O uso de dois métodos para estimar a expressão do gene nos principais apêndices gustativas de Aedes aegypti, identificamos o conjunto de genes putativamente subjacentes às respostas neuronais para compostos amargos e repulsivas, conforme determinado pelo exame eletrofisiológico.
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Artigo de método
Fisiológicas Recordings e RNA Sequenciação dos gustativas Appendages do Mosquito-febre amarela Aedes aegypti
Neste artigo
Resumo
Resumo
O registro eletrofisiológico dos potenciais de ação dos neurônios sensoriais dos mosquitos fornece aos investigadores um vislumbre da percepção química desses vetores de doenças. Recentemente, identificamos um neurônio sensor amargo no labelo de fêmeas de Aedes aegypti que responde ao DEET e outros repelentes, bem como ao quinino amargo, por meio de investigação eletrofisiológica direta. Essas respostas dos neurônios receptores gustativos levaram ao nosso sequenciamento do mRNA total de amostras masculinas e femininas de labelos e tarsos para elucidar os genes de quimiorrecepção putativos expressos nesses tecidos de quimiorrecepção de contato. As amostras de tarso foram divididas em subtipos pró, meso e metatorácico para ambos os sexos. Em seguida, validamos nosso conjunto de dados conduzindo qRT-PCR nas mesmas amostras de tecido e usamos métodos estatísticos para comparar os resultados entre os dois métodos. Estudos que abordam a função molecular podem agora ter como alvo genes específicos para determinar aqueles envolvidos na percepção repelente por mosquitos. Essas vias receptoras podem ser usadas para rastrear novos repelentes para interromper o comportamento de busca de hospedeiro para conter a propagação de vírus nocivos.
Introdução
Compostos como DEET, Picaridin, Citronelal e IR3535 foram mostrados para repelir os mosquitos de forma eficaz, incluindo os importante vetor da doença Aedes aegypti 1,2. Registramos potenciais de ação de neurônios sensoriais associados com sensilla gustativa específica para determinar as células envolvidas com mosquito repelência. Juntamente com a jusante sequenciação de genes expressos nestes tecidos, que pode identificar os genes mais provável que medeiam as respostas destas células, a fim de rastrear novos compostos para melhorar a capacidade de repelência.
RNA-seq é uma ferramenta poderosa, rapidamente se tornando ....
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Protocolo
1. Cria Ae. adultos aegypti
- Ovos eclodem em cerca de ¾ de polegada de água na bandeja rasa. A superlotação irá reduzir o tamanho dos adultos.
- Larvas Rear a 25 ° C (12-HL: 12-HD) e se alimentam com comida de peixe chão.
NOTA: super-alimentação pode reduzir as taxas de sobrevivência. - Remover pupas individualmente por Pasteur pipeta diária e transferir para pratos de plástico (9 cm × 5,5 cm) dentro de pequenos baldes de confinamento, com tampas de malha fina, estabelecendo, assim, 24 grupos etários hr.
- Mosquitos adultos alimentar 10% de solução de sacarose por bola de algodão colocado nas paredes de tela ....
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Resultados
As gravações de traço de potenciais de ação de Ae. sensilas gustativa aegypti (Figura 1) demonstrar a eficácia da estimulação directa com uma gama de produtos químicos. Esta técnica pode ser usada para quantificar respostas a qualquer químico estimulador contando picos de uma determinada amplitude e duração ao longo de um intervalo de tempo razoável (geralmente menos do que 500 ms). Gravações de rastreamento deve ser facilmente reproduzíveis sob um dado conjunto de condições experiment.......
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Discussão
O aspecto mais desafiador de potenciais de ação de gravação de sensilla gustativa é decidir quais as respostas são "normais". Quando se emprega única ponta sensillum gustativa gravação pela primeira vez para uma determinada espécie de inseto, o número total e sensibilidade dos neurônios dos receptores gustativos (GRNs) são provavelmente desconhecido. Muitas gravações preliminares são primeiros obrigados a decidir o alcance e as concentrações de produtos químicos para testar. Neste exemplo, que começaram com a .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Bryan T. Vinyard do USDA, Serviço de Pesquisa Agrícola, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD pelas análises estatísticas. Este trabalho foi apoiado em parte por uma doação ao JCD do Programa de Pesquisa de Proteção de Combatentes de Guerra Implantado (DWFP) financiado pelo Departamento de Defesa por meio do Conselho de Gerenciamento de Pragas das Forças Armadas (AFPMB).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Capilar de vidro | A-M Systems | 628000 | Standard, 1,5 mm X 0,86 mm, 4"Silver |
| wire | A-M Systems | 7875.015 | " nu |
| Fio de tungstênio | Alfa Products | 369 | 0,127 mm de diâmetro |
| Pinça fina | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Estágio |
| refrigerado | BioQuip Products | 1429 | Chill Pré-amplificador de mesa |
| pré-amplificador | Syntech | Taste Probe | |
| para eletrofisiologia | Software Syntech | Autospike | para eletrofisiologia |
| Comida para peixes TetraMin | Grânulos de comida para peixes | tropicais comida de peixe moída a pó fino | |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | Reagente de isolamento |
| RNA RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | inclui eliminador de gDNA e colunas de rotação RNeasy |
| Espectrofotômetro Nanodrop | Produtos Nano Drop | Espectrômetro de mesa | ND-1000 |
| R estatísticas | freeware (criado por Robert Gentleman e Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use a função lm do pacote stats e a função equiv.boot do pacote de equivalência no ambiente de computação R. |
| Suporte para tubos de 1,5 ml | Evergreen | 240-6388-030 | Despeje nitrogênio líquido em alguns poços vazios para congelar e moer o tecido. |
| Tubos de coleta de 1,5 ml com pilão | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Gire o tecido congelado para mantê-lo no fundo do tubo de 1,5 ml. |
| Primer-BLAST Primer Ferramenta de design | NCBI | n / a |
Referências
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D.
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Reimpressões e permissões
