa de incubação de embriões	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 μ l	Eppendorf	22492284
Etanol (EtOH)	Sigma	E7023	Gere 50 ml de EtOH a 70% com grau molecular H2O e 100% de EtOH e armazene a -20 °C.
FCS (soro fetal de bezerro) estoque	Invitrogen	16140089	Manter a -20 ° C.
unidade de esterilização com filtro	Corning	430516	0,45 μ m CA / 1 L
fórceps fino	Roboz	RS-1050
tubo de microcentrífuga de fundo plano	VWR	87003-300; 87003-298
Formamida	American Bioanalytical	AB00600	Manter a -20 °C.
bacia de vidro 90 x 50	Kimax Kimble	23000
pipeta de vidro	VWR	14673-010
frasco de vidro	Wheaton	225012
glicerol	Sigma	G7893
glicina	Sigma	G8898
glicogênio	Roche	10901393001
HYB+			Gerar 50% de formamida, 0,1% de Tween-20, 5x SSC, 5 mg/ml de RNA de torula de levedura e 50 μ l/μ l heparina
INT estoque	Sigma	I8377	Gerar 55 mg / ml usando 70% DMF e 30% H2< / sub>O - congelar e armazenar a -20 ° C.
MAB			Gerar adicionando 55,0 g de base Trisma, 8 ml de 1 M Tric-HCl pH 9,5, 23,2 g de ácido maleico e 17,5 g de NaCl a 1,5 L de H2O. Em seguida, encha com H2O deionizado a 2 L e autoclave.
MABT			Gera 0,1% Tween-20 em MAB
MeOH	Sigma	34860-4L
coador de chá de malha	English Tea Store	SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
água destilada de grau molecular	Mediatech	25-055-CM
multi 8 canais pipeta 0,5 - 10 μ l	Eppendorf	3122000.019
pipeta multicanal de 8 canais 30 - 300 μ l	Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
NBT estoque	Sigma	N6876	Gere 50 mg / ml usando 70% DMF e 20% H < sub > 2 < / sub > O - congele e armazene a -20 ° C.
microscopia eletrônica	de paraformaldeído	19210
adesivo de filme PCR	Eppendorf	30127.48
recipiente de placa (caixa de lápis)	Tampão
			(Faça fresco para usar a cada vez.)
Pronase	Roche	11459643001	Gerar 50 mg/ml usando E3, congelar e armazenar a -20 °C.
Proteinase K	Roche	03-115-879-001	Gerar 10 mg / ml em água DI, congelar e armazenar a -20 ° C.
Inibidor de RNase 1	Roche	3335399001
bulbo de borracha	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
solução de coloração-roxo	N/A	N/A	Gerar usando 45 μ l de NBT e 35 &# 956; l de BCIP para cada 10 ml necessários no tampão de pré-coloração.
solução de coloração-vermelho			Gerar usando 31,5 μ l de INT e 35 μ l de BCIP para cada 10 ml necessários no tampão de pré-coloração.
estereomicroscópio	Nikon	SMZ645, SMZ1000
T3 RNA polimerase	Roche	11031171001
T7 RNA polimerase	Roche	10881775001
		202, 204
Tween-20 estoque	American Bioanalytical	AB02038
banho-maria	Thermo	51221073	( Modelo # 2831)