Introduction
酵母proteinopathyモデルは、筋萎縮性側索硬化症（ALS）およびパーキンソン病（PD）1-3を含む、タンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患のために開発されている。 ALS患者において誤って折り畳まタンパク質TDP-43とFUSの発現は、酵母1,2-細胞質凝集体を形成するために有毒でmislocalizeある。同様に、PDに関与するαシヌクレイン（α-synの）の発現は、毒性であり、mislocalizes酵母3の細胞質の凝集体を形成する。これらの機能は、これらの疾患4,5を有する患者での表現型を再現。このように、酵母のモデルは防止又はこれらの表現型2,6-13を逆にタンパク質または小分子をスクリーニングするための有用なプラットフォームを提供します。私たちは、TDP-43、FUS、及びα-synのに凝集と毒性を逆転することができるタンパク質の開発に興味を持っています。我々はHsp104の、両方のFRタンパク質を脱凝集の一意可能な酵母からAAA +タンパク質に焦点を当てる酵母におけるアモルファス凝集体およびアミロイドOM、まだそれはないヒトホモログ14,15を持っていません。 Hsp104のは細かく、内因性酵母プリオンを分解するように調整し、それが通常16,17に遭遇したことがない人間の神経変性疾患に関与する基質を脱凝集する唯一の限られた能力を持っています。従って、我々は効果的にこれらのヒトの基質を分解することができますHsp104のの強化されたバージョンを設計することを目指しています。そうするために、我々はHsp104の大量のライブラリーを構築すると、エラープローンPCRを用いて、変異体;これらのライブラリーは、酵母proteinopathyモデル17を用いてスクリーニングすることができる。 Hsp104のは17非常に大きいように我々は、ライブラリーを構築およびスクリーニングへのドメインを標的とするアプローチを採用しています。同様のアプローチは他のドメインをスクリーニングするために用いることができるが、我々は最初に、Hsp104の17の中央ドメイン（MD）に焦点を当てた。そのような残りの表面ディスプレイなどの代替技術とは対照的に、これらのモデルは、直接disaggregase活性についてスクリーニングイネーブル18を結合監視するために使用するricted。
我々のプロトコルは、2スクリーニング工程（ 図1）に基づいています。まず、酵母における疾患基板の毒性を抑制Hsp104の変異体が選択されている。これを行うには、Hsp104の変異体および疾患関連基板は、ΔHSP104酵母に同時形質転換される。我々は、野生型（WT）Hsp104の17の非存在下ではHsp104のシーケンススペースを探検する、ΔHSP104酵母を採用している。重要なことは、Hsp104のの削除は、酵母中のα-synの、FUS、またはTDP-43の毒性には影響しません、とHsp104のWTの発現は最小限の救助1,13,17を提供しています。酵母は、両方のタンパク質の発現を誘導するためにメディアを誘導する上でメッキされる。コロニーの疾患関連基板トリシン成長の毒性を抑えるHsp104の変異体を保有する酵母。コロニーを毒性型を抑制しない変異体を維持しながら、これらの変異体は、さらなる分析のために選択される。しかし、偽陽性は、この画面の大幅な問題である。 TDP-43、FUS、及びα-synの発現は、発現されているHsp104の変種とは無関係の毒性の自発的な遺伝的抑制の出現のための強力な選択圧を作成する、非常に有毒である。従って、我々はまた、これらの非特異的毒性サプレッサ17を除去するために比較的高いスループットで二次スクリーニングを使用している。この二次スクリーニングでは、選択された酵母をHsp104のプラスミド19ためのセレクト対抗する5-Fluorootic酸（5-FOA）で処理する。株は、基板の毒性はHsp104のプラスミドの喪失後に復元されることを保証するためにアッセイをスポッティングを介して基板（TDP-43、FUS、またはα-SYN）毒性について評価される。したがって、毒性がこの二次スクリーニングで復元された酵母は、おそらく、もともとHsp104の変異体の存在に起因する毒性の抑制を示した。これらの酵母は、「ヒット」として指定され、Hsp104のプラスミドは、その後でなければならない回収しHsp104の遺伝子17（ 図1）における変異を同定するために配列決定。任意のヒットは、その後独立して、突然変異を構築する部位特異的変異誘発を使用して、その後、毒性抑制のため再試験により再確認する必要があります。このプロトコルの潜在的なアプリケーションが広範である。これらの方法を用いて、タンパク質の任意のタイプのライブラリーは、酵母における毒性である任意の基質蛋白質の毒性を抑制する変異体についてスクリーニングすることができる。
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Protocol
1.ライブラリの生成
- ドメイン固有のエラープローンPCRを用いて、Hsp104ののライブラリーを構築するために、最初のエラーを起こしやすいDNAポリメラーゼ20で関心のあるドメインを増幅する。
- ゲル抽出によってPCR産物を精製する。
- 標準的な部位特異的突然変異誘発プロトコルを使用して、メガプライマー伸長工程を実行する：PCR緩衝液中の50 ngの鋳型プラスミド、250ngののメガプライマー、200μMのdNTP類、および高忠実度DNAポリメラーゼを結合し、そしてPCRグレードの水20との50μlの総容量まで希釈する。標準的なPCRプログラムを実行します。
注：使用される特定のプライマーは、増幅される遺伝子の特定領域に基づいて異なります。- PCRに続いて、37℃で2時間の1μl のDpn I制限酵素で親テンプレートDNAを消化する。
- ウルトラEにエレクトロポレーションまたは他の手段によってライブラリを変換する大腸菌は、ミニプレップによってそれを浄化し。
注：ライブラリ世代ほぼ所定の実験の目的に応じて変化する。 Hsp104のは、非常に大きなタンパク質であるので、私たちは、ドメイン固有のエラープローンPCRを利用した理由である全遺伝子を、ランダム化することは非現実的である。さらに、Hsp104のの構造は21に挑戦監督ライブラリの設計を行うこと、よくわかっていないままです。ライブラリは、唯一の制限は、テンプレートプラスミド骨格はデキストロース培地上で5-FOAの対抗選択を可能にするためにURA3遺伝子を含むべきであることであると共に、突然変異誘発またはランダムアプローチを用いて構築することができる。
Hsp104の図書館の2変容
- 標準酢酸リチウム/ PEG形質転換プロトコル22を使用してW303aΔのHSP104の酵母に疾患関連基板を統合します。単一のコロニーを選択して、基板23を関連する疾患の高い毒性を持つ菌株を分離するために、毒性のためにそれらを選別。
注：統合されたひずみとイソラを使用してくださいすべてのセルに等しい発現を確実にするために単一のコロニーをteの。 pAG416GALプラスミド（ウラシルマーカー）24 にウラシル以外の任意のマーカー（我々はヒスチジンを使用）と、Hsp104のライブラリ下にある遺伝子の組み込みを可能にするプラスミドに病気基板のクローンを作成。 5-FOAの対抗を可能にするために、ライブラリはウラシルマーカーとプラスミドから発現されていることを確認。他の酵母株を用いることもできる。我々は両方のWT及びΔHSP104背景 （MEJとJS、未発表の観察）にW303a及びBY4741酵母菌株を使用して同様の毒性抑制表現型を指摘している。 - 同じ酢酸リチウム/ PEG形質転換プロトコル22を使用して、この株にHsp104のライブラリを変換します。ライブラリーの配列スペースを維持するために、予測ライブラリーサイズを維持するために適切に変換をスケールアップ。
- 十分なプレートにを使用して非誘導、選択プレート（ 例えば 、SD-Hisを-URA）上でプレートを形質転換混合物を多数のコロニーの成長を確保する。必要なプレートの数を最小限にするために大規模なペトリ皿（150ミリメートル）を使用します。プレートを使用して形質転換体を回収すること形質転換効率を評価することができます。
- 並行してHsp104のWT及びベクトル陰性対照を変換します。
Proteotoxicityの抑制3.スクリーニング
- ラフィノース補足ドロップアウト媒体（ 例えば SRaff-のHis-裏）を使用して、プレートからコロニーを洗ってください。プレートからコロニーを緩めるために血清用ピペット及び滅菌木製のアプリケーターを使用してください。を50mlコニカルチューブボルテックス液体の洗浄を転送することは完全に任意の細胞塊を分離する。わずかに濁っ文化、OD 600〜0.025に希釈します。
注：ここにラフィノースは、このようにガラクトース媒介誘導のために細胞をプライミング、誘導のグルコース媒介抑制の細胞を緩和するのに役立つ。 - 3で振盪しながらラフィノースドロップアウト培地で一晩希釈した培養を育てる0ºC。並行してHsp104のWT及びベクトル制御を育てる。
- 翌朝、個々のガラクトース（ 例えば SGal-のHis-URA）プレート（400μlの総容量で1μlの2ミリリットルに濃縮した培養）の上に濃度の範囲をメッキ。広範囲の濃度をメッキすると、プレートは、単一のコロニーを持つことを保証します。実際に必要な濃度は、対象となる疾患基板の毒性に依存する。
- ライブラリのOD 600にベクトルとHsp104のWT培養を正常化し、コントロールとライブラリの相対的な成長を比較するために同じボリュームをプレート。
- 選択ストリンジェンシーを評価するために、メディアを（抑制）グルコース上のライブラリをめっきする。コロニーが（ 図2）が表示されるまで、30ºCで2〜3日間プレートをインキュベートする。得られたコロニーを評価し、コントロールに比較してください。
注：多くの場合、両方の大小のコロニーが得られたが、コロニーの大きさと行動の間には相関関係ivityが観察される。配列決定に持ち越さ偽陽性を最小限にするために5-FOAカウンタ選択技術（工程4）を使用して、これらの潜在的なヒットをスクリーニングする。
偽陽性を排除するために4. 5-FOA対抗とスポッティング
- ダブルとシングルドロップアウトメディアに重複して、単一のコロニー（ 例えば 、SD-Hisを-浦とSD-Hisのプレート）、30ºCで一晩成長して連勝。ベクトルとHsp104のWTコントロールを繰り返します。上にプレーティングSD-Hisの前に5-FOAは、それらが5-FOA上に播種されたとき、細胞がHsp104のプラスミドを失った可能性を増加させることによって、5-FOA工程の効率を高める。
- 5-FOA画面を行いながら、乾燥からプレートを防止するために、4ºCでパラフィルムや店舗で、SD-Hisを-浦のプレートをラップ。これらのプレートは、最終的に配列決定のために使用される。
- ストリークからコロニーのSD-Hisを5-FOAプレート上の単一コロニーにプレート（YPD培地+ 1グラム/ Lの5-FOA）と、＆30で1〜2日間インキュベート＃186; Cシングルコロニーが現れるまで。ここでは、5-FOAは、URA3遺伝子を含む細胞中の毒性産物（5-フルオロ）に変換される。このように、まだHsp104のプラスミドをどの細胞が死んでしまう。
- ストリークSD-浦とSD-Hisをプレート上に重複した5-FOAプレートから単一コロニー。それぞれについて、試験3のコロニーを各ヒットするための少なくとも一つのコロニーHsp104のプラスミドを失った可能性を高めるために打つ。 30℃で1〜2日間インキュベートする。 Hsp104のプラスミドを失ったコロニーは、SD-Hisのプレートではなく、SD-浦プレート上で増殖します。
- アッセイをスポッティングするためのHsp104のプラスミドを失った菌株を栽培。振とうしながら30ºCで一晩96ディープウェル2ミリリットルプレート中で（ 例えば SRaff-His）をラフィノースドロップアウト培地で飽和するまでの株を栽培。 5-FOA処理対照株を含めるようにしてください。
- アッセイをスポッティングするためのプレートを準備します。マルチチャンネルピ ペットを用いて、一定分量200μlのラフィノースドロップアウト媒体（ 例えば SRaff-His）のあたり96ウェルプレートのウェル、ニート培養の列1,7を予約する。アリコート列1およびプレートの7への16の飽和培養物の各々を250μl。
- シリアルにマルチチャンネルピペットで十分に混合し、プレートの各列に文化5倍に希釈する。各ウェルの最終容量は200μlであることを確認するために、列6および12から希釈した培養液50μlを削除します。これはさえスポッティング確保することが不可欠である。
- 96ボルトレプリケータツール（フロッガー）を使用して、SD-HisおよびSGal-彼のプレート上に重複しての文化を発見。 2-3日間30ºCでプレートをインキュベートする。
- コントロールと同様のSGal-Hisをプレート上に毒性を示す菌株の配列決定のために選択します。コントロールのように毒性がないなどの偽陽性株を捨てる。 5-FOAは、（自分自身でもしばしば有毒であるので、SD-Hisのプレートまたはその展示に単独の疾患基板よりも実質的に大きい毒性を成長欠損を示す菌株を破棄
5.コロニーPCRによってHsp104のバリアントの配列決定
- のPCRストリップチューブ中の3μlの20 mMのNaOH中のSD-Hisの-浦プレートから掻き〜10μlの酵母および凍結融解によって細胞を溶解。 10分間のサーマルサイクラーで99ºCでインキュベート、その後、10分間、または液体窒素中で-80ºCの冷凍庫にストリップチューブを置きます。のPCRグレードの水で100μlに菌株を希釈します。
- PCR反応の準備：5μlのPCRの鋳型、0.5μlの100μMの各プライマー、0.5μlの10mMのdNTPを、PCRバッファー中0.25μlのDNAポリメラーゼを、そしてPCRグレードの水で25μlの総体積に占める。デザインは、プライマーのどちらかの端にランダム化された地域に加えて、約100bpのを増幅する。増幅の成功の可能性を高めるために増幅された領域のサイズを最小限に抑えます。標準的なPCRプログラムを実行します。
- 適切なSIZのPCR産物の増幅を確認するためにアガロースゲル電気泳動によって試料を分析電子メール。何の製品が存在しない場合、PCRを繰り返します。
注：PCRの失敗は、典型的には、ステップ5.1で使用されすぎて、酵母に起因する。 - DNA配列決定のためのサンプルを準備します。そのようなエキソヌクレアーゼIおよびエビアルカリホスファターゼ酵素としてPCR精製またはPCR産物クリーンアップ試薬のいずれかを使用してPCRプライマーを除去する（ExoSAP-IT）は、一本鎖DNAを分解した。この試薬は、酵素的に、より高いスループットを可能にし、取り込まれていないプライマーおよびdNTPを分解する。
- PCR産物を配列決定する。徹底的に変異をシークエンスクロマトグラムを分析するようにしてください。多くの場合、複数のプラスミドを有する酵母として突然変異は、与えられた部位（ 図4）は 2つのヌクレオチドの混合物として観察され得る。
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Representative Results
私たちは、真ん中のドメインで無作為化Hsp104の変異体のライブラリーを構築し、TDP-43の毒性の抑制のためにそれをスクリーニングしている。ライブラリーは、形質転換され、画面のストリンジェンシーを評価するために、グルコースおよびガラクトースプレート（ 図2）上にプレーティングした。単一コロニーを選択した株は、カウンタHsp104のプラスミドを除去するために5-FOAを使用して選択した。これらの株は、その毒性はHsp104のバリアントなしで、TDP-43を単独によるものであった確認するために評価された。初期画面で選択された変異型のサブセットのスポッティングアッセイは、選択4コロニーの、2は1が偽陽性であった、Hsp104の媒介TDP-43の毒性抑制を表示し、1は5-FOA処理後強化された毒性を示すことを示した（ 図3）。 2真のヒットは、その後、中間ドメインの変異（ 図4）を識別するために、コロニーPCRにより配列決定した。これらの変異が同定されたら、Hsp104の変異を構築した新たに毒性抑制を確認するための部位特異的変異誘発による親のHsp104のプラスミド中。これらの方法を使用して、選択変異体は、後に、酵母中での凝集を抑制することが確認された生化学的ア ッセイで明らかに予め形成された凝集物、およびC.におけるドーパミン作動性神経変性を抑制するたPD 17のエレガンスモデル。
図1：増強Hsp104の変異体を単離するためのフローチャート Hsp104のライブラリ（URA3マーカー、GAL1プロモーター）が病気基板（HIS3マーカー、GAL1プロモーター）を含む酵母に形質転換し、誘導培地上でプレーティングすることにより毒性抑制についてスクリーニングされる。潜在的なヒットは、その後、非特異的毒性抑制を排除するために、5-FOAの対抗ステップを使用して再度スクリーニングする。この第二のステップで選択バリアントはその後コロニーPCRにより配列されている。 HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg"ターゲット= "_ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：pAG303GAL-TDP-43とpAG416GAL-Hsp104のライブラリで同時形質転換毒性サプレッサーのスクリーニング酵母はグルコース（抑制）またはガラクトース（誘導）培地上に播種した。 TDP-43は非常に有毒であるため、非常に少数のHsp104の変異体は、この毒性を抑制することが可能であり、この画面は非常に厳しい。 5-FOA二次スクリーニングのためのガラクトースプレートからヒットとして単一のコロニーを選択されています。両方の大小のコロニーは、一般的に得られるが、我々はコロニーサイズが活性と相関方法を指示どんな傾向を確認されていません。
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図3：Hsp104のプラスミドのための選択に対抗するために、5-FOAで処理された5-FOA二次スクリーニング酵母アッセイをスポットすることにより評価した。株は、SD-HisおよびSGal-Hisのプレートにシリアルに5倍に希釈し、SRaff-Hisの培地で増殖させ、かつ二重にスポットした。 Hsp104のA503Vは、我々が以前に検証され、単独のベクトル17と一緒にコントロールとして、ここで示してきた真のヒットである。行3および4は、Hsp104の抑制の喪失、以下のTDP-43の毒性を保持ライブラリのヒットです。行5は、TDP-43は、もはや有毒であり、偽陽性を示したため、非特異的毒性抑制が存在する。行6は、TDP-43よりも毒性がある菌株は、一般的に、おそらく、5-FOAの毒性に起因している示しています。この株はまだ配列決定することができたが、有効なヒットできない場合があります。
図4.アナル配列決定の結果yzing。選択された酵母は、多くの場合、複数のプラスミドが含まれています。したがって、コロニーPCR産物の配列決定以下、ケアはどの変異がクロマトグラムで見落とされていないように注意する必要があります。このクロマトグラムでは、（*で示される）二つの潜在的な変異が見落とされる可能性があります。第1の例ではA及びTと第で、TおよびCの混合物との混合物であり
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Discussion
ここでは、酵母proteinopathyモデルを用いた疾患関連基質の毒性を抑制増強Hsp104の変異体を単離するための我々のアプローチを提示します。このアプローチを用いて、変異体の大きなライブラリーは、唯一の制限は、5-FOA二次スクリーニングを渡すバリアントの数であると、高スループットでスクリーニングすることができる。 96ウェルフォーマットにこれらのステップを実行することにより、我々は日常的に1〜2週間かけて5-FOAの段階で一度に200安打をスクリーニング。最初のスクリーニング段階の間に得られたヒットの数が大幅に基板毒性および各特定のライブラリのメイクアップに依存して変化する。ヒットを配列決定するとプラスミドの混合物は、典型的には、各セル内に存在するので、慎重にすべての配列決定クロマトグラムを分析することが不可欠である。
私たちは時々 「ヒット」として隔離されてHsp104のWTの大きな割合を指摘している。これは、自発的な遺伝子の存在による可能性が高いサプレッサまたは非常に弱い活性。この問題を回避するために、我々は、高温（ 例えば 34℃）でスクリーニングすることを見出したHsp104のWTである「ヒット」の割合を減少させることができる。これは、独立して任意の新規変異体の活性を評価するために、プラスミドの純度を保証するために、任意の配列決定されたヒットをクローンし直すことも不可欠である。新しいヒットが識別されると、それらは酵母に凝集の抑制について評価し、生化学的に特徴づけることができる。
私たちは、Hsp104のはTDP-43、FUS、αシヌクレインに対する変種増強隔離するために、これらのメソッドを使用し、純粋なタンパク質生化学アッセイ17を使用してそれらの活性を確認した。最終的に、これらの方法は、酵母中で毒性である関心のある任意の基質に対してタンパク質ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
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