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Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

As células vivas depositar energia metabólica sob a forma de gorduras e hidratos de carbono e utilizar esta energia para a biossíntese, transporte de membrana e movimento. Alguma energia é obtida no citossol através da conversão dos açúcares alimentares directamente em ATP durante a glicólise. No entanto, a principal fonte de produção de ATP numa célula é aproveitada dentro das mitocôndrias através da cadeia respiratória mitocondrial ^1. A arquitectura de mitocôndrias proporciona a orientação espacial necessária para a produção de ATP efectiva e eficiente. As mitocôndrias possuem uma membrana dupla separados por um espaço intermembranar e em conjunto com a matriz, o compartimento mitocondrial mais interna, a casa dos componentes e coordenar as reacções químicas envolvidas na geração de ATP. A membrana interna contém uma série de complexos de proteínas ligadas a membranas que compreendem a cadeia respiratória, assim como o ATP sintase, o complexo de proteína que traz ADP e Pi juntos para a formação de ATP. A pousadamembrana er é dobrada em cristas e os elétrons são passados ​​ao longo dos complexos da cadeia respiratória através do citocromo c, uma transportadora de electrões solúvel que se move entre os complexos dentro do espaço intermembranar. Como electrões mover, a oxidação de equivalentes redutores ocorre e os iões de hidrogénio são bombeados da matriz para o espaço intermembranar. Como consequência da elevada concentração de iões no interior do espaço intermembranar, um gradiente electroquímico constrói resultando em um potencial de membrana, através da membrana mitocondrial interna (Δψ) ^2. O oxigênio é o receptor de elétrons final da cadeia de transporte de elétrons e íons de hidrogênio fluir através das sintases ATP do espaço intermembranar de volta para a matriz, e ao fazê-lo diretamente causar a formação de ATP. Este processo tal como descrito na sua totalidade, é conhecida como a fosforilação oxidativa. As dobras do cristas aumentar a área de superfície da membrana interior, permitindo o transporte de electrões máxima e a produção de ATP dentrocada mitocôndria. As proteínas, enzimas e outras moléculas envolvidas na fosforilação oxidativa são derivadas de ambos os genes nucleares e mitocondriais. A mitocôndria contém seu próprio DNA circular, de codificação para 13 proteínas, bem como tRNAs e mRNAs necessárias para a produção de ATP ^3. No entanto, muitas mais proteínas são necessárias e, portanto, são nuclear codificado. A maior parte destas proteínas nucleares codificados são direccionadas para a matriz mitocondrial pelo uso de pré-sequências na extremidade N-terminal da proteína precursora, e a sua importação é impulsionado em parte por Δψ ^4,5.

Além de contribuir para a bioenergética da célula, as mitocôndrias também influenciar principais processos metabólicos, tais como o TCA e beta-oxidação, a sinalização celular através da regulação de cálcio, bem como um papel-chave na apoptose ^6. Especificamente, durante períodos de estresse celular, proteínas BCL-2 familiares que residem em ou interagir na membrana externa mitocondrial pode causar mitocondriala permeabilidade da membrana externa (MOMP) ^7,8. Durante MOMP, citocromo c e outras proteínas são libertadas no citosol, e, juntamente com várias proteínas citosólicas formar um complexo denominado apoptossomo ^9,10. O apoptossomo ativa caspases que transitam para a decompor as proteínas celulares e DNA durante a fase de execução da apoptose. Assim como ocorre MOMP, ΔΨ é recolhido e produção de ATP interrompida. Assim, a função mitocondrial, tal como apoptose é iniciada é comprometida e mudanças na ΔΨ pode ser correlacionada com mitocondrial e célula de saúde ^12. Enquanto a apoptose é um ponto final em muitos modelos de doenças, a função mitocondrial e mudanças para ΔΨ também pode fornecer informações valiosas sobre a origem e / ou progressão da doença. Por exemplo, as alterações estruturais e funcionais mitocondriais foram documentadas durante o decurso de doenças neurodegenerativas ^13,14.

Na primeira parte do protocolo, isolação de mitocôndrias intactas que conservam a sua ΔΨ é descrito. As células HEK-293T foram expostas a diferentes concentrações e combinações de recombinante de TNF-α, IL1-β e IFN-γ para induzir apoptose. Estas citocinas foram escolhidos porque eles são frequentemente relatada como sendo elevada em amostras sépticas humanos primários ¹⁵ e a via extrínseca da apoptose pode ser desencadeada pela interacção de ligação ao seu receptor de TNF-α ^6. Uma vez que existem variações subtis necessárias para isolar mitocôndrias funcionais de tecidos primários, em comparação com células cultivadas, e porque muita pesquisa utiliza animais, o protocolo também descreve como isolar mitocôndrias de fígado e de medula espinal de anterior esclerose lateral (ALS) modelo de ratinho.

A segunda parte do protocolo foi desenvolvido para controlar as perturbações do potencial de membrana mitocondrial utilizando um corante fluorescente sensível ao potencial com um leitor de placa fluorescente. Diferenças entre o estado celular (isto é, saudáveis ​​vs insalubre) são diferenciados por quantificação da força de ΔΨ de mitocôndrias isoladas em conjunto com agentes de desacoplamento, inibidores da cadeia respiratória, inibidores do complexo e ionóforos, os quais causam a dissipação do potencial da membrana mitocondrial. Quanto mais saudável as mitocôndrias, quanto maior for a alteração na ΔΨ aquando do tratamento com inibidores mitocondriais, por conseguinte, a resposta das mitocôndrias podem ser utilizadas como um indicador da função mitocondrial (dis).

Uso de mitocôndrias isoladas em vez de na avaliação in situ da função oferece uma evidência definitiva de que o tratamento de uma patologia ou modula alterações directamente para o organelo ^16-18. Embora existam métodos na literatura para isolar mitocôndrias de células cultivadas, eles são vagos ¹⁷ e / ou utilizar equipamentos especializados ^16. Este protocolo descreve em pormenor o método de isolamento e éfacilmente adaptável a outras linhas celulares, incluindo o tecido primário e culturas ^13,14,19,20. Muitos estudos mitocôndrias isoladas utilizar as mesmas desacopladores mitocondriais e inibidores utilizados neste protocolo, mas com um eletrodo de Clark ⁽²¹ é um exemplo representativo de muitos trabalhos na literatura), que por sua vez é uma peça muito específica e especializada de equipamentos. Além disso, este método tradicional tem limitações tais como baixo rendimento e alta complexidade ^22,23 e requer uma quantidade substancial de mitocôndrias (~ 500 ng / reacção). Neste protocolo, o potencial fluorescente TMRE sonda de detecção de membrana é utilizado em conjunto com um leitor de placas fluorescente, que é uma máquina padrão em muitos laboratórios. TMRE é amplamente considerada, uma vez que rapidamente entra nas células e mitocôndrias isoladas e podem ser usadas em baixas concentrações ^24. Várias reações podem ser rapidamente configurado em conjunto e em lotes analisados ​​usando esse protocolo. Além disso, a reacçãos requer uma pequena quantidade muito de mitocôndrias isoladas (~ 10 ug / reacção). Ao exigir menos material, amostras de tecido ou de cultura de células mais pequenas pode ser utilizada como um ponto de partida para o isolamento de mitocôndrias, mais repetições ou as reacções podem ser configurados, e material potencialmente suficiente para outras experiências mitocôndrias isoladas, tais como a produção de ATP, o consumo de oxigénio, ou importação Os ensaios são possíveis.

Protocol

Todos os experimentos com animais conformados com Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pela Wake Forest University Animal Care e do Comitê Use. Casais reprodutores para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de rato foram obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Do tipo selvagem (WT) fêmeas e machos SOD1G93A não transgênicas [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] foram criados para gerar ratos SOD1G93A e ninhada WT não transgênicas que foram utilizados nos experimentos.

1. Modelos de Investigação

1. Cultura celular
   1. Manter as células embrionárias de rim humano (HEK-T293) as células em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de L-glutamina, a 37 ° C em 5% de CO _2.
   2. Cultivar células em frascos T75 e permitir-lhes chegar a 90% de confluência.
   3. Levar a cabo a divisão celular através de tripsinização (0,25% de tripsina-EDTA) durante 3-5 min a 37 ° C em 5% de CO ₂ </sub>, A inactivação da tripsina com um volume igual de meio celular, e centrifugação das células durante 5 min a 700 xg a 4 ° C.
   4. Aspirar a mídia e colocar o agregado de células em meios de cultura.
   5. Semear as células em placa ou o frasco apropriado de 7 x 10 ⁴ células para um frasco T75 48 h antes da citocina de tratamento. Isso deve dar ~ 70% de densidade no momento do tratamento.
   6. Células morrem de fome de soro 24 horas mais tarde, aspirando a mídia e substituí-lo com o mesmo volume de meios livres de soro (DMEM, estéril).
   7. Prepare o TNF-α, IL1-β, e IFN-γ, de pó liofilizado com água ultra-pura em concentrações úteis de 5 pg / mL, 10 ng / mL, e 10 ng / mL, respectivamente, e adicioná-los aos poços / frascos.
   8. Soro mimo células fome pela adição de citocinas solubilizadas directamente ao meio de cultura de células de frascos apropriados. Os tratamentos consistiram de citocinas individuais, um cocktail de todos os 3 (designado por "* 3"), ou sterile água como um controlo (referido como "0").
   9. Incubar as células tratadas durante 24, 48 ou 72 horas antes da avaliação e colheita.
2. Avaliação da viabilidade celular
   1. Adicione uma solução de 5 mg / ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) em PBS 1x.
   2. Para placas de 12 poços, adicionar 100 ul de solução de MTT a cada poço e agitar suavemente para assegurar uma distribuição uniforme.
   3. Incubar as placas durante 15 min-1 hora a 37 ° C em 5% de CO _2, e verificar sob um microscópio para a presença de uma coloração púrpura. Se nenhum roxo está presente, agite novamente e permitir que as células para incubar em intervalos de 5 minutos até que roxo é observado. A quantidade de tempo necessária, deve ser determinada por cada investigador.
   4. Usando uma pipeta de repetição, adicionar 700 ul de MTT solvente (HCl 4 mM e NP40 a 0,1% em isopropanol) a cada poço e agitar a placa (s) à temperatura ambiente durante 5-10 minutos, ou até toda a cor púrpura tinha deixado as células . Se o roxocor não sai das células, adicionar um adicional de 200 mL de solvente e continuar a girar.
   5. Para a análise, levar 100 uL de cada poço e colocar numa placa de 96 poços e lidas num leitor de placas usando 570 nm e um comprimento de onda de referência de 630 nm, 595 nm no entanto também é aceitável, desde que as leituras são tomadas a configurações consistentes.
3. Modelo Animal de ALS
   1. Todos os experimentos com animais conformados com Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pela Wake Forest University Animal Care e do Comitê Use. Casais reprodutores para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de rato foram obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Do tipo selvagem (WT) fêmeas e machos SOD1G93A não transgênicas [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] foram criados para gerar ratos SOD1G93A e ninhada WT não transgênicas que foram utilizados nos experimentos.
   2. Realizar genotipagem com primers padrão contra SOD1 mutante ^25.

2. Isolamento de mitocôndrias

ATENÇÃO: É importante trabalhar com rapidez e manter tudo em gelo durante todo o procedimento.

1. Preparação de tampão de isolamento mitocondrial (MIB), tampão de isolamento da medula espinal (SC MIB) e tampão experimental (EB)
   1. Prepare as seguintes soluções de antecedência para MIB e EB.
   2. Adicione 1 M Tris / MOPS por dissolução de 12,1 g de base Tris em 70 ml de H ₂ O. Adicionar MOPS secos para obter o pH a 7,4. Ajustar o volume para 100 ml final. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C.
   3. Faça 1 M Kphos misturando 80,2 ml de K ₂ HPO ₄ e 19,8 ml de KH ₂ PO _4. Guarde-o em temperatura ambiente.
   4. Adicione 0,2 M de EGTA / Tris, adicionando 3,8 g de EGTA a 10 ml de H ₂ O. Adicionar 1 M Tris / MOPS até dissolvidos, ~ 30-40 ml. Ajuste para 50 ml, filtro estéril e armazenar em temperatura ambiente. Note-se que o pH ser ~ 6,7.
   5. Adicione 1 M glutamato, fazendo 10 ml de1 M de solução de ácido glutâmico. Esterilizar por filtração e armazenamento de 4 ° C.
   6. Adicione 1 M Malato fazendo 10 ml de 1 M de solução de ácido málico. Adicionar Tris / MOPS a 50 mM. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C.
   7. Adicione MIB a uma concentração de 200 mM de sacarose, 10 mM de Tris / MOPS, pH 7,4, e 1 mM de EGTA / Tris. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C.
   8. Adicione MIB SC a uma concentração de 250 mM de sacarose, 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, KCl 10 mM, _MgCl2 1,5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, e cocktail inibidor de protease.
   9. Adicione EB, a uma concentração de KCl 125 mM, Tris 10 mM / MOPS, pH 7,4, 5 mM de glutamato, 2,5 mM de malato, 1 mM de fosfato de K, pH 7,4, e 10 mM de EGTA / Tris. Esterilizar por filtração e armazenar a 4 ° C.
2. Equipamento de preparação, antes da colheita das células.
   1. Lavar um pequeno recipiente de vidro e homogeneização pilão três vezes com água estéril e colocar em gelo.
   2. Reúna os itens necessários, como uma broca standard, scra celularpers, 1,5 ml, 15 ml e 50 ml de tubos e soluções.
3. As mitocôndrias Isolation
   1. Células cultivadas
      1. Para cada tipo de amostra, use dois frascos T175 de células.
      2. Certifique-se de que as células são ~ 90% confluentes e usar em experiências de controlo, ou a placa e tratar como acima descrito no passo 1.2.
      3. No topo da bancada, meios de aspirado e lavar as células aderentes duas vezes com 15 ml de 1x PBS de cada vez.
      4. Aspirar o tampão e raspar frascos para remover as células aderentes a partir do fundo do balão.
      5. Adicionar 15 ml de PBS 1x a cada frasco, redemoinho, e transferir para cada 15 ml tubos cônicos e colocar no gelo.
      6. Uma vez que é feito raspagem, centrifugar os tubos durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C utilizando uma mesa de centrífuga de topo, usando um rotor de balde oscilante.
      7. Sobrenadantes Aspirar e ressuspender cada pellet em 1 ml de MIB.
      8. Combine as duas suspensões e transferir para um pequeno recipiente de vidro para a homogeneização.
      9. Adicionar MIBpara o reservatório até que atinja o tampão de primeira linha. Homogeneizar células com as pilão ligados a um misturador a velocidade média durante três passagens. Certifique-se que o navio está no gelo durante esta etapa, não para remover as pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passes contínuas.
      10. Transferir a solução homogeneizada de um tubo cónico de 50 ml.
      11. Desenhe a solução para uma seringa de 3 ml usando um calibre 18 1 ½ polegada de agulhas e expulsá-lo de volta para o tubo cônico no gelo com uma agulha de calibre 27 ½ polegadas. Cuidar para expelir a solução contra a parede interior do tubo como para utilizar a força de ruptura da membrana celular.
      12. Repetir os passos de seringa para um total de cinco vezes.
      13. Transferir a solução para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 5 minutos a 600 xg, a 4 ° C numa centrífuga de topo de mesa utilizando um rotor de balde oscilante.
      14. Remova cuidadosamente o sobrenadante e distribuir entre três tubos de 1,5 ml.
          NOTA: Mitochondria são no sobrenadante após esta primeira, centrifugação de baixa velocidade, enquanto que as membranas celulares e as células não rompidas foram sedimentadas.
      15. Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, 4 ° C durante 5 min.
      16. Sobrenadantes Aspirar e combinar as pelotas em 100 l MIB e coloque imediatamente em gelo.
          NOTA: As mitocôndrias são no sedimento após esta rotação de alta velocidade. As mitocôndrias será normalmente mantêm o seu potencial de membrana de ~ 2-3 de iões de gelo, depois do isolamento e são mais estáveis ​​como uma solução mãe concentrada no MIB.
   2. Isolamento mitocôndrias de tecido do mouse
      1. Anestesiar o mouse de acordo com o protocolo IACUC. Definir um vaporizador em 5,0% para induzir a anestesia. Confirmou que o animal é anestesiado por uma falta de reflexo para pitada pé ou reflexo de piscar quando o olho é abordado ou batido com um cotonete. Manter o rato sob anestesia por todo o procedimento cirúrgico, mantendo o vaporizador entre 1,5% e 2,0%.
      2. Excise o fígado e da medula espinhal de cada animal e local separadamente no gelo frio 1x PBS – / – para enxaguar qualquer sangue.
      3. Para o fígado, a transferência do tecido para um prato de pesagem em gelo e corte em pequenos pedaços utilizando uma lâmina de barbear fresco durante 1 min.
      4. Adicionar tecido e tampão apropriado (MIB para o fígado ou SC MIB para a medula espinhal) para o reservatório até que atinja o tampão de primeira linha. Homogeneizar o tecido com o pilão à mão por cinco passes. Certifique-se que o navio está no gelo durante esta etapa, não para remover as pilão acima do líquido e usar uma velocidade constante com passes contínuas.
      5. Transferir os homogeneizados para limpar tubos de 15 ml.
      6. Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 750 xg, a 4 ° C durante 10 min.
      7. Salve os sobrenadantes para tubos limpos e colocá-los no gelo.
         NOTA: As mitocôndrias são no sobrenadante após esta primeira, centrifugação de baixa velocidade, enquanto que as membranas celulares e as células não rompidas foram sedimentadas.
      8. Re-suspender as pelotas da medula espinhal in 500 ul de SC MIB.
      9. Re-homogeneizar cada três vezes, só enchendo o recipiente com meio caminho SC MIB neste momento.
      10. Transferir o novo homogeneizado para um tubo fresco.
      11. Centrifugar a num rotor de ângulo fixo a 750 xg, a 4 ° C durante 10 min.
      12. Combinar estes novos sobrenadantes, os quais contêm mais mitocôndrias, com o primeiro sobrenadante de cada amostra.
      13. Tubos de centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, 4 ° C durante 5 min.
      14. Aspirar os sobrenadantes e ressuspender as pastilhas de fígado em 500 ul de MIB e as pelotas medulares em 50 ul SC MIB e colocar imediatamente em gelo.
          NOTA: As mitocôndrias são no sedimento após esta rotação de alta velocidade. As mitocôndrias será normalmente mantêm o seu potencial de membrana de ~ 2-3 de iões de gelo, depois do isolamento e são mais estáveis ​​como uma solução mãe concentrada no MIB.
      15. Realizar um ensaio de concentração de proteína para estimar a concentração de mitocôndrias em solução. Seguir as instruçõess para usando um Kit de Ensaio de Proteínas comerciais ou método semelhante ^26. As concentrações típicas são de mitocôndrias: 2 frascos T175 rendimentos ~ 2 mg / mL, 1 de fígado de rato ~ 3-5 mg / ml, e um rato medula espinhal ~ 1-3 mg / ml.
4. Ensaio citocromo c usando um R & D Rat / Mouse citocromo c Quantikine ELISA Kit (adaptado do protocolo fornecido pelo fabricante).
   1. Imediatamente antes de configurar as reações, diluir mitocôndrias a 0,5 mg / ml concentração trabalhar com EB e distribuir mitocôndrias diluídos em tubos de 1,5 ml para as reações (tipicamente 30-50 mL de mitocôndrias por tubo).
   2. Adicionar ou EB ou DMSO, a 1% do volume total, para as mitocôndrias diluído e incuba-se as reacções no cimo da bancada durante 7-10 min. Estas reacções são estáveis ​​durante até 30 minutos à temperatura ambiente, se for necessário um período de tempo mais longo.
   3. Mitocôndrias pelete por centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, a 4 ° C durante 5 min e cuidadosaly separar o sobrenadante e colocar em cada uma separada tubos de 1,5 ml.
      NOTA: Os tubos podem ser congeladas a -20 ° C para posterior análise ou utilizado imediatamente.
   4. Determinar a libertação de citocromo c por uma comparação da concentração de citocromo c no sedimento e sobrenadante ^27.
      1. Preparar as amostras por solubilização dos peletes no volume original da reacção com 0,5% de Tx-100 em PBS 1x.
      2. Para cada amostra, preparar dois poços na placa de ELISA, uma para o sedimento agora solubilizado e um para o sobrenadante a partir da reacção por adição de 100 ul de conjugado de citocromo c (pode ser usado imediatamente para fora do frasco) mais 100 ul de 0,5% Tx 100 em 1x PBS, e então todo o sedimento ou sobrenadante da amostra.
      3. Gentilmente vortex a placa um nível baixo (nível 2-4) por 20 segundos para misturar, tampa e incubar durante 1 hora, 37 ° C.
      4. Em seguida, lava-se a placa quatro vezes com tampão de lavagem diluído de acordo com o FABRICAÇÃOinstruções de pronto-socorro. Remova qualquer excesso de solução tocando os poços em papel toalha.
      5. Em seguida, adicionar 150 ul de 1: 1 de A + B Solução de desenvolvimento a cada poço e incubar a placa durante 20-30 minutos no escuro à temperatura ambiente.
      6. Finalmente, adicione 50 ml de solução de parada em cada poço e fazer leituras de absorbância a 540 nm usando um leitor de microplacas. Calcular a quantidade de libertação de citocromo c por comparação da quantidade de citocromo c na pelete vs sobrenadante para cada reacção.

3. Avaliação da função mitocondrial (Dys)

1. Imediatamente antes de reacções são configurados, diluir mitocôndrias a 0,5 mg / ml de concentração de trabalho com EB e colocado em tubos de 1,5 ml para as reacções (tipicamente 30-50 ul de mitocôndrias são utilizados por tubo).
2. Tratamentos mitocondriais
   1. Adicionar tratamentos apropriados (controlo EB, 1 uM FCCP misturado com 50 nM de valinomicina, 10 uM rotenona, 5 uM oligomicina, KCN 2 mM, ou 200 uM de ADP, as concentrações finais) para separar as reacções em ^1/10 do volume total de mitocôndrias diluído. Incubar as reações na bancada para 7 min.
      NOTA: É preciso ter cuidado ao manusear estas substâncias como a ingestão ou absorção acidental através da pele pode ser prejudicial.
   2. Diluir TMRE, reconstituído em água estéril a uma concentração de trabalho de 100 uM e armazenadas a -20 ° C, a 2 uM e adicionar um volume igual ao volume de reacção mitocondrial.
   3. Incubar as reações na bancada para 7 min.
   4. Mitocôndrias pelete por centrifugação num rotor de ângulo fixo a 10000 xg, a 4 ° C durante 5 min.
   5. Carga de metade do volume de sobrenadante de cada amostra para uma placa de 396 poços e ler a fluorescência.
      NOTA: excitação e de emissão de comprimentos de onda TMRE deve ser optimizado de acordo com as instruções do fabricante e utilizando o volume e a placa que irá ser utilizado parao ensaio. Usando uma placa de 384 poços padrão preto com 25 ul de 1 uM TMRE (concentração final da reacção) o sinal mais forte foi obtido utilizando comprimentos de onda de excitação / emissão   485 nm / 535 nm.
   6. Calcula-se a diferença em prega-fluorescência entre o controlo (EB) e cada tratamento dividindo o valor da fluorescência relativa (RFU), obtida a partir do leitor de placas para a amostra experimental pela RFU na amostra de controlo.

Representative Results

Discussion

O tratamento de células HEK-293T com citocinas recombinantes provoca quantidades moderadas de morte de células ao longo de 48 horas (Figura 1). A quantidade de morte celular induzida por tratamento TNF-alfa é semelhante aos estudos previamente relatados ³⁰ e a viabilidade celular diminui após a co-administração de várias citocinas que são maiores do que as quantidades aditivas com qualquer citocina sozinha também é consistente com a literatura ^31,32. A capacidade de ajustar as quantidades e tipos de tratamentos de citocinas, bem como a comparação dos cocktails para citocinas individuais tornam este modelo de cultura celular atraente para estudar os efeitos específicos de exposição de citocinas em células renais. Além disso, os resultados são muito reprodutível e facilmente alcançada (Figura 2). Considerações a ter em mente incluem a confluência das células. Por exemplo, as células tratadas com 100% de confluência não respondem bem às mesmas concentrações de citocinas, quando tratado a 70-80% confluência. Além disso, o número de passagens das células passaram por devem ser rastreados, quanto resposta de células poderia ser influenciada de ter estado em cultura por muito longos (mais de 8-12 semanas desde o descongelamento). Embora o tratamento de células em cultura com citoquinas reduziram a viabilidade celular e, subsequentemente, a saúde mitocondrial, é de maneira nenhuma um modelo de sepsia por si só. No entanto, a utilização de um modelo clinicamente mais relevante, tal como empregando células de rim primárias isoladas a partir de ratinhos e / ou tratamento com citocinas secretadas naturalmente a partir de células THP1 estimuladas ^33, é uma extensão natural deste trabalho. Dada a falta de compreensão de insuficiência renal durante a sepsia, tais modelos de cultura de células e na avaliação das mitocôndrias poderia fornecer informações iniciais dos mecanismos, bem como uma plataforma preliminar para testar a eficácia de compostos farmacêuticos como tratamentos preventivos ou de intervenção.

As mitocôndrias isoladas de células de cultura ou tecidos animaispagar a capacidade de avaliar rapidamente o impacto de tratamentos com células ou a progressão da doença na saúde mitocondrial. Os protocolos de isolamento e de avaliação não são tecnicamente exigente para executar, e pode ser facilmente modificada para uso com outras linhas de células ou tecidos primários. A MIB e EB utilizado para cada tipo de amostra são boas receitas de partida que podem ser ajustadas como necessário, se uma célula ou tipo de tecido em particular tem diferentes requisitos. Por exemplo, a adição de ácido graxo-BSA livre é normalmente necessário para uso com os neurônios, como incluído no protocolo da medula espinhal ^15,34. O método de rompimento de células também pode ser alterada através da utilização de seringas mais expulsão ou mudando a homogeneização à mão em vez de usar uma broca ou vice-versa. Além disso, a re-homogeneização do sedimento de centrifugação em primeiro lugar, como é feito no procedimento de cordão espinal mitocôndrias, pode ser necessário para obter uma quantidade satisfatória de mitocôndrias. Um bom indicador de que um protocolo de isolamento produz mitochondri viáveisuma é a utilização de citocromo c de ELISA. Este ensaio é uma alternativa rápida e fácil a análise de Western blot de libertação de citocromo c e é também uma avaliação útil da libertação de citocromo c das mitocôndrias após o tratamento com os péptidos ou outros compostos ^19,27. Alternativamente, TMRE pode ser utilizado durante o desenvolvimento de protocolo, mas é importante para avaliar mitocôndrias isoladas a partir de uma amostra que é conhecido por ser saudável. Além disso, quando se isola a partir de tecidos de ratinho mitocôndrias que habitualmente não são descritos na literatura, as mitocôndrias do fígado pode servir como um controlo positivo, assim como utilizada para definir a linha de base. Por exemplo, como no presente protocolo, os fígados de cada animal, tanto durante o desenvolvimento do protocolo, bem como experimentos foram também retirados e utilizados para o isolamento de mitocôndrias. Outra consideração para a preparação é a quantidade de mitocôndrias obtidos no final do procedimento de isolamento. Se a concentração de mitocôndrias é de 1 mg / ml ou menos, em seguidaOs resultados do ensaio podem não ser fiáveis ​​(observações não publicadas VDGM). Tanto a quantidade de material de partida, MIB receita ou o método de interrupção deve ser optimizado antes de se mudar para ensaios funcionais. Uma vez que um protocolo de isolamento bem sucedido é atingido, as mitocôndrias também pode ser utilizado em outros ensaios, tais como o conteúdo total de ATP e geração de ATP ^13,14.

O protocolo função mitocôndrias aqui descrito permite a medida indireta da captação mitocondrial da detecção de potencial TMRE corante utilizando um leitor de placas fluorescentes. Depois de mitocôndrias foram isoladas e os produtos químicos adequados adicionados, eles são incubados com TMRE e, em seguida, sedimentadas. Ao tratar células inteiras ou animais e isolar mitocôndrias antes ΔΨ avaliação, variáveis ​​de confusão, como o transporte multi-resistente ou ATP fluxo sejam evitados. A quantidade de fluorescência no sobrenadante é então analisado com o entendimento de que a mitocôndria saudávelquanto mais forte seu ΔΨ e, portanto, mais absorção de TMRE. Como resultado, a quantidade de fluorescência no sobrenadante deve ser inferior em mais mitocôndrias saudáveis ​​e em mitocôndrias insalubres. Com a inclusão de um só EB-tratamento, a diferença de fluorescência entre vezes este controlo e mitocôndrias desacoplados pode ser calculada. Outro controle importante com cada conjunto de reações executar é TMRE sozinho. O resultado desse controle proporciona uma leitura máxima possível fluorescente. Uma vez que o TMRE adicionado a reacções é diluída de fresco, existe uma variabilidade inerente. Por exemplo, apenas TMRE-leituras de ~ 20.000, 25.000 e 30.000 foram obtidos em vários momentos durante o desenvolvimento do protocolo. Se o TMRE somente sinal é muito maior do que qualquer das amostras de mitocôndrias tratadas e / ou se mitocôndrias tratadas não são significativamente diferente de não tratado, em seguida, o isolamento de mitocôndrias acopladas era mais provável que não bem sucedido. A diminuição na ΔΨ como medido por um rácio obtidoao seguir este protocolo é semelhante aos valores reportados anteriormente para o controle, as células saudáveis ^​​2,35. Comparação das alterações ΔΨ de mitocôndrias isoladas de controle, células HEK-293T não tratados e * 3 células tratadas com citocinas demonstraram que a viabilidade celular diminuiu observada em ensaios MTT traduz a diminuição da função mitocondrial. Este ensaio leitor de placas pode ser facilmente utilizado com mitocôndrias isoladas de qualquer fonte e utilizados para examinar modelos de doenças, tais como esclerose lateral amiotrófica, como demonstrado aqui ^13,14.

Vários estudos têm utilizado corantes fluorescentes específicos de mitocôndrias para detectar MOMP, que foram importantes na gênese deste ensaio leitor de placas. No entanto, esses estudos ou usar células inteiras para rastrear compostos que bloqueiam ou induzir MOMP ^35,36, explorar novos ΔΨ sensoriamento corantes ² ou identificar outros formatos, tais como citometria de fluxo em um microchip ^37. Este protocolo é único na medida em que descreve o adPORMENORIZADA método para isolar e utilizar mitocôndrias para investigar rapidamente efeitos do tratamento de células inteiras através da resposta a compostos que alteram ΔΨ conhecidos. Esse protocolo utiliza uma variedade de desacopladores e inibidores, e indica que qualquer um deles seria adequado para avaliar a saúde mitocondrial. Assim, enquanto que estes centros de investigação sobre as alterações mitocondriais nomeadamente devido ao stress celular ou disfunção celular progressiva, o protocolo pode também ser utilizada para explorar as alterações no metabolismo mitocondrial através da utilização de compostos específicos e / ou a adição de fontes de electrões, tais como o succinato e NADH .

Considerações importantes ao realizar a avaliação mitocôndrias isoladas incluem consistência em volumes de tratamento, mantendo a mitocôndria em MIB e diluindo-os em EB imediatamente antes dos tratamentos vão ser configurado, e usando mitocôndrias dentro de 3 horas de isolamento para garantir a sua ΔΨ ainda é sendo mantida. Oescolha de TMRE sobre outros corantes fluorescentes específicos, tais como mitocôndrias-JC-1 foi devido à capacidade para utilizar concentrações reduzidas e simplicidade de análise de fluorescência utilizando apenas um comprimento de onda. Este método pode ser realizado de forma semelhante usando microscopia fluorescente ^2,38 ou citometria de fluxo ^37, no entanto, o uso de um leitor de placas leva menos tempo e requer menos optimização ^35. Além disso, este protocolo é muito menos exigente tecnicamente, mais rápido de executar, e mais facilmente reproduzíveis em relação ao uso de um eletrodo de Clark ²² (Del Gaizo Moore, observações não publicadas). Titulando quantidades de cada tratamento mitocondrial pode fornecer uma visão mais aprofundada a função mitocondrial e otimização das operações de concentração deve ser realizada. O volume total das reacções mitocondriais pode ser ajustado de acordo com a quantidade de amostra obtidos durante o isolamento, bem como o número de reacções de tratamento necessárias. Se possível, um montante fixo de 50 μ; L é usado; no entanto, tão pouco como 20 uL de mitocôndrias produz resultados fiáveis.

Enquanto ΔΨ se correlaciona com o consumo de oxigênio, o ensaio apresentado não mede diretamente o consumo de oxigênio. Enquanto sensor de oxigénio fluorescente tal como MitoExpress têm sido desenvolvidos, presumivelmente para evitar algumas das quedas da utilização de um eléctrodo de Clark citados acima, o preço por reacção e o requisito de grandes quantidades de mitocôndrias por ensaio permanecem limitante. Portanto, o uso de TMRE e desacopladores ΔΨ ou inibidores clássicos tem várias vantagens. Mais uma vez, a análise lote de múltiplas amostras ou tratamentos múltiplos / amostra, reprodutibilidade, menor necessidade de material de partida e / ou menor quantidade de mitocôndrias isoladas necessária por reação tornar este protocolo atraente.

Materials

L-glutamic acid	Sigma	G1251	Can use the potassium salt instead.
malic acid	Sigma	M8304	Can use the potassium salt instead.
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	Sigma	P0662
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Dilute down to 100&nbsp;μM as a working stock in ethanol and store at -20&nbsp;°C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Make in DMSO and use as a 5&nbsp;μM working stock. Store at -20&nbsp;°C.
sucrose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&nbsp;
rotenone	Sigma	R8875	Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin	Sigma	O4876	Highly toxic. Made in ethanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilute 100&nbsp;μM stock with EB immediatley before use.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (high glucose).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Store aliquots at -20&nbsp;°C
FBS	Lonza	14-501F	US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20&nbsp;°C.
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien Assay Dye (5x)	Bio-Rad	500-0006	Any protein assay can substitute.
BSA	Fisher	BP1600-100	Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder	Sigma	M2128	Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20&nbsp;°C; store at 4&nbsp;°C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Once opened store aliquots at -20&nbsp;°C
Recombinant Human TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure it is without Mg<sup>2+</sup> and Ca<sup>2+</sup> ions.
Cytochrom <em>c</em> ELISA kit	R&amp;D systems	DTC0	Human for HEK-293T cells.&nbsp;