Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Resumo

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Resumo

A comparação entre dois ou mais grupos distintos, como saudável vs. doença, é necessária para determinar o estado celular. As mitocôndrias estão no nexo da saúde celular devido ao seu papel no metabolismo celular e na produção de energia, bem como no controle da apoptose. Portanto, a avaliação direta de mitocôndrias isoladas e perturbações mitocondriais oferece a capacidade de determinar se a (dis)função específica da organela está ocorrendo. Os métodos descritos neste protocolo incluem o isolamento de mitocôndrias intactas e funcionais de células cultivadas HEK e fígado e medula espinhal de camundongos, mas podem ser facilmente adaptados para uso com outras células cultivadas ou tecidos animais. A função mitocondrial avaliada pelo TMRE e o uso de desacopladores e inibidores mitocondriais comuns em conjunto com um leitor de placas fluorescentes permitem que este protocolo não apenas seja versátil e acessível à maioria dos laboratórios de pesquisa, mas também ofereça alto rendimento.

Introdução

As células vivas depositar energia metabólica sob a forma de gorduras e hidratos de carbono e utilizar esta energia para a biossíntese, transporte de membrana e movimento. Alguma energia é obtida no citossol através da conversão dos açúcares alimentares directamente em ATP durante a glicólise. No entanto, a principal fonte de produção de ATP numa célula é aproveitada dentro das mitocôndrias através da cadeia respiratória mitocondrial ^1. A arquitectura de mitocôndrias proporciona a orientação espacial necessária para a produção de ATP efectiva e eficiente. As mitocôndrias possuem uma membrana dupla separados por um espaço intermembranar e em conjunto com a ....

Protocolo

Todos os experimentos com animais conformados com Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pela Wake Forest University Animal Care e do Comitê Use. Casais reprodutores para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de rato foram obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Do tipo selvagem (WT) fêmeas e machos SOD1G93A não transgênicas [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] foram criados para gerar ratos SOD1G93A e ninhada WT não transgênicas que foram utilizados nos experimentos.

1. Modelos de Investigação

1. Cultura celular
   1. Manter as células embrionárias de rim humano (HEK-T293) as células em DMEM supleme....

Resultados

O tratamento de células HEK-293T com 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, e 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 h, conduz a quantidades progressivas de morte celular (Figura 1A ). A viabilidade celular foi avaliada utilizando ensaios de MTT e consistentemente demonstra que existe ~ diminuição de 10% na viabilidade celular com o tratamento com 24 ~ hr e diminuição de 20% com o tratamento de 48 horas. As células tratadas com concentrações semelhantes (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, e.......

Discussão

O tratamento de células HEK-293T com citocinas recombinantes provoca quantidades moderadas de morte de células ao longo de 48 horas (Figura 1). A quantidade de morte celular induzida por tratamento TNF-alfa é semelhante aos estudos previamente relatados ³⁰ e a viabilidade celular diminui após a co-administração de várias citocinas que são maiores do que as quantidades aditivas com qualquer citocina sozinha também é consistente com a literatura ^31,32. A capacidade de ajustar as quan.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido L-glutâmico	Sigma	G1251	Pode usar o sal de potássio em seu lugar.
ácido málico	Sigma	M8304	Pode usar o sal de potássio em vez disso.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Base Trisma	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Diluir até 100  μ M como estoque de trabalho em etanol e armazenar a -20  °C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Faça em DMSO e use como um 5  μ M estoque de trabalho. Armazenar em -20  °C.
sacarose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Faça um estoque concentrado em etanol e depois dilua com água
rotenona	Sigma	R8875	Altamente tóxico. Feito em etanol.
oligomicina	Sigma	O4876	Altamente tóxico. Feito em etanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Diluído 100  μ M estoque com EB imediatamente antes de usar.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (glicose alta).
Caneta/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamina	Fisher	SH3002101	Armazene alíquotas em -20  ° C
FBS	Lonza	14-501F	Origem americana, qualidade premium. Inative o calor e armazene alíquotas a -20  °C.
Corante de ensaio de tripsina-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien (5x)	Bio-Rad	500-0006	Qualquer ensaio de proteína pode substituir.
BSA	Fisher	BP1600-100	Faça 2 mg / ml de estoque em água para ensaio de proteína.
MTT em pó	Sigma	M2128	Filtro esterilizar 5 mg/ml estoque feito em PBS. Armazene alíquotas em -20  ° C; loja em 4  ° C por até 1 semana.
Solução de tergitol (NP-40)	Sigma	NP40S
IL-1B Gibco humano recombinante		PCH08014	Uma vez aberta, alíquotas de loja em -20  ° C
TNF-alfa Gibco Humano Recombinante		PHC3015L
IFN-gama Gibco Humano Recombinante		PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Certifique-se de que não contém íons Mg2+ e Ca2+.
Cytochrom c kit ELISA	R& D systems	DTC0	Humano para células HEK-293T.