O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nematóides entomopatogênicos (EPN) (Steinernematidae e Heterorhabditidae) têm uma parceria de mutualismo com Gram-negativo proteobactérias gama da família Enterobacteriaceae bactérias. Xenorhabdus estão associados com steinernematids nematóides enquanto Photorhabdus são simbiontes de heterorhabditids. Juntos nemátodos e bactérias formam um complexo insecticida potente que mata uma ampla gama de espécies de insectos numa íntima e específica. Aqui, demonstramos in vivo e in vitro de técnicas vulgarmente utilizadas na criação desses nemátodos em condições de laboratório. Além disso, estas técnicas representam passos fundamentais para o sucesso da criação culturas EPN e também servir de base para outros bioensaios que utilizam esses organismos de investigação. A produção de aposymbiotic nematóides (free-simbiontes) muitas vezes é fundamental para uma profunda e abordagem multifacetada para o estudo da simbiose. Esteprotocolo não requer a adição de antibióticos e pode ser realizada num curto período de tempo com equipamento de laboratório standard. Nemátodos produzidos deste modo são relativamente robusta, embora a sua sobrevivência na armazenagem pode variar dependendo da espécie utilizada. As técnicas detalhadas nesta apresentação correspondem aos descritos por vários autores e refinado pelo Laboratório de P. da Universidade do Arizona (Tucson, AZ, EUA). Estas técnicas são distintas do corpo de técnicas que são utilizadas na produção em massa destes organismos para fins de gestão de pragas.
Introdução
Nematóides entomopatogênicos (EPN) Steinernema e Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) e suas bactérias simbiontes, Xenorhabdus e Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) são considerados um modelo emergente de animal terrestre-micróbio relações simbióticas 2-4,6,10,19. Xenorhabdus e Photorhabdus spp. são abrigados como simbiontes no intestino da única etapa de vida livre dos nematóides, também conhecido como o juvenil infecciosa (IJ) ou 3a etapa infecciosa juvenil 8,10,13. O par bactéria nematóide é patogênico para uma ampla gama de insetos e tem sido implementad....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. vivo criação de Nematóides entomopatogênicos com suas bactérias Symboitic
- Inverta a 100 x 15 mm de plástico placa de Petri e colocar dois discos de papel de filtro (90 mm) na tampa da cápsula.
- Distribuir uniformemente 1 ml da suspensão de água IJ (juvenis infectantes) (a uma concentração de 1000-2000 IJ / ml) no papel de filtro.
NOTA: IJs não precisa ser esterilizada por superfície. - Adicionar 10 último larvas do maior mellonella waxmoth Galleria para o prato. O objetivo é fornecer cerca de 100-200 IJs / larva.
- Cobrir a tampa com a parte inferior da placa de Petri (Figura 1)....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O método in vivo criação usa insetos vivos como hospedeiros para o crescimento e reprodução do nematóide. Câmaras de infecção são um método eficiente para expor insetos IJs. Esta é a única etapa no ciclo de vida dos nematóides que os vetores de bactérias simbiontes de um inseto hospedeiro para outro. Figura 1 mostra a configuração para uma câmara de infecção, bem como os materiais necessários para construir esta câmara. In vitro métodos de criação permitir EPN a crescer sem um insecto .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Usando um hospedeiro adequado é um fator chave para o sucesso na criação vivo da EPN. Normalmente, ambos os steinernematids e heterorhabditids podem se reproduzir e concluir com êxito o ciclo de vida das larvas da traça da cera, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). No entanto, outras espécies de insetos de diferentes famílias e / ou encomendas podem ser considerados. Algumas das espécies nematóides actualmente descritos são conhecidos por ter especificidade para um hospedeiro insecto .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do Banco de laboratório: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson e Sam-Kyu Kim por suas contribuições para a melhoria de muitos destes protocolos. Este trabalho foi financiado em parte pela concessão da National Science Foundation IOS-0840932 e 0724978 para IOS-SP da
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Para In vivo Infecções | |||
| 100 x 15 Placas de Petri | VWR | 25384-088 | |
| Papel de filtro, 9 cm de celulose de grau 1 | Whatman/VWR | 28450-081 | Papel de filtro de grau 1 recomendado |
| Hospedeiros de insetos | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella são recommended |
| Para ágar-fígado-rim (para 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Placas de Petri | VWR | 25384-092 | |
| Fígado bovino, 50 g | De origem local; talho ou supermercado | O restante pode ser armazenado congelado e descongelado para uso futuro | |
| Rim bovino, 50 g | De origem local; açougueiro ou supermercado | O restante pode ser armazenado congelado e descongelado para uso futuro | |
| Cloreto de sódio 2,5 g (concentração final de 0,5%) | Acros/VWR | 200002-434 | pode ser usado qualquer NaCl de grau de pesquisa pode ser usado |
| Ágar, 7,5 g (ágar 1,5%, concentração final) | HiMedia/VWR | 95026-642 | qualquer ágar de grau de mídia pode ser usado |
| 500 ml destilado H2O | |||
| Para ágar lipídico (para 1 L) | |||
| 100 x 15 placas de Petri | VWR | 25384-088 | |
| Caldo nutritivo, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Extrato de levedura, 5 g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Cloreto de magnésio hexahidratado 10 ml (0,2 g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Óleo de milho, 4 ml | Qualquer marca | Fonte local; supermercado | Qualquer marca de óleo de milho pode ser usada |
| Xarope de milho, 96 ml combine 7 ml de xarope de milho em 89 ml de H2O aquecido e agite para homogeneidade | Karo | de origem local; ágar de supermercado | |
| , 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | qualquer ágar de grau de mídia pode ser usado |
| 2O destilado, 890 ml |
Referências
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
